Abstract
Mens transkripsjon regulering av proteinkodende gener ble grundig studert, er lite kjent om hvordan transkripsjonsfaktorer som er involvert i transkripsjon av ikke-kodende RNA, spesielt av microRNAs. Her foreslår vi en strategi for å studere potensielle rolle transkripsjonsfaktor i å regulere transkripsjon av microRNAs bruker offentlig tilgjengelige data, beregningsressurser og høy gjennomstrømning data. Vi bruker H3K4me3 epigenetisk signatur for å identifisere mikroRNA arrangører og kromatin immunoprecipitation (chip) -sequencing data fra KODE prosjekt for å identifisere mikroRNA arrangører som er beriket med transkripsjonsfaktor bindingssteder. Ved trans celler av interesse med shRNA targeting en transkripsjonsfaktor av interesse og å utsette cellene til mikroRNA array, studerer vi effekten av denne transkripsjonsfaktor på mikroRNA transkriptom. Som et illustrerende eksempel bruker vi vår undersøkelse på effekten av STAT3 på mikroRNA transkriptomet av kronisk lymphocytic leukemi (KLL) celler.
Introduction
MicroRNAs er endogene små ikke koding regulatoriske RNA som vanligvis fungerer som negative regulatorer av mRNA uttrykk ved posttranskripsjonelt nivå. Omtrent 1000 ikke-kodende 20 til 25 nukleotid lange microRNAs er funnet i det humane genomet 1,2. MicroRNAs regulere genekspresjon gjennom kanonisk baseparing mellom frø-sekvensen av mikroRNA og dens komplementære sekvens frø kamp, som vanligvis ligger i 3'-utranslatert region (UTR) av mål-mRNA. Kollektivt, microRNAs regulere mer enn 30% av proteinkodende gener 3, men bare lite er kjent om transkripsjon fra DNA av microRNAs. Det har blitt foreslått at reguleringen av mikroRNA transkripsjon er lik den til mRNA 4,5. Spesielt, i likhet med dets aktivitet i å fremme transkripsjon av protein-kodende gener, er transkripsjonsfaktorer antatt å aktivere transkripsjon av microRNAs 6. Transkripsjonsfaktor-microRNA samspillet har blitt rapportert som en modulator faktor av genekspresjon 7, og kan også danne feed-back og feed-frem sløyfer. For eksempel, Yamakuchi et al., Rapporterte en tilbakekoblingssløyfe hvori p53 induserer ekspresjon av microRNA34a, som i sin tur hindrer translasjon av p53-repressoren SIRT og derved øke p53 aktivitet 8.
Mens spesifikke eksempler på transkripsjonsfaktor avhengig uttrykk for microRNAs er rapportert, mangler en akseptert metode som gir informasjon om hvordan en transkripsjonsfaktor av interesse regulerer uttrykk av mikroRNA-transkriptom. Formålet med protokollen foreslått her, er å gi en grundig beskrivelse av transkripsjonsfaktor avhengig regulering av mikroRNA-transkriptom. Ved å kombinere offentlig tilgjengelige data, bioinformatikk og bruk av microarray teknologi, ville forskere som følger denne algoritmen kunne fange opp på en genomisk skala hvordan noentranskripsjonsfaktor i en hvilken som helst celletype av interesse regulerer ekspresjon av mikroRNA-transcriptome og for å utforske en antatt bidrag av transkripsjonsfaktor-mRNA i regulering mikroRNA uttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Identifiser transkripsjonsfaktor bindingsseter i Arrangøren av mikroRNA Gener Bruke Data Mining Approach
- Bruk University of California Santa Cruz (UCSC) genom nettleser for å trekke kromatin immunoprecipitation (chip) sekvense data generert som en del av Encyclopedia of DNA element (KODE) prosjekt.
- Åpne tabellen leseren i UCSC genom nettleser.
- Bruk følgende spesifikasjoner for å trekke ut tabellen: klade: (pattedyr), genom: (human), Montering: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), gruppe: (forskrift), spor (TxnFactorChIP), bord: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), region : (Genome), output format (alle gener fra valgte tabellen).
- Lagre utdataene fra 1.1.2 som en .txt-fil og inn i et regneark.
- Sorter og filter for transkripsjonsfaktoren av interesse (f.eks STAT2).
- Bruk listen over mikroRNA arrangører basert på H3K4me3 epigenetikk signatur tilgjengelig på Baeer et al. 9
- For å matche i henhold til koordinatene på det menneskelige genom, kart data fra 1,1 og 1,2 (f.eks STAT3 bindende for antatte mikroRNA arrangører) og bestemme median bindende affinitet med kode skrevet i C skarp som skissert i supplerende koding fil 1.
2. Bruk shRNA til Down-regulere uttrykk for en transkripsjonsfaktor av interesse
- Plate 1.5 x 10 6 celler fra 293 humane embryonale nyrecellelinje i 10 cm plate ved tilnærmet 50% konfluens (DMEM med 10% FBS).
- Transfektere celler fra 293 humane embryonale nyrecellelinje med 5 ug av grønn fluorescens protein (GFP) lentivirus innehold shRNA rettet til transkripsjonsfaktor av interesse og med 5 ug av emballasje vektorer ved hjelp av transfeksjon reagens for adherente celler i henhold til produsentens protokoll.
- Som en kontroll, transfektere cellene fra 293 humane embryonale nyrecellelinje medegge shRNA og emballasje vektorer i henhold til produsentens protokoll.
- Hold transfeksjon blanding på cellene i 16 timer (ved 37 ° C, CO2 inkubator), og endrer media til 10 ml frisk 10% DMEM media med 10% FBS.
- Vent 48 timer etter transfeksjon, sentrifuger cellekultur (300 xg, 5 min) og samle smittsomme supernatant. Filtrer supernatanten gjennom et 0,45 um sprøytefilter (25-mm overflateaktivt middel fri celluloseacetat-membran) for å fjerne eventuelle flytende celler.
- Konsentrere supernatanten og samle lentivirus ved hjelp av en ultracentrifugal filteranordning med terskel på 100 kDa. Spin på 950 xg i 30 - 60 min til volumet har vært konsentrat til mindre enn 250 fil. Oppbevar konsentrert viruset ved -80 ° C.
- Transfektere cellene med lentivirus. Fjerne frosset lentivirus fra -80 ° C fryseren og tines til romtemperatur. Overfør 100 ul av viral supernatant til en frisk 1,5 ml mikrofuge-rør.
- Bring opp volumet i røret til 1 ml med redusert serummedium. Legg hexadimethrine bromid til 1 ml virus suspensjon for endelig konsentrasjon på 10 ng / ml, bland forsiktig og la blandingen stå i 5 minutter.
- Sentrifuger 5 x 10 6 celler for hver transduksjon og forsiktig cellepelleten suspenderes i 0,5 ml medium inneholdende virus. La cellene opphold i kuvøsen til 4 - 24 timer, og deretter tilsett 0,5 ml medium med 20% FBS til en sluttkonsentrasjon på 10% FBS.
- Vent 48-72 timer og beis cellene med propidiumjodid (PI) og grønt fluoriserende protein (GFP) i henhold til produsentens instruksjoner. Beskytt celler fra lys og bruke en FACS sorter å måle utbredelsen av GFP + / PI - celler. Siden PI flekker bare død celle, er denne frekvensen et estimat av transfeksjonseffektivitet i levende celler.
- Sorter positive cellepopulasjon til GFP uttrykk (GFP +) ved FACS sorter som tidligere beskrevet 10.
- bruk Western immunblotting som beskrevet ovenfor 10 for å bestemme nivået av en transkripsjonsfaktor i området før og etter infiserer cellene av interesse (for eksempel, CLL celler) med angitte shRNA.
3. Bestem Expression Nivå mikroRNA transkriptomet i celler transfektert med transkripsjonsfaktor-shRNA
- Isolere RNA ved hjelp av et kommersielt kit i henhold til produsentens protokoll.
- Merk RNA og hybridisere det å mikroRNA microarray 11.
- Bestem forskjellig uttrykt mikroRNA i celler transfektert med transkripsjonsfaktor-shRNA eller med tomme vektor kontroller 5.
- Validere microarray resultater for de forskjellig uttrykt microRNAs ved hjelp av real-time PCR 5.
4. Bestem Overlapping mellom Bioinformatikk og shRNA tilnærming for å beskrive transkripsjonsfaktor Dependent transkriptom
- til Dethermelin de forventede og observerte forholdstall på mikroRNA gener som havn transkripsjonsfaktor bindingsseter i sine arrangører og ble nedregulert i transkripsjonsfaktor-shRNA transfekterte celler, gjør du følgende:
- Skaff forholdet mellom gener som havn transkripsjonsfaktor av interesse i deres promoter / total mikroRNA fra listen generert på 1.3. Denne listen er forventet ratio (f.eks mikroRNA gener med STAT3 bindingsseter / total mikroRNA gener testet = 0,25).
- Bestem antall gener som ble nedregulert i transkripsjonsfaktor-shRNA transfekterte celler fra listen generert på 3.3 og har transkripsjonsfaktor av rentebindingsseter fra listen generert på 1.3. Dette tallet / Totalt antall downregulated gener er det observerte forholdet (f.eks mikroRNA gener med STAT3 bindingsseter / totalt antall downregulated microRNAs = 0,6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STAT3 er en transkripsjonsfaktor som typisk induserer transkripsjon av gener som har anti apoptotiske og proliferative effekter 12. Enten STAT3 også påvirke ikke-kodende RNA transkriptomet er foreløpig ukjent. I alle KLL celler STAT3 er konstitutivt fosforylert på serin 707 rester 10,13. Fosfoserin STAT3 transport til kjernen, binder seg til DNA, og aktiverer gener kjent for å bli aktivert av tyrosin pSTAT3 i andre celletyper 10. Fordi CLL er karakterisert ved global deregulering av mikroRNA nettet 14, hypotese vi at tilstedeværelsen av serin pSTAT3 påvirker ekspresjonen av microRNAs i KLL celler.
For å teste denne hypotesen arrangører av microRNAs som havn Stat3 bindingsseter måtte bli identifisert. Ved å krysse data generert av Baer et al. 9 av regioner med H2K4me3 histone modifikasjon som preger promoter områder, med STAT3 bindingsseter identifisert av Chip-seq eksperiment 15, ble antatte Stat3 bindingssteder identifisert. Ved hjelp av denne tilnærmingen 160 mulige arrangører ble påvist i nesten 25% av mikroRNA gener undersøkt (N = 200) med bindende score fra 100 (lavest score) til 1000 (den høyeste score) (tabell 1).
Deretter ble CLL-celler ble transfektert med STAT3-shRNA eller med en tom vektor, og ved hjelp av mikroRNA matrise og identifisert 63 microRNAs som ble regulert ned etter transfeksjon (figur 1) som tyder på at STAT3 fremmer transkripsjon av disse microRNAs. For 60% av de 63 downregulated mikroRNA gener (n = 38) Chip-seq data bekreftet STAT3 binding i en antatt promoter oppstrøms av genet stedet, betydelig mer enn forventet ved en tilfeldighet (p <0,0001). Ni microRNAs som ble nedregulert etter transfeksjon,som tyder på at STAT3 negativt regulere sine nivåer av transkripsjon.
Figur 1. Transfeksjon av KLL celler med STAT3-shRNA reduserer uttrykket nivåer av STAT3 protein og STAT3 mRNA. A:. Etter transfeksjon av CLL celler med STAT3-shRNA nivåer av STAT3 mRNA (venstre panel, detektert ved kvantitativ RT-PCR), og nivåene av STAT3 protein (panel rett, detektert ved Western-immunblotting) reduserte signifikant B: mikroRNA matrise av CLL celler avbildet 23 microRNAs hvis uttrykk skilte seg mellom KLL celler transfektert med STAT3-shRNA og KLL celler transfektert med en tom vektor. P-verdi på mindre enn 0,01 ble ansett som statistisk signifikant. C: Den midlere Uttrykket kvantifisert ved RT-PCR av 7 microRNAs som hadde differensial uttrykk etter STAT3-shRNA behandling ved hjelp avmikroRNA array. Barer representerer standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental Coding File 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Micro RNA genet | kromosom | Arrangøren start koordinater | Arrangøren end koordinater | Median (spredning) STAT3 bindende poengsum * |
| MIR-1205, MIR-1206, MIR-1207 | 8 q24.21 | 128961454 | 128962791 | 1000 (1000-1000) | 1 q42.3 | 236045425 | 236047415 | 1000 (1000-1000) |
| MIR-21 | 17 q23.1 | 57901872 | 57921277 | 1000 (112-1000) |
| MIR-3124 | 1 Q44 | 249115404 | 249123965 | 1000 (1000-1000) |
| MIR-451 | 17q11.2 | 27222251 | 27224114 | 1000 (1000-1000) |
| MIR-92b | 1 Q22 | 155162340 | 155168439 | 1000 (1000-1000) |
| MIR-3197 | 21 q22.2 | 42537544 | 42543023 | 943 (943-943) |
| MIR-646 | 20 q13.33 | 58712550 | 58715320 | 789 (789-789) |
| MIR-629 | 15 Q23 | 70383751 | 70394586 | 773 (661-885) |
| MIR-30e, MIR-30c-en | 1 p34.2 | 41173077 | 41177703 | 759 (759-759) |
| MIR-3125 | 2 p24.3 | 12855381 | 12862915 | 756 (756-756) |
| MIR-3145 | 6 q23.3 | 138776942 | 138779365 | 743 (487-1000) |
| MIR-645 | 20 q13.13 | 49199911 | 49201187 | 743 (743-743) |
| MIR-1256 | 1 p36.12 | 21346830 | 21350211 | 725 (725-725) |
| MIR-619 | 12 q24.11 | 109248263 | 109253306 | 719 (719-719) |
| MIR-181a-2, MIR-181b-2 | 9 q33.3 | 127418928 | 127426139 | 710 (710-710) |
| MIR-29a, MIR-29b-1 | 7 q32.3 | 130583383 | 130597803 697 (482-1000) | |
| MIR-202 | 10 q26.3 | 135069499 | 135077337 | 696 (393-1000) |
| MIR-3142, MIR-146a | 5 Q34 | 159890882 | 159899475 | 671 (671-671) |
| MIR-548c | 12 q14.2 | 65000968 | 65011503 | 660 (660-660) |
| MIR-630 | 15 q24.1 | 72764289 | 72769197 | 627 (255-1000) |
| MIR-135b | 1 q32.1 | 205416952 | 205452990 | 622 (245-1000) |
| MIR-29C, MIR-29b-2 | 1 q32.2 | 207991044 | 208002382 | 608 (608-608) |
| MIR-1825 | 20 q11.21 | 30791020 | 30798310 | 604 (209-1000) |
| MIR-548h-en | 14 q23.2 | 64578834 | 64581657 | 587 (174-1000) |
| MIR-612 | 11 q13.1 | 65183633 | 65198528 | 581 (157-1000) |
| MIR-148b | 12 q13.13 | 54717640 | 54721204 | 578 (578-578) |
| MIR-3174 | 15 q26.1 | 90543381 | 90549092 | 576 (152-1000) |
| let7a-3, let7b | 22 | 46480680 | 46481826 | 573 (146-1000) |
| MIR-1255a | 4 Q24 | 102263848 | 102272541 | 557 (557-557) |
Tabell 1. Antatte mikroRNA er arrangører med Stat3 bindingssteder. Protokollen gir en metode for å identifisere transkripsjon faktor bindende for antatte arrangører av microRNAs ved hjelp av data mining av publiserte data. Som et eksempel, presenterer vi her en tabell som viser binding av STAT3 til antatte mikroRNA arrangører. Bindingen score er gitt på en 0 til 1000 skala fra hele genomet Chip seq data publisert som en del av KODE-prosjektet 15. Initiativtakerne er identifisert ved tilstedeværelsen av H3K4me3 epigenetisk signatur 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mekanismen som ligger til grunn av RNA-polymerase II-avhengig transkripsjon av proteinkodende gener er blitt grundig undersøkt. Selv om disse elementene utgjør bare 1% - 2% av det humane genom, bevis fra ENCODE-prosjektet indikerer at over 80% av det humane genom kan gjennomgå transkripsjon 17 og det som regulerer transkripsjon av de ikke-kodende DNA-elementer som forblir stort sett ukjent 6 .
Flere studier, som indikerte at Pol II er også ansvarlig for transkripsjon av noen ikke-proteinkodende gener inkludert microRNAs seks, ledet oss til å utvikle en strategi som kombinerer data fra offentlig tilgjengelige ressurser, beregningsalgoritmer og in vitro studier for å dechiffrere den potensielle funksjon av en transkripsjonsfaktor av interesse i å regulere transkripsjon av microRNAs. Strategien foreslått her, omfatter 2 kritiske trinn. Først bruker vi offentlig tilgjengelige data for å identifisere transkripsjonsfaktor binding i mikroRNA arrangører. For å oppnå dette bruker vi Chip-seq data publisert av KODE konsortium for å identifisere transkripsjon faktor bindende og epigenetisk signatur som er et forbilde promoter som en indirekte markør for mikroRNA-arrangører. Kryssing av genetiske koordinatene fra disse datasettene gir en brutto estimering av hvor hyppig en transkripsjonsfaktor av interesse binder seg til mikroRNA-promoter. Sekund ved hjelp av shRNA teknologi for å slå av ekspresjonen av en transkripsjonsfaktor og å utsette cellene for mikroRNA-array, er det mulig å utforske den funksjonelle betydning av en transkripsjonsfaktor på mikroRNA-transcriptome.
Variabiliteten i mikroRNA uttrykk er bare delvis forklares ved transkripsjonsfaktoravhengig regulering. Støkiometrisk variabilitet og andre cellulære eller ekstracellulære faktorer spiller en viktig rolle, og er ikke simulert i den foreslåtte algoritme. Andre begrensninger omfatter følgende: Arrangøren analyse basert på H3K4me3signaturen ble gjort på 939 kommenterte microRNAs. Siden den genomiske plasseringer av mange flere microRNAs har blitt identifisert. Men til vår beste overbevisning en mer omfattende liste som er basert på en oppdatert database ikke er publisert ennå. Av de 939 mikroRNA genene, ble det H3K4me3 som forbilde promoterområdet identifisert i 781 mikroRNA gener (83%). Derfor, mens denne analysen er tydelig basert på et ufullstendig datasettet den fanger opp en betydelig andel av mikroRNA-transkriptom.
Videre er epigenetikk signatur delvis trykt og delvis celle-spesifikke. Derfor kan generability av mulige arrangører som ble definert av epigenetikk markører settes spørsmålstegn ved. Fordi H3K4me3 vedvarer uavhengig av transkripsjon 18 er det generelt ansett som en markør for trykt promotorer. Det analytiske algoritme vi foreslår her, kan derfor gå glipp av celle-spesifikke mikroRNA arrangører hvis disse arrangørene ble identifisert på et annet celle-type. Endelig bør en konklusjon bli testet og bekreftet empirisk. Mest spesielt sammenhengen mellom nedregulering av en transkripsjonsfaktor (ved hjelp shRNA tilnærming) og mikroRNA uttrykk (identifisert av mikroRNA array) kan bare foreslå en direkte transkripsjonen rolle som bør bekreftes av akseptable analyser som kromatin immunoprecipitation (chip) eller elektromobilitet skift analysen (EMSA). Modifikasjoner av fremgangsmåten foreslått i dette dokumentet omfatter ulike måter å identifisere mikroRNA promoter og ulike måter å slå ned ekspresjon av en transkripsjonsfaktor, for eksempel små interfererende RNA istedenfor shRNA. Transkripsjonen regulering av microRNAs kan være vesentlig forskjellig for microRNAs som bor innenfor proteinkodende gener (intragenic microRNAs) og de som ikke gjør det (intergeniske microRNAs). Fordi intragenic microRNAs blir ofte transkribert i forbindelse med sine vertsgener 19 arrangøren er vanligvis funnet umiddelbart ligger oppstrømsm transkripsjonsstartsetet. Men for mange intergeniske microRNAs transkripsjonsstartsetet er dårlig kommenterte, og prediksjon verktøy som ofte brukes for proteinkodende gener fungerer dårlig 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en bevilgning fra KLL Global Research Foundation. The University of Texas MD Anderson Cancer Center støttes delvis av National Institutes of Health gjennom en Cancer Center Support Grant (P30CA16672).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µm syringe filter | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Amicon ultracentrifugal filter device with threshold of 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reagent | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Cell line human | Sigma-Aldrich | 85120602 |
References
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61 (2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50 (2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046 (2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279 (2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).
