Abstract
واحدة من الملاحظات الأكثر محفزة في تطور النبات هو وجود علاقة بين حدوث المجال المغنطيسي الأرضي (GMF) انتكاسات (أو الرحلات) ولحظة الإشعاع من كاسيات البذور. وأدى ذلك إلى الفرضية القائلة بأن التغيرات في GMF القطبية قد تلعب دورا في تطور النبات. هنا، نحن تصف طريقة لاختبار هذه الفرضية من خلال تعريض thaliana نبات الأرابيدوبسيس لعكس مصطنع الظروف GMF. استخدمنا المغنطيسية ثلاثة محاور واستخدمت البيانات التي تم جمعها لحساب حجم GMF. تم ربط ثلاثة إمدادات الطاقة DC إلى ثلاثة أزواج هيلمهولتز لفائف وكان يسيطر عليها جهاز كمبيوتر لتغيير الظروف GMF. تعرض النباتات التي تزرع في لوحات بيتري إلى العادية وعكس الظروف GMF. وأجريت أيضا تجارب التعرض الشام. تم تصوير النباتات المعرضة أثناء التجربة، وتم تحليل الصور لحساب طول الجذر والمناطق ورقة. تم استخراج نبات الأرابيدوبسيس مجموع RNA والكميأجريت الوقت-PCR الحقيقي (QPCR) التحليلات على التعبير الجيني من CRUCIFERIN 3 (CRU3)، protein1 النقل النحاس (COTP1)، الأكسدة والاختزال مجيب النسخ Factor1 (RRTF1)، الحديد فوق الأكسيد الأكسيد 1، (FSD1)، Catalase3 (CAT3)، Thylakoidal أسكوربات البيروكسيد (TAPX)، وأسكوربات عصاري خلوي Peroxidase1 (APX1)، وNADPH / التنفسي البروتين انفجار أوكسيديز D (RbohD). وقد تم تحليل أربع جينات مرجعية مختلفة لتطبيع نتائج QPCR. وقد تم اختيار أفضل الجينات الأربعة، وكان يستخدم في الجينات الأكثر استقرارا للتطبيع. وتشير البيانات المتوفرة لدينا لأول مرة أن عكس القطبية GMF باستخدام لفائف triaxial له تأثيرات كبيرة على نمو النبات والتعبير الجيني. وهذا يدعم فرضية أن يساهم GMF انعكاس لإحداث تغييرات في التنمية النباتية التي قد تبرر الضغط العالي انتقائية، مما يؤدي في النهاية إلى pتطور LANT.
Introduction
المجال المغناطيسي للأرض (أو مكافئ المجال المغنطيسي الأرضي، GMF) هو العامل البيئي لا مفر منه لجميع الكائنات الحية على كوكب الأرض، بما في ذلك النباتات. كانت GMF دائما سمة طبيعية من الأرض، وذلك أثناء التطور، شهدت جميع الكائنات الحية عملها. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تظهر أن GMF غير قادرة على التأثير على العديد من العمليات البيولوجية 1. وGMF ليست موحدة وهناك اختلافات محلية كبيرة في حجمها واتجاهها على سطح الأرض. وGMF على سطح الأرض يظهر مجموعة واسعة من المقادير، تتراوح بين أقل من 30 μT إلى ما يقرب من 70 μT. وGMF يحمي الأرض والمحيط الحيوي لها من آثار قاتلة من الرياح الشمسية من خلال تشتيت معظم جسيمات مشحونة من خلال المغنطيسي 2.
النباتات تستجيب للمؤثرات البيئية؛ والاستجابات الكلاسيكية إلى العوامل البيئية، مثل الضوء والجاذبية كانت روصف horoughly عن طريق تحديد ما يسمى الردود موجه ضوئيا وgravitropic. القليل جدا، أو لا شيء، كما هو معروف على آليات الإدراك وردود محطات للمجالات المغناطيسية، على الرغم من كثرة الأبحاث المنشورة حول هذا الموضوع، ومؤخرا استعرض 1. وخلافا للمجال الجاذبية، غيرت GMF باستمرار خلال تطور النبات مما يمثل عامل ضغط أحيائية الهامة التي تم النظر فيها مؤخرا قوة دافعة المحتملة في نهاية المطاف المساهمة في زرع التنويع وأنواع جديدة 2. انتكاسات المغناطيسية الأرضية (أو الرحلات) هي التغيرات في قطبية GMF. خلال تاريخ الحياة على الأرض، وقعت انتكاسات GMF عدة مرات. هذه يتعرض كوكب الأرض لفترات اضمحلال قوة GMF خلال كل الانتقال القطبية. وقد افترض بعض الكتاب أن هذه التحولات فترات انخفاض قوة GMF قد سمحت الإشعاع المؤين من الرياح الشمسية للوصول إلى سطح الأرض، وبالتالي حفزالإجهاد ثابت للكائنات الحية، التي كان يمكن أن تكون قوية بما يكفي لإحداث تغيرات الجينات مما يؤدي في النهاية إلى زرع تطور 2.
ويظهر تحليل مفصل للتجارب تصف آثار الحقول المغناطيسية على النباتات عددا كبيرا من التقارير المتضاربة، التي تتميز قلة آليات التفاعل الفيزيائية الحيوية المعقولة. العديد من التجارب هي ببساطة غير واقعية، فيما يفتقر آخرون فرضية قابلة للاختبار، وفي نهاية المطاف، غير مقنعة 3. على مدى السنوات الماضية، وقد استعرضت التقدم ومركز الأبحاث على تأثير المجالات المغناطيسية على محطة 2،4-11. في الآونة الأخيرة، وتأثير كل من المجال المغناطيسي المنخفضة والعالية قد نوقشت باستفاضة 1، مع التركيز بشكل خاص على إشراك الأحداث انعكاس GMF على تطور النبات 2.
أكثر الوسائل المباشرة لإثبات فرضية أن الانتكاسات GMF تؤثر على تطور المصنع هو لتجميع GMFانعكاس في المختبر عن طريق اختبار استجابة النباتات للظروف الحقل المغناطيسي طبيعية وعكسه. لاختبار هذه الفرضية، وبالتالي فإننا بنينا مثمنة هيلمهولتز لفائف أزواج المجال المغناطيسي نظام التعويض triaxial (لفائف triaxial)، التي هي قادرة على عكس بدقة الظروف GMF العادية.
كنا نبات الأرابيدوبسيس thaliana كما مصنع نموذج ونحن اختبار تأثير عكس GMF على التعبير الجيني لبعض الجينات الهامة: CRUCIFERIN 3 (CRU3)، الذي يشفر بروتين تخزين 12S البذور التي هي التيروزين مفسفر والتضمين الدولة الفسفرة في الرد لABA في بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana 12،13. النقل Protein1 النحاس (COTP1)، الذي يشفر بروتين الفصيلة نقل المعادن الثقيلة / إزالة السموم مع وظيفة السائدة في التربة اقتناء النحاس والتنمية حبوب اللقاح 14؛ والأكسدة والاختزال مجيب النسخ Factor1 (RRTF1)،الذي يشفر عضوا في ERF (عامل استجابة الإثيلين) فصيلة B-3 من ERF / AP2 عامل النسخ الأسرة الذي يحتوي على نطاق AP2 التي تسهل التآزر شارك في تفعيل الجينات مسارات التعبير ومنح التسامح عبر لالحيوي وغير الحيوي يؤكد 15.
وعلاوة على ذلك نحن أيضا بتحليل خمس جينات لها دور في استجابات التوتر التأكسدي: الحديد فوق الأكسيد Dismutase1، (FSD1)، الذي يشفر انزيم حشوية أن إنزيمي وبسرعة تحويل أنيون الفائق (O 2 -) والماء (H 2 O) لبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) والأكسجين الجزيئي (O 2) 16؛ Catalase3 (CAT3)، أن الذي يشفر والإنزيم الذي يحفز انهيار H 2 O 2 في الماء والأكسجين 17،18؛ Thylakoidal أسكوربات البيروكسيد (TAPX)، الذي يشفر الغلوثانيون الثايلاكويد البلاستيدات الخضراء التي يقتات H 2 O2 19، أسكوربات Peroxidase1 (APX1)، الذي يشفر الغلوثانيون عصاري خلوي أن يقتات H 2 O 2 وتمثل أحد الأهداف المحتملة لمرحلة ما بعد التعديلات متعدية بوساطة الجزيئات NO المشتقة 20؛ وNADPH- التنفسي البروتين انفجار أوكسيديز D (RbohD) الذي يشفر وهو الانزيم الذي يولد O 2 - ويلعب دورا محوريا في تنظيم النمو والتنمية واستجابات التوتر في نبات الأرابيدوبسيس 21.
توفر لدينا منهجية ميدانية عكس أول دليل على أن GMF انعكاس يمكن أن تحدث تغييرا كبيرا في التشكل والتعبير الجيني من A. الجذور والبراعم thaliana. يوفر هذا البروتوكول طريقة مبتكرة لتقييم تأثير GMF انعكاس على مورفولوجيا النبات والتعبير الجيني، ويمكن استخدامها لتقييم الأثر المحتمل للGMF انعكاس على جوانب أخرى من السلوك النبات، وبالتالي توجيه مناقشة ريال عمانيلو من GMF انعكاس على تطور النبات.
Protocol
1. إعداد لفائف Triaxial
ويبين الشكل 1 فائف triaxial تستخدم لعكس GMF: ملاحظة.
- بدوره على المغنطيسية ثلاثة محاور، التي يتم إدراجها في ملفات triaxial التحقيق.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وإطلاق برنامج المغنطيسية التي تسمح البيانات التي يتم جمعها من ثلاثة محاور المغنطيسية.
- استخدام القيم مكون أفاد به المغنطيسية لحساب حجم GMF. على سبيل المثال، مع القيم المغنطيسية: عاشرا = 6.39 μT، بواسطة = 36.08 μT، بيسة = 20.40 μT حساب شدة المجال من 41.94 μT باستخدام المعادلة التالية: B = B GMF + B إضافي، حيث B إضافي = (عاشرا 2 + بنسبة 2 + 2 بيسة) ½ (أي 41.9 μT في المثال).
- بدوره على إمدادات الطاقة ثلاثة DC (المدى مزدوج: 0-8V / 5A و0-20V / 2.5A، 50W) كل واحد متصل إلى ثلاثة couplوفاق لفائف هيلمهولتز وصله بجهاز الكمبيوتر عبر وصلة GPIB (الشكل 1B).
- تعيين الفولتية من امدادات الطاقة لتوليد المجال المغناطيسي المطلوب مع متجه المجال المغناطيسي عكسه. على سبيل المثال، مع B GMF كما في الخطوة 1.3 و مع حجم الملف لأجهزة القياس وصفها هنا، ضبط الفولتية لV X = 0.00 V، V ص = 30.52 V، V ض = 0.00 V لتوليد الناتجة جديدة B = B + B GMF لفائف triaxial = (6.38، -36.08، 20.39) μT. أي حقل جديد مع نفس حجم B GMF ولكن يشير إلى اتجاه مختلف.
- التحقق من الحقل الجديد مع البرنامج المغنطيسية باستخدام الإجراء الموضح في 1.3.
- فضح النباتات العادية وعكس الظروف GMF باستخدام لوحات بيتري كما هو موضح في القسم 2.
- إجراء تجارب التعرض صورية عن طريق الحفاظ على حجم الحقل يساوي | B GMF | وحفظالمكون الرأسي للمجال مساوية لتلك التي من GMF لكن تغيير الاتجاه (أي، "الشمالية، الشرق أو الغرب") المكون الأفقي الميدان مع التيارات على قدم المساواة في لفائف triaxial بالمقارنة مع حالة انعكاس المجال. القيام بذلك عن طريق تغيير الجهد للملفات كما هو موضح في 1.5.
ملاحظة: قواعد هذا التعرض الشام من التدفئة خفية المحتملة أو آثار الذبذبات إما من لفائف أنفسهم أو من الالكترونيات المستخدمة للسيطرة على لفائف. - تشغيل التجارب مزدوجة التعمية عن طريق تطبيق الظروف الميدانية أعمى من الموظفين الذين يؤدون ما تبقى من التجارب و / أو تفسير البيانات.
2. إعداد المواد النباتية والظروف لنمو النبات
- استخدام بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana، نوع إيكولوجي كولومبيا 0 (العقيد 0)، ثم وضع في أنبوب 1.5 مل وتعقيم السطح عن طريق العلاج مع 5٪ (وزن / حجم) محلول هيبوكلوريت الكالسيوم و 0.02٪ (V / V) تريتون X-100 في 80٪ من الإيثانول (ETOH)، لمدة 10-12 دقيقة في 25-28 درجة مئوية، مع الهز المستمر. ثم شطف مرتين مع 80٪ ETOH، ويغسل مع 100٪ ETOH وشطف أخيرا مع الماء المقطر المعقم.
- إعداد 1 L من Murashige وسكوغ 22 (MS) المعدلة المتوسطة عن طريق إضافة: 2.297 غرام من MS (0.5 X MS بصل ملح خليط)، 10 غرام السكروز والماء منزوع الأيونات إلى 1 L، ودرجة الحموضة 5،8-6،0 تعديلها مع KOH. إضافة 16 غراما من أجار والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة، 120 ° C.
- قبل التصلب، صب 80 مل من المتوسط في كل (120 × 120 مم 2) مربع لوحات بيتري. زرع بذور معقمة والثلاثين على لوحة، ثم ختم لوحات مع فيلم شمعي.
- Vernalize لوحات أفقيا في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام إلى تحفيز ومزامنة الإنبات، ثم تعرض لوحات بيتري إما عادية أو عكس GMF.
- فضح البذور في بيئة تسيطر عليها المناخ في 22 ° C في وضع عمودي في تجارب موازية داخل لفائف triaxial وخارج لفائف triaxialفي إطار الجدول الزمني الضوئية من 8 ساعات الظلام وضوء 16 ساعة، وذلك باستخدام مصابيح بخار الصوديوم (220 × 10 -6 E م -2 ث -1). استخدام فيلم الجيلاتين الأزرق لتسليط الضوء على تخفيض المكون أحمر المصابيح.
- فضح النباتات لمدة 10 يوما قبل استخراج الحمض النووي الريبي لكلا العادية (السيطرة) وعكس (العلاج) شروط GMF.
- بعد التعرض، والتقاط صور لأطباق بتري.
- استخدام البرمجيات يماغيج لحساب المناطق طول الجذور والأوراق.
- لفترة وجيزة، وقياس الجانب من لوحة بيتري، ثم فتح الصورة من لوحة بيتري وباستخدام الخيار "الثابت" خط رسم الخط الذي يعبر بالضبط الجانب اللوحة.
- في القائمة "تحليل" اختار "أعد مقياس" وإدراج المسافة الفعلية في مربع "المسافة المعروف" (على سبيل المثال، 120 ملم)، ثم أدخل وحدة الطول (مم)؛ أخيرا انقر فوق الخيار "العالمي" لجعل إعدادات متاحة لجميع القياسات.
- لروتي طول، اتبع بعناية على شكل الجذر باستخدام أداة الكتابة بخط اليد. قياس طول باستخدام "تدبير" الخيار في القائمة "تحليل". الاستمرار في قياس كل جذور في الصورة وحفظ الملف لمزيد من التحليلات الإحصائية.
- لمساحة الورقة، من قائمة "صورة" استخدام ضبط الخيار ثم "عتبة اللون". حدد ورقة الفردية والقائمة "تحليل" تحديد "تحليل الجزيئات". حفظ القياسات الفردية للالتحليلات الإحصائية.
3. نبات الأرابيدوبسيس إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي، الكمي في الوقت الحقيقي-PCR (QPCR) شروط التفاعل والاشعال للنبات الأرابيدوبسيس
- جمع حدة 30 براعم و 30 جذور وتجميد فورا في النيتروجين السائل. ثم تطحن في النيتروجين السائل مع هاون ومدقة.
- عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام طقم تنقية وريبونوكلياز خالية من مجموعة العلاج الدناز باستخدام إنتاج موادتعليمات إيه في.
- والتحقق من جودة عينة وكمية باستخدام عدة RNA نانو وهلام الشعرية الكهربائي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تأكيد الكمي من الحمض النووي الريبي طيفيا.
- استخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع والاشعال عشوائية باستخدام أدوات كدنا] عكس النسخ الحصول على cDNAs حبلا الأولى وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
- أداء جميع التجارب على النظام في الوقت الحقيقي باستخدام SYBR الأخضر I مع ROX كمعيار تحميل الداخلي.
- أداء التفاعل مع 25 ميكرولتر من خليط يتكون من 12.5 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر QPCR ميكس ماجستير، 0.5 ميكرولتر من [كدنا و 100 كبسولة تفجير نانومتر. استخدام الاشعال المدرجة في الجدول 1. وتشمل الضوابط ضوابط غير RT (باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع دون النسخ العكسي لمراقبة التلوث الجيني DNA) والضوابط غير القالب (الماء بدلا من القالب).
- حساب الكفاءة التمهيدي لجميع الاشعال أزواج باستخدام معيارطريقة منحنى 23.
- استخدام PCR الشروط التالية: CRU3، COTP1، RRTF1. 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و 40 دورات من 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 30 ثانية في 58 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 ° C؛ UBP6، eEF1Balpha2، ACT1، GAPC2، CAT3، TAPX، APX1، RbohD، FeSOD1 10 دقيقة في 95 ° C، 40 دورات من 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 20 ثانية في 57 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 ° C.
- قراءة مضان بعد كل مرحلة الصلب والإرشاد. لجميع أشواط، إجراء تحليل منحنى ذوبان 55-95 ° C كتبها بما في ذلك الجزء التفكك في ملف الحرارية. استخدام شاشة منحنى تفارق، الوصول إليها من خلال علامة التبويب النتائج لعرض الملف الشخصي تفارق (مؤامرة من مضان بوصفها وظيفة من درجة الحرارة). ضمان أن يتم اختيار مجموعة البيانات التي تم جمعها خلال الجزء التفكك من التجربة للتحليل باستخدام شاشة تحليل / الإعداد.
- تحديد لترمجموعة inear التركيز القالب إلى عتبة قيمة دورة (قيمة ط م) من خلال إجراء سلسلة التخفيف عشرة أضعاف (1- 3 إلى 10 أضعاف) باستخدام كدنا] من ثلاثة الاستخراج RNA مستقلة تحليلها في ثلاثة مكررات الفنية 24،25.
- تحليل جميع المؤامرات التضخيم مع الوقت الحقيقي البرمجيات PCR أداة للحصول على القيم ط. معايرة وتطبيع مستويات RNA النسبية مع مستوى أفضل الجينات التدبير المنزلي النحو التالي: 3.11.1) الوصول إلى التضخيم شاشة المؤامرات من خلال علامة التبويب النتائج، حدد منحدر أو الهضبة التي ينبغي تحليل البيانات باستخدام الشاشة / إعداد تحليل التحديد، ثم حدد DRN (تصحيح خط الأساس مضان تطبيع) من القائمة الإسفار على لوحة القيادة. الوصول إلى لوحة الشاشة نموذج القيم من خلال علامة التبويب نتائج لعرضه القيم ط م لآبار العينة.
- استخدام أربعة جينات مرجعية مختلفة [على سبيل المثال، حشوية نازعة غليسيرألدهيد-3-الفوسفات، (GAPC2)، بتحول specifجيم البروتيني 6 (UBP6)، Actin1 (ACT1)، وعامل استطالة 1B ألفا فرعية 2 (eEF1Balpha2)] لتطبيع نتائج في الوقت الحقيقي PCR. حدد أعلى في المرتبة الجينات باستخدام برامج التحليل 26؛ واستخدام الجينات الأكثر استقرارا للتطبيع.
- لفترة وجيزة، وتنظيم إدخال البيانات على ورقة Excel مع العمود الأول الذي يحتوي على أسماء الجينات والصف الأول يحتوي على أسماء العينة. ثم حدد برامج التحليل من القائمة شريط. استخدم مربع الحوار لتحديد البيانات المدخلة.
- بعد ذلك، تحقق من حقول نموذج أسماء، أسماء الجينات والمخرجات بسيط فقط. انقر على زر العودة لإجراء التحليل. حدد أعلى في المرتبة الجينات (التي لديها أصغر قيمة الاستقرار) كما الجين مرشح أعرب معظم ثابت.
- بيانات المؤامرة التي تبين تغير التعبير التفاضلية أضعاف في كل من يطلق النار على والجذور.
4. التحليلات الإحصائية
- التعبير عن البيانات كما القيم يعني ± الخطأ المعياري. مقارنة المشتركntrol ومجموعات العلاج عن طريق إجراء تحليل التباين (ANOVA) واختبار توكي مع Bonferroni ودان-Sidak اختبار احتمال المعدل (0.95٪ الثقة).
Representative Results
والهدف من هذا البروتوكول هو توفير وسيلة لتقييم ما إذا كان عكس المجال المغنطيسي الأرضي (GMF) قد تؤثر على نمو النبات والتعبير الجيني للنبات الأرابيدوبسيس thaliana نوع إيكولوجي العقيد 0. لفائف Triaxial كما هو مبين في الشكل 1A تستخدم لعكس GMF عندما مجموعة مع الفولتية محرك المناسبة (الشكل 1B)، التي تم الحصول عليها كما هو موضح في الخطوة 1.5 في البروتوكول. أبعاد لفائف triaxial هي ~ 2 × 2 × 2 م 3، والذي يسمح مساحة كافية مع الظروف GMF عكس لاستضافة العديد من لوحات بيتري. وقد نمت الضوابط في نفس الظروف البيئية والقيم في GMF العادية. بعد 10 يوما من التعرض إلى وضعها الطبيعي وعكس الظروف GMF، أظهرت النمط الظاهري للنباتات التعديلات الشكلية الواضحة. وأظهرت محطات التحكم (أي، ونمت في الظروف العادية GMF) كما هو مبين في الشكل 2 أطوال الجذر مع كبير (دن-Sidak وBonferroni المعدل إختصار لكلمة غالبا <0.001؛ر الطالب = 10.68، DF = 31) القيم العليا (29.41 ملم، SEM = 1.04؛ N = 32) فيما يتعلق النباتات المعرضة لعكس GMF (17.53 ملم، SEM = 0.58؛ N = 36). في محطات GMF عكس، تم تغيير التشكل من يطلق النار أيضا بإظهار تطور تخفيض التوسع النشرة. وأظهرت النباتات المعرضة لظروف طبيعية بمتوسط مساحة الورقة من 4.95 مم 2 (SEM 0.025، N = 54)، في حين أن النباتات المعرضة لظروف GMF عكس أظهرت بشكل ملحوظ (دن-Sidak وBonferroni المعدل إختصار لكلمة غالبا = <0.001؛ ر الطالب = 31.32، DF = 53) انخفاض قيم ورقة منطقة (3.71 مم 2، SEM = 0.032؛ N = 54). لذلك، تعرض نبات الأرابيدوبسيس لظروف GMF عكس يسببها انخفاض في كل من طول الجذور والأوراق.
توسيع ورقة ونمو الجذور تعتمد على كل من الانقسام واستطالة الخلايا 27. لذلك، تطوير المصنع والإنتاجية واللياقة البدنية الشاملة التي تعتمد على shoot- والجذر بنية النظام الأمثل <سوب> 28. انخفاض طول الجذر ورقة حجم النباتات المعرضة لظروف GMF عكس تشير إلى وجود نظام الاستشعار قادرة على إدراك الاختلافات في شدة المجال المغناطيسي ليس فقط، ولكن أيضا للرد على التغيرات في المجال المغناطيسي "الاتجاه" مقارنة مع الجاذبية. الفرضية القائلة بأن GMF عكس قد تؤثر على نمو النبات وجدت أدلة دامغة في تجاربنا، التي تبين أن الظروف عكس GMF يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على تطوير المصنع.
وقد رافق التغيرات المورفولوجية أيضا بالتغيرات في التعبير الجيني. بين الجينات التدبير المنزلي، وكان الجينات الأكثر استقرارا استطالة عامل 1B ألفا فرعية (2). وأظهرت المجموعة الأولى من الجينات (CRU3، COTP1، RRTF1) لتغيير جذري في التعبير الجيني (الشكل 3). تبادل لاطلاق النار التعبير لجميع الجينات الثلاثة وزادت بشكل ملحوظ (P <0.05) بنحو 2.5 أضعاف في النباتات المعرضة للاحتياطيشروط GMF د. وupregulated التعبير الجذرية للCRU3 في الجذور في النباتات المعرضة لظروف GMF العادية، ولكن كان معنويا (P <0.05) downregulated في ظروف GMF عكسه. تم العثور على العكس لCOTP1 وRRTF1، والتي كانت downregulated في الظروف العادية وupregulated بحضور GMF عكس (الشكل 3).
Cruciferin (أ الجلوبيولين 12 S) هو بروتين التخزين الأكثر وفرة في بذور A. يتم تصنيعه thaliana وcrucifers الأخرى، وتمهيدا في الشبكة الإندوبلازمية الخشنة. ثم يتم نقلها إلى فجوات تخزين البروتين 13. الشتلات إنبات يتطلب انهيار cruciferin، والذي يستخدم كمصدر أولي للنيتروجين. أسفل تنظيم cruciferin تدهور يقلل تطوير الأجنة عن طريق إضعاف هياكل الخلية أو مكونات الخلية تنمية 29،30. نتائجنا تظهر ان upregulation من CRU3 يرتبطأقل التوسع ورقة وطول الجذر مخفضة، مما يشير إلى أن هذا الجين في حساسية لGMF عكس وأن overexpression لها يمكن أن تسهم في الحد من تطور النبات. وعلاوة على ذلك، GMF عكس يؤدي الى downregulation كبير من CRU3 في الجذور، والذي يرتبط مع طول الجذر مخفضة. النحاس هو العامل المساعد الضروري للعمليات الرئيسية في النباتات، ولكنه يمارس تأثيرات ضارة عندما يزيد؛ وبالتالي، overexpressing النقل النحاس يقوض نمو النبات. كان تأثير GMF انعكاس لoverexpression كبير من COTP1 في كل من يطلق النار على والجذور، وهو ما يفسر لنمو النبات مخفضة. أيون الإجهاد يضعف الأيض بلاستيدات الخضراء، التي ترتبط ارتباطا وثيقا الدولة الأكسدة للخلية. في نبات الأرابيدوبسيس عامل النسخ وRRTF1 أمر مهم للتعبير عن الجينات المرتبطة بالقدرة على التكيف مع التغيرات الأكسدة 31. لذلك، عندما تتعرض النباتات للمؤثرات الخارجية قادرة على تغيير تنميتها والفسيولوجيةبرامج آل يتوقع أحد overexpression من هذا عامل النسخ المهم. عكس GMF يتسبب في overexpression كبير من RRTF1 في كل من يطلق النار على والجذور، مما يدل على استجابات التوتر التأكسدي أعلى من النباتات لظروف GMF عكسه.
ويتم الحصول على نتائج مثيرة للاهتمام عن طريق تحليل الجينات الخمس المعنية في الاكسدة. بشكل عام، لم كل الجينات المستخرجة وتحليلها في براعم لم تظهر فروق ذات دلالة إحصائية (P> 0.05) عندما كانت تزرع النباتات في الحالات العادية أو عكس الظروف GMF (الشكل 4 والشكل 5). ومع ذلك، لوحظ وجود أسفل تنظيم كبير دائما في جذور النباتات المعرضة لظروف GMF عكسه. على وجه الخصوص، أظهر CAT3 أعلى downregulation (الشكل 5)، وجاء في الترتيب من حيث downregulation من قبل APX1، FSD1، RBOHD وTAPX (الشكل 4).
التسامح عبر ل يتم توفير الإجهاد الحيوية والحيوية من خلال تفعيل الجينات المختلفة المشاركة في العديد من المسارات البيوكيميائية. RRTF1 عامل النسخ يسهل التآزر شارك في تفعيل الجينات من هذه المسارات 15،31، ويمكن أن يحتمل أن تشارك في الاكسدة 32. لذلك، من المتوقع عندما يتم خفض الكسح الأكسجين upregulation من RRTF1. Downregulation من الجذر الانزيمات الكسح يرتبط مع upregulation من RRTF1، الذي يعمل في استجابة لزيادة الاكسدة. وdownregulation الجذر الكبير في CAT3، APX1 وTAPX يشير إلى انخفاض قدرة خلايا الجذر إلى كنس H 2 O 2، الذي يرافقه انخفاض القدرة على dismutate أنيون الفائق التي كتبها downregulation من FSD1. ردود الاكسدة هي أعلى في الجذور، والتي يبدو أن الموقع الرئيسي لعكس GMF التصور.
جنرال الكتريك = "دائما"> 
الشكل 1. الجيومغنطيسية نظام التعويض المجال. (A) لفائف triaxial (يتألف من زوج من لفائف مثمنة لكل من ثلاثة محاور متعامدة) تستخدم لعكس متجه المجال المغنطيسي الأرضي. تم توصيل (B) امدادات الطاقة الكمبيوتر التي تسيطر عليها إلى كل زوج من لفائف هيلمهولتز. (الفولتية في هذه الأرقام التعسفية) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تأثير انعكاس المجال المغنطيسي الأرضي على نبات الأرابيدوبسيس التشكل. بعد عشرة أيام من التعرض، ومحطات التحكم (أي تلك التي تتعرض لظروف GMF العادية) تظهر طول الجذر أكبر بكثير وأكثر EXPANمنشورات دائرة التنمية الاقتصادية مقارنة مع النباتات التي تعرضت لظروف GMF عكسه. شريط متري = 18 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. آثار المغنطيسي الأرضي عكس ميدانية على التعبير نبات الأرابيدوبسيس الجينات. بعد عشرة أيام من التعرض، تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع السيطرة ومحطات المعالجة وتحليلها من قبل في الوقت الحقيقي PCR لتحليل التعبير. كان تأثير عكس GMF للحث على تغيير جذري في التعبير الجيني لجميع الجينات التي تم اختبارها CRU3، Cruciferin 3؛ COTP1، النحاس النقل Protein1؛ RRTF1، الأكسدة والاختزال مجيب النسخ Factor1. الحانات تشير إلى الخطأ المعياري. العلامات النجمية تشير معنوية (P <0.05) بين ررالنمل تتعرض لظروف GMF معكوسة وطبيعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. آثار المغنطيسي الأرضي عكس ميدانية على نبات الأرابيدوبسيس المتعلقة مضادات الأكسدة التعبير الجيني. بعد عشرة أيام من التعرض، وعزل الحمض النووي الريبي مجموع السيطرة ومحطات المعالجة وتستخدم لتحليل التعبير الجيني باستخدام الوقت الحقيقي PCR. كان تأثير عكس GMF للحث على أي تغييرات كبيرة في التعبير الجيني تبادل لاطلاق النار. ومع ذلك، لوحظ وجود downregulation جذري في الجذر التعبير الجيني للنباتات المزروعة في ظل ظروف GMF عكس TAPX، Thylakoidal أسكوربات البيروكسيد؛ APX1، أسكوربات Peroxidase1؛ FSD1، الحديد فوق الأكسيد Dismutase1؛ RbohD، NA. DPH / التنفسي انفجار أوكسيديز البروتين D البارات تشير إلى الخطأ المعياري. العلامات النجمية تشير معنوية (P <0.05) بين النباتات المعرضة لظروف GMF عكس وطبيعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تأثير انعكاس المجال المغنطيسي الأرضي على نبات الأرابيدوبسيس الكاتلاز 3 (CAT3) التعبير الجيني. بعد عشرة أيام من التعرض، وعزل الحمض النووي الريبي مجموع السيطرة ومحطات المعالجة وتستخدم لتحليل التعبير الجيني باستخدام الوقت الحقيقي PCR. كان تأثير عكس GMF للحث على أي تغييرات كبيرة في التعبير الجيني تبادل لاطلاق النار. ومع ذلك، لوحظ وجود downregulation جذري في الجذر التعبير الجيني للنباتات المزروعة في ظل ظروف GMF عكسه. الحانات تشير ERRO القياسيةص. العلامات النجمية تشير معنوية (P <0.05) بين النباتات المعرضة لظروف GMF عكس وطبيعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
أظهرنا مؤخرا أن علاقة مذهلة موجود بين انتكاسات GMF والوقت عند تحويل معظم الأنساب كاسية البذور الأسرية حدث +2. ومع ذلك، على الرغم من الفرضيات محفزة وعدد كبير من الدراسات حول تأثير شدة GMF متنوعة، على افتراض أن GMF عكس نفسه قد تحدث تغييرات كبيرة في التعبير الجيني النباتي والتشكل لم يتم إثبات. نحن هنا تظهر لأول مرة، وهو أسلوب يستخدم triaxial مثمنة هيلمهولتز لفائف لعكس GMF في المختبر لدينا، وهذا عكس المجال المغناطيسي المحيط يمكن ان تسبب تغيرات المظهرية والتشكيل في التعبير الجيني في النباتات.
من أجل الحصول على GMF عكس (أو تعديل) على حجم كاف لتجارب نمو النبات (2 × 2 × 2 م 3)، قمنا ببناء نظام لفائف هيلمهولتز مثمنة. هذا النظام لا يتوفر تجاريا (لفائف هيلمهولتز عادة ما تتشكل حلقة وأصغر)وكانت تكاليف البناء كبيرة. الأهم من ذلك، هذا النظام يوفر تعديل الحقل القوي، مع استثنائي وقت الاستقرار والتجانس في المجالات المغناطيسية المعدلة.
تم تصميم نظام وبنيت لخفض قيمة GMF إلى آلاف من ظروف طبيعية أو لعكس أي من الأبعاد الثلاثة للمجال المغناطيسي. ومع ذلك، فإن تصميم ملفات لا يسمح لتوليد قوة عالية المجال المغناطيسي. لذلك، هذه الأداة في شكلها الحالي غير مناسب لاجراء تجارب تهدف إلى تقييم تأثير ارتفاع قوة المجال المغناطيسي على النباتات أو الكائنات الحية الأخرى.
في المختبر، وقد تم الحصول على تغيير في GMF مماثلة لتلك التي وصفها في هذه الطريقة عن طريق وسائل مختلفة، بما في ذلك التدريع التي تحيط منطقة تجريبية لوحات معدنية المغناطيسية مع النفاذية المغناطيسية العالية، والتي تنحرف المجالات المغناطيسية والتركيز عليها في المعدن نفسه. عشره ميزة استخدام لفائف هيلمهولتز هي أن النظام يسمح النباتات لأن تتعرض لمزيد من الظروف الطبيعية (ضوء، دوران الهواء، وغيرها)، وبالتالي مما يجعلها مثالية ليس فقط للدراسات في المختبر (كما هو الحال مع استخدام أطباق بتري) ولكن أيضا لفي الجسم الحي نمو النبات وتجارب التنمية. أبعاد نظامنا خلق مساحة تسمح لقمع تصل إلى <1/1000 من GMF الطبيعي طوال 25 × 25 × 25 سم 3 حجم كروية (انظر الشكل 1A)، مما يسمح لاستضافة العديد من لوحات بيتري أو بعض الصغيرة الأواني لنمو النبات.
الطريقة المعروضة هنا تم تطبيقها على دراسات بيولوجيا النبات. ومع ذلك، فإن النظام يسمح مجموعة واسعة من التجارب، بما في ذلك الفيروسات والأحياء الدقيقة، فضلا عن دراسات على الديدان الخيطية (على سبيل المثال، ايليجانس انواع معينة)، المفصليات و الحيوانات الصغيرة (بما في ذلك الفئران والجرذان). ولذلك، اختبارات الفرضية القائلة بأن عكس GMF قادرللحث ويمكن أيضا أن يتم تمديد تغيرات شكلية والنسخي إلى العديد من الأنظمة الحية الأخرى، وربما في نهاية المطاف حتى إلى الخلايا البشرية.
وGMF في تغير مستمر والمتقلبة. لذلك، في تجاربنا تحديا كبيرا واحد هو توفير التعويض المستمر للGMF من أجل الحصول على القيم GMF الجديدة المطلوبة. ويمكن تحقيق ذلك إلا من خلال المراقبة المستمرة للقيم الحقول المغناطيسية من خلال قراءة القيم المغنطيسية وتعويض الجهد. لذلك، يمكن للنظام تعويض جزء متفاوتة ببطء من GMF ولكنه لا يفعل شيئا لتقلبات التردد العالي.
في الختام، كان استخدام لفائف triaxial لعكس ناقلات GMF أساسيا لإثبات أن هذا انعكاس للناقلات GMF قادر على إحداث تغيرات شكلية النبات والتعبير الفرق الجيني. النتائج المتحصل عليها مع الطريقة المعروضة توفر أدلة دامغة لدعم الفرضية القائلة بأن إعادة GMFربما كان versals واحدة من القوى الدافعة لتطور النبات على امتداد فترات زمنية جيولوجية 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
| Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
| DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
| Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Ethanol | Sigma | 2860 | |
| GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
| RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
| RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
| 2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Petri dish square (120 x120 mm2) | Sigma | Z692344 |
References
- Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
- Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
- Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
- Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
- Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
- Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
- Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
- Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
- Pazur Galland, P., A,
- Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
- Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
- Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
- Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
- Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
- Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226 (2014).
- Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
- Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
- Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
- Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
- Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
- Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
- Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
- Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
- Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
- Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
- Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
- Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
- Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
- Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).
