Summary
כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.
Abstract
כלורופיל (Chls) ו bacteriochlorophylls (BChls) הוא הקו-הפקטורים העיקריים המבצעות קציר פוטוסינתטיים אור העברת אלקטרונים. הפונקציונליות שלהם תלויה באופן קריטי לארגון הספציפי שלהם בתוך קומפלקסי חלבונים הטרנסממברני multisubunit גדולות ומסועפים. על מנת להבין ברמה המולקולרית איך קומפלקסים אלה להקל המרת אנרגית שמש, זה הכרחי כדי להבין חלבון-פיגמנט, ואינטראקציות פיגמנט-פיגמנט, והשפיע על דינמיקה נרגשת. אחת דרכים להשיג הבנה כזו היא על ידי בנייה ולומד קומפלקסים של Chls עם חלבונים רקומביננטיים מסיסים במים פשוטים. עם זאת, המשלב בתוכו את Chls ו BChls lipophilic לחלבונים מסיסים במים קשה. יתר על כן, אין שיטה כללית, אשר יכול לשמש להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי. הנה, אנחנו מדגימים מערכת תפוקה פשוט גבוהה המבוססת על אמולסיות מים-in-שמן, המאפשרת את תחתembly של חלבונים מסיסים במים עם Chls הידרופובי. השיטה החדשה קיבלה תוקף על ידי הרכבת גרסאות רקומביננטי של חלבון מסיס במים כלורופיל מחייב של צמחים מצליבים (WSCP) עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה המוצלחת של Chl lysates גולמי באמצעות של WSCP להביע E. תא קולי, אשר עשוי לשמש לפיתוח מערכת מסך גנטי חלבונים מסיסים במים הרומן Chl מחייב, וכן לבדיקות של אינטראקציות Chl בחלבונים תהליכי ההרכבה.
Introduction
פיגמנטים הידרופובי כגון כלורופיל (Chls), bacteriochlorophylls (BChls) וקרוטנואידים הם הקו-הפקטורים העיקריים במרכזי תגובה פוטוסינתטיים וחלבוני קצירת אור מבצעות העברת אלקטרונים, ללכוד את אנרגית אור והעברה. מרכזי התגובה ורוב מתחמי הקציר Chl מחייבים אור הם חלבונים הטרנסממברני. Fenna-מתיוס-אולסון (FMO) החלבון של חיידקי גופרית ירוקה פוטוסינתטיים הלא חמצנית 1,2, ואת חלבון peridinin-Chl (PCP) של dinoflagellates 3 דוגמאות יוצאות דופן של חלבוני קצירת אור מסיסים במים. החלבונים מחייבים מסיסים במים כלורופיל (WSCPs) של המצליבים, ארכוביתיים, Chenopodiaceae ו ירבוזיים צמחים 4, 5 הם עוד דוגמא ייחודית, עדיין בניגוד FMO ו PCP, אלה אינם מעורבים בקצירת אור ולא בשום התגובה פוטוסינתטיים העיקרית , ו PHY המדויק שלהםפונקציות siological הן עדיין לא ברורות 5-8. הזיקה הגבוהה Chl המחייב שלהם הובילה פונקציה הציעה כנישאים חולפים של Chls ונגזר Chl 9,10. לחלופין, זה היה שיערו כי WSCP ממלא תפקיד הדחה Chls ב תאים פגומים ומגן מפני נזק photooxidative הנגרמת Chl 7,11-13. לאחרונה, הוצע כי פונקציות WSCP כמעכב פרוטאז וממלא תפקיד במהלך התנגדות אוכלי עשב כמו גם מסדיר מוות של תאים במהלך התפתחות הפרח 14. WSCPs נחלקים לשתי קבוצות עיקריות על פי מאפייני photophysical שלהם. המחזור הראשון (אני בכיתה, למשל. מן כף אווז לבנה) עשוי לעבור photoconversion על תאורה. Class II WSCPs מצמחים Brassica, שאינם עוברים photoconversion 5,10, מחולקים נוספת לכיתה IIa (למשל., מ oleracea Brassica, sativus Raphanus) ו IIb (למשל., מן שחליים virginicum שחליים virginicum נפתרה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן על 2.0 ברזולוציה 8. הוא מגלה homotetramer סימטרי שבו יחידות משנת חלבון יוצרי ליבה הידרופובי. למקטע כל נקשר Chl אחת שתוצאתה הסדר הדוק של ארבעה Chls מקרוב ארוז בתוך core.This פשוט כל הסדר Chl עושה WSCPs מערכת מודל שימושי פוטנציאלי ללימוד מחייב והרכבה של מתחמי Chl-חלבון, ואת ההשפעות של השכנה Chls וסביבות חלבון על תכונות ספקטרליות ואלקטרוניקה של Chls הפרט. יתר על כן, היא עשויה לספק תבניות לבניית חלבונים מלאכותיים Chl מחייב כי ניתן להשתמש עבור מודולים אור-קציר בהתקנים המבצעים פוטוסינתזה מלאכותית.
מחקרים קפדניים של WSCPs ילידי הארץ הם לא ריאליים כי מתחמי מטוהרי מצמחים תמיד מכילים תערובת הטרוגנית של tetramers עם שילובים שונים של Chlו Chl ב 9. לפיכך, שיטה להרכבת WSCPs recombinantly הביע עם Chls במבחנה נדרשה. זה מוטל בספק על ידי המים המסיסים הזניחה של Chls מה שהופך את זה אי אפשר להרכיב את המורכבות במבחנה פשוט על ידי ערבוב apoproteins מסיס במים עם פיגמנטים בתמיסות מימיות. במבחנת הרכבה ידי ערבוב apoproteins עם ממברנות תילקואיד 15 הודגם, אבל שיטה זו מוגבלת בהווה Chls הילידים תילקואיד. שמידט ואח '. דיווח על הרכבת כמה נגזרים Chl ו BChl עם WSCP מ כרובית (CaWSCP) על ידי recombinantly לבטא חלבון מתויג-היסטידין ב E. coli לשתק אותו על עמודה Ni-זיקה והחדרת נגזרים Chl solubilized ב דטרגנטים 11. כינון מחדש בהצלחה של WSCPs רקומביננטי מ א thaliana 6, וכרוב ניצנים (BoWSCP), צנון בר יפני (RshWSCP)ד וירג'יניה pepperweed (LvWSCP) על ידי שיטה דומה גם דווח.
כאן, אנו מציגים רומן, כללית, שיטה פשוטה להרכבת Chls עם WSCP שאינו דורש תיוג או לשתק את החלבונים. היא מסתמכת על הכנת אמולסיות מהפתרונים מהימיים שלהם של apoproteins מסיס במים בשמן מינרלים. החלבונים ובכך הם הגלום מים ב-שמן (W / O) microdroplets עם משטח גבוה מאוד יחס נפח 16. קו-פקטורים הידרופובי אז הם מומסים בשמן מוצגים בקלות לתוך טיפות משלב שמן. אנו מדווחים על השימוש בשיטה להרכבה של מספר הגירסות של apoproteins WSCP הביעו recombinantly ב E. coli עם Chl א. אנו מדגימים את ההרכבה מ lysate הגולמי של חיידקים ביתר-WSCP אשר עשוי לשמש כמערכת הקרנה לפיתוח חלבוני Chl מחייבים רומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Chl פתרונות במלאי
- שלב קריטי: בצע את כל השלבים של הכנת כלורופיל במנדף כימי, תחת אור ירוק (520 ננומטר) או בחושך כדי למזער נזקי. תמיד להוסיף חנקן או ארגון לפני ההקפאה הפיגמנטים לאחסון. ודא שכל ממיסים הם כיתה אנליטי.
- שוקל כ 5 מ"ג של תאי platensis ספירולינה lyophilized או תאי cyanobacterium אחרים המכילים Chl רק ממברנות תילקואיד ולרסק אותו בעזרת מכתש ועלי.
- טען תאים התנפלו טור זכוכית ולשטוף עם על אצטון 50-100 מ"ל של 100% על מנת להסיר קרוטנואידים. מחק את השבריר הכתום / ירוק eluted.
הערה: אם השבר תפוז אינו eluted עם 100 מ"ל של אצטון ממשיכים לשטוף את התאים עם אצטון עד שבריר ירוק מתחיל elute. - המרת אצטון עם 100% מתנול ולאסוף את החלק היחסי ירוק המכיל Chl א. היקף Fract elutedיון עשוי להשתנות בין 50-100 מ"ל. בהתחלה השבר eluted יש צבע ירוק כהה, אשר משנה לתוך ירוק בהיר בסוף elution. כאשר הצבע של חלק eluted הופך ירוק בהיר לעצור את elution.
- לאדות את מתנול באמצעות מאייד רוטרי עד התמצית יבשה לחלוטין. אין ליישם חום לפתרון; ודא שהטמפרטורה באמבט מים של המאייד אינה עולה על 30 מעלות צלזיוס.
שימו לב: בפעם של אידוי תלוי בנפח של שבריר מתנול להיות התאדו ועשויה להשתנות בין 10-60 דקות. חשוב לייבש את התמצית לחלוטין. - ממיסים את הפיגמנטים מהתמצית יבשים בנפח קטן של אתר diethyl (כ 5-10 מ"ל), ולסנן דרך צמר גפן. ודא פיגמנטים מתמוססים לחלוטין ב אתר לפני הסינון.
- לאדות את אתר diethyl עד פיגמנטים יבשים לחלוטין (10-30 דקות).
הערה: פיגמנטים היבשים ניתן מטוהר עם ומשייך תחת חנקן או ארגון ב -20 ° C, בחושך עד לעיבוד נוסף. - ממיסים את הפיגמנטים יבש נפח קטן ככל האפשר של מתנול 100% (כ 1 מ"ל), גם אם לא הכל מושעה לחלוטין. הוסף 4 מ"ל של אצטון לפתרון, קפיצי הזכוכית בעדינות כדי לפזר את הפיגמנטים לחלוטין.
- בעזרת פיפטה פסטר, לטעון את המדגם בעדינות על טור של DEAE sepharose equilibrated אצטון 100%.
- קרוטנואידים Elute (להקה כתומה-צהוב) עם 100% אצטון. לאחר מכן, elute Chl A (להקה ירוקה) עם 3: 1 v / v אצטון / מתנול תערובת.
הערה: היקף אצטון תערובת אצטון / מתנול הוא כ שווה לנפח של DEAE sepharose נטען על עמודה. - ודא Chl טוהר על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה באמצעות 68: 25: 5: 2 dichloromethane / n-הקסאן / isopropanol / מתנול (v / v) תערובת כמו eluent 17.
- להתאדות הממס באמצעות המאייד רוטרי עד א Chl יבש לחלוטין (10-60 דק ').
הערה: יבש Chl ניתן מטוהר עם חנקן או ארגון ומאוחסנים תחת אווירה ארגון ב -20 ° C בחושך. - כן Chl פתרון מניות על ידי מחדש המסת א Chl היבשה 2-4 מיליליטר של 100% אתנול.
הערה: מקדם הכחדה של Chl ב 663 ננומטר הוא 74,400 -1 ס"מ M -1 (83.3 ס"מ -1 (מ"ג / מ"ל) -1) באתנול. פתרון המניות טיפוסי צריך OD של 1,860 המתאים לריכוז של 25 מ"מ (23 מ"ג / מ"ל). הוספת 20 μl של המניה הזו כדי תחליב המכיל 5 מ"ל של שלב אורגני, 1 מ"ג של WSCP ב 1 מ"ל של תוצאות השלב מימית בתערובת עם 10 עודף טוחנת קיפול של Chl א 'לעומת WSCP.
2. הכנת שלב אורגני של אמולסיה
הערה: השלב האורגני של התחליב מורכב שמן מינרלי המכיל 4.5% (v / v) Span 80, ו -0.4% (v / v) Tween 80.
- לשקול בתוך g 50 מ"ל צינור 0.2 TWeen 80, 1.8 גרם של Span 80, ו -38 גרם של שמן מינרלי. מערבבים היטב את כל המרכיבים להתקרר על הקרח.
הערה: בשלב אורגני ניתן לאחסן 4 ° C עד שבוע.
3. הכנת מימית שלב של אמולסיה
הערה: השלב המימי של התחליב יכול להיות מורכב משני WSCP המטוהר, או לחלץ גולמי של חיידקי overexpressing WSCP.
- הכנת שלב מימייה המכיל WSCP המטוהר.
- לגדול חיידקי E.coli BL21 המכילים WSCP פלסמיד 12 ב 1 ליטר של מדיום LB ב 37 ° C עד OD של 0.3-0.6.
- להשרות ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG 1 מ"מ. לאחר אינדוקציה לגדול חיידקים על 30 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
- חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
- ממס את הגלולה ב חיץ מחייב ו sonicate על קרח (30 שניות על, 15 שניות את, חמש פעמים). השתמש 10 מ"ל של חיץ עבור גלולה המתקבל צנטריפוגה של 250 מ"ל שלLB בינוני עם תאים overexpressing החלבון.
הערה: בהתאם שיטת טיהור, למאגר מחייב יכול להיות מורכב 100 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.2 או 50 מ"מ טריס, pH 7.5, 500 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA. - ספין למטה lysate התא XG ב 12,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- לטהר WSCP ידי כרומטוגרפיה זיקה. בהתאם התג התמזג WSCP, לטהר חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכת כרומטוגרפיה הזיקה המתאימה הזמינה מסחרי עבור טיהור חלבונים בהתאם להוראות יצרן.
- להכנת תחליב, השתמש WSCP מטוהר 50 מ"מ חיץ פוספט, pH 7.8. ודא שכמות החלבון הסופי המשמש הכינון מחדש הוא 0.5-1.0 מ"ג לכל 1 מ"ל של חיץ.
- הכנת שלב מימייה המכיל lysate חיידקים גולמי עם WSCP.
- לגדל תאים E.coli BL21 המכיל WSCP להביע פלסמיד ב 250 מ"ל של מדיום LB ב 37 ° C עד OD 0.3-0.6.
- להשרות ביטוי חלבון עםIPTG 1 מ"מ ולגדול חיידקים לילה בשעה 30 ° C.
- תאים חיידקיים קציר על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
- ממיסים את גלולה ב 1-2 מ"ל של 50 מ"מ חיץ פוספט נתרן pH 7.8, sonicate (30 שניות על, 15 שניות את, שלוש פעמים) ו צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 30 דקות ב 4 °.
- מכינים את השלב מימית של התחליב על ידי ערבוב 0.125 מ"ל של supernatant עם 0.875 מ"ל של pH חיץ פוספט נתרן 50 מ"מ 7.8.
4. האסיפה של WSCP עם Chl ב אמולסיה
- העברת 5 מ"ל של תערובת-פעילי שטח שמן לתוך בקבוקון זכוכית לקרר אותו על הקרח. לפני pipetting, לוודא שכל המרכיבים של השלב האורגני מעורבבים היטב ואין הפרדת פאזות בין פעילי שטח ושמן מינרלים.
- הוסף 1 מ"ל של שלב מימית קר כקרח מוכנים כמו בסעיף 3 עד 5 מ"ל של השלב האורגני.
- מערבבים שני שלבים באמצעות homogenizer רקמה 2 דקות ב -9,500 סל"ד על הקרח.
- שלב קריטי: משלב זה והלאה, לבצע את כל צעדים נוספים תחת אור ירוק (520 ננומטר) על מנת למזער נזקי. הוסף 20 μl של 25 מ"מ Chl פתרון המניות (ראו סעיף 1.13) כדי התחליב. לפזר על ידי מצליף ו היפוך בקבוקון זכוכית. ודא כי Chl מופץ באופן שווה התחליב.
- דגירה אמולסיה במשך 1-2 שעות על הקרח בחושך.
- על מנת לשבור את תחליב טיפות מים נפרד מהשלב אורגני להעביר את תחליב צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: אם האסיפה היא מוצלחת, בשלב מהימי התחתון צריך להיות בצבע ירוק. - השלך את שלב שמן העליון ולהוסיף 1 מיליליטר של שמן מינרלים. מערבבים היטב את שמן מינרלי עם אמולסיה pelleted ידי מערבולת או על ידי מרפרף צינור ביסודיות. ספין למטה מדגם ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עד המניסקוס ברור המפריד בין מימיים כוריםשלבי שמן אל, ללא כל אמולסיה ביניים מתקבלים.
- בצע פעולה זו במנדף כימי. לאחר שלבי שמן מימייה ומינרלים מופרדים בבירור, להסיר שמן מינרלים ולהוסיף 1 מיליליטר של אתר diethyl-רווי מים. וורטקס ו ספין למטה מדגם ב 14,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על פעולה זו פעמיים.
- לאחר צנטריפוגה השני, להסיר את אתר diethyl ולהשאיר את הצינורות פתוחים עבור 5-20 דקות בתוך הכובע.
- לבסוף, טען את השלב מהימי המכיל את WSCP / Chl קומפלקס על טור desalting ו elute עם מאגר מתאים עבור ניסויים נוספים.
הערה: החלבון יציב מאגרי phosphate- ו טריס במגוון רחב של pH (6.0-7.5). המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 ° C מוגן מפני אור עד חודש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Apoproteins WSCP רקומביננטי הורכב עם Chl תחליבי W / O על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף הקודם. הפרוטוקול יושם באמצעות שלבי מימייה המכילים גם WSCPs הטהור, או lysates תאי E.coli overexpressing WSCP (איור 1). הפרוטוקול הוא פשוט, מהיר ואינו דורש שום ציוד מיוחד מלבד homogenizer רקמות.
ספיגת ו- CD ספקטרום של Chl קומפלקסים של ארבע וריאציות WSCP רקומביננטי, כלומר RshWSCP, CaWSCP, BoWSCP ו LvWSCP מוצגים באיור 2. אלו דומים בצורתם הלהקה ותנוחה ספקטרה שדווח בעבר של מתחמי יליד בהתאמה 10,18, 19. תוצאות אלו מראות בבירור כי WSCP / Chl מתחמים מחדש במערכת אמולסיה W / O דומות מתחמי ילידים.
n-page = "1"> כדי להדגים את הפוטנציאל של אמולסיה W / O כמערכת סינון מהירה להרכבה חיובית של WSCPs עם Chls, lysates הגולמי של תאי E.coli להביע WSCPs שמש בשלב המימי של התחליב. Lysates של חיידקים שלא להביע WSCPs שימשו כביקורת שלילית. הרכבה חיובית של WSCP עם Chl הוא ציינה בקלות על ידי הצבע הירוק של השלב המימי, אבל רק ב lysates של WSCP לבטא בתאים (איור 3). טיפות המכילות lysates אלה תכונה ייחודית Chl הקרינה בתמונות מיקרוסקופ confocal. משמעות הדבר הוא כי הרכבה מוצלחת של מתחמי WSCP / Chl ניתן לאתר ישירות טיפות המים, אשר עשוי להיות הבסיס למערכות סינון מבוסס אמולסיה W / O.
איור 1: התקנת WSCP עם Chls ב W / O אמולסיות (א. E.coli להביע WSCP. כאשר התחליב מוכן, Chls מתווסף אמולסיה. לאחר כינון מחדש, טיפות מים מופרדות בשלב אורגני על ידי צנטריפוגה. (ב) W / O מערכת אמולסיה ניתן להשתמש לסינון תפוקה מהיר גבוה עבור כינון מחדש חיובי של WSCPs עם Chls. הקרינה של המתחם WSCP / Chl ניתן לאתר ישירות microdroplets מים על ידי מיקרוסקופ confocal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ספיגה ו- CD ספקטרום של WSCP / Chl קומפלקסים Apoproteins של ארבעה.גרסאות WSCP שוקמו עם עודף טוחנת פי 10 של Chl א. הספקטרום הספיג (א) היה מנורמל 1 ב 673nm עבור BoWSCP (שחור), CaWSCP (ירוק), ו RshWSCP (כחולה) ו 663nm עבור LvWSCP (אדום). אותם גורמים נורמליזציה הוחלו על CD (ב). לשכפל באישור מ -16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: סריקת קרינה מיקרוסקופית הקרנת וידאו של עצרת קומפלקס WSCP / Chl (א) SDS-PAGE של א. lysates תא BL21 coli לפני ואחרי כינון מחדש עם Chl ב תחליבי W / O. ליין 1: תאי BL21 ללא פלסמיד WSCP, מסלול 2: תאי BL21 עם PLA WSCPסמיד ללא אינדוקציה ידי IPTG, ליין 3: תאים BL21 עם הפלסמיד WSCP המושרה עם IPTG. ליין 4, 5 ו -6 הם הדגימות אותו כפי מסלולי 1, 2 ו -3, בהתאמה, אך לאחר הפרדת שלב המים מהשלב-האורגני של התחליב. aliquots הקטן של כל דגימה נוהל על ג'ל SDS-חלבון. ליין M: סמן גודל החלבון. תמונות של הדגימות לפני ואחרי הפרדת פאזות מוצגות על גבי בנתיב אחד. (ב) תמונות מיקרוסקופ Confocal של W / טיפות O מוכן עם Chl ב-שלב שמן. הטיפין על התמונה השמאלית לא מכילות חלבון כלשהו בעוד שאלו על התמונה הימנית כלולות חלבון WSCP. הקרינה היה פיקוח על 682 ננומטר. לשכפל באישור מ -16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה שלנו היתה לפתח מערכת חדשה כללית להרכבה של חלבונים מסיסים במים מחייב כלורופיל עם פיגמנטים הידרופובי. כאן זה מוצג שמערכת הכינון מחדש החדשה המבוססת על אמולסיה W / O היא גישה כללית הוכחה לעבוד להרכבת apoproteins WSCP מן כרוב ניצנים, כרובית, חזרת יפנית pepperweed וירג'יניה הביעו recombinantly ב E. coli. הנה תוצאות מוצגות מ כינון מחדש של 1 מ"ג של WSCP עם פי 10 עודף טוחן של Chl א. עם זאת אפשר גם להשתמש בריכוזים נמוכים של WSCP עבור reconstitutions ויחסי Chl / חלבון טוחנים שונים. הסכום המינימאלי של חלבון, אשר הצלחנו להרכיב תחליבי W / O היה 100 מיקרוגרם, בעוד פיגמנט יחס חלבון יכול לנוע בין 5: 1 ועד 20: 1. כמו כן, היקף שלב מימי יכול להיות וריד עד 50 μl. בעבודה זו ההרכבה של WSCP עם Chl מוצגת. עם זאת, אפשר גם להרכיבWSCP עם Chls הידרופובי אחרים, BChls ונגזרותיהם. כרגע, אנחנו בודקים את המערכת שלנו עם חלבונים פיגמנט מחייב מסיסים במים אחרים כגון FMO ו PCP.
אמנם, השיטה שלנו היא מהירה ופשוטה יש כמה שלבים קריטיים, אשר צריכים להילקח בחשבון במהלך הכנת W / O והרכבתה מחדש של WSCP עם Chl. צלוחיות זכוכית, אשר משמשים להכנת תחליב, צריך להיות נקי של חומר ניקוי. אפילו עקבות קטנים של דטרגנטים צלוחיות ישפיעו על הכנת התחליב לגרום איכות נמוכה של אמולסיה. כמו כן, הצלוחיות צריכות להיות יבשות לחלוטין. שלב קריטי אחר, אשר עלול להשפיע על יעילות הכינון מחדש, הוא פיזור ביסודיות של Chl בשלב אורגני של אמולסיה. לכן, חשוב לערבב נפח קטן מלא של Chl ב 5 מ"ל של תחליב. כמו כן, חשוב לעשות כצעדים רבים ככל שיידרש כדי לשבור אמולסיה להסיר לחלוטין שמן מינרלי משלב מים. כל עקבות של שמן מינרלים ב ph מיםASE עשוי להשפיע ניסויים נוספים.
תחליב W / O הוא גישה חלופית השיטה שהוקמה על ידי שמידט ואח '. 11, שהתבססה על משתק WSCP מתויג-שלו על עמודת כרומטוגרפיה זיקה דוגרת עם Chls. אמנם, השיטה של שמידט ואח '., הוכיחה לעבוד WSCPs השונה, זה דורש חלבונים שלו מתויגים ועלול לגרום מחייב הלא ספציפי של Chls ידי קשירה אל histidines של התג. יתר על כן, משתק חלבונים על משטח מוצק עשוי להשפיע מבנה החלבון, ובכך להשפיע על תהליך ההרכבה עם פיגמנטים. בנוסף, Chl, ששימש להרכבת WSCPs במערכת זו פורקה גם במאגר המכיל דטרגנטים או 11,12 מתנול 40%. ממיסים כאלה עלולים לגרום צבירה פיגמנט ו / או שאינם ספציפיים Chl מחייב WSCP. מערכת הכינון מחדש החדשה שלנו מבוססת על אמולסיה W / O אינה מסתמכת על משתק את החלבונים לתמיכה מוצקה. Therefoמחדש, אין תג טיהור התמזג WSCPs נדרש, חלבונים רקומביננטיים עם רצף יליד ניתן להרכיב. יתרון חשוב נוסף של שיטת W / O הוא במזעור צבירה פיגמנטים העשויים להשפיע יעילות הכינון מחדש, oligomerization והרכב פיגמנט / חלבון. הסיבה לכך היא כי הפיגמנטים הידרופובי מומסי שלב השמן והחדיר לתוך טיפות W / O מופעל על ידי המשטח הגבוה יחס נפח של האחרון. יתר על כן, מחייב נוקבים של Chls ידי WSCP לעקוף את מאז פיגמנטים הידרופובי לא יכולים לפזר בין שלבים אורגניים מימיים של התחליב. רק פיגמנטים כי הם התאספו באופן פעיל על ידי WSCP במהלך הכינון מחדש יכול להיכנס microdroplets מים של התחליב.
השיטה של רכבת WSCP עם פיגמנטים על ידי ערבוב WSCP עם תילקואיד מבודד 10 דומה למערכת אמולסיה W / O שהוצגה כאן. זה דורש דטרגנטים או ממיסים אורגניים עבור solubilizing Chls, ולא תיוג החלבונים. עם זאת, שיטת W / O ניתן להשתמש עם כל פיגמנטים כי הוא מסיס בשלב השמן ואילו השיטה הקודמת מוגבלת Chls שנמצאים באופן מקורי בממברנות תילקואיד. לכן, הרכבה עם Chl טהור או ד Chl אפשרי מן כי אלה זמינים תילקואיד כחוליות של למשל. Synechocystis PCC 6803 או Acaryochloris המרינה, בהתאמה. עם זאת, זה לא ריאלי כדי לשקם WSCP עם b Chl מאז פיגמנט זה תמיד מלווה Chl ב תילקואיד. לעומת זאת, הרכבת WSCP ב אמולסיה W / O ניתן לבדוק עם כל נגזרים טבעיים או מלאכותיים Chl, BChl או פורפירין. היא אינה דורשת שימוש ממברנות פוטוסינתטיים ובכך הוא ללא הפרעה של רכיבים חוץ-קרום כגון phycobilisome שעשוי להיות מחובר ממברנות כחוליות. השיטה W / O מוגבל רק על ידי מסיסות הפיגמנטים המצויים בשלב שמןnd ולכן מתאים להרכבת WSCP עם כל נגזרים טבעיים או מלאכותיים Chl, BChl או פורפירין.
לסיכום, הצגנו כאן שיטה כללית להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי. יתרונותיה של הודגמו על ידי האסיפה המוצלחת של Chl עם WSCPs רקומביננטי השונה מצמח Brassica כמצוין בבירור ספקטרוסקופיות תוצאות ביוכימיות. בנוסף, הדגמנו כיצד פרוטוקול האסיפה W / O ניתן להשתמש להקרנה מהירה של הרכבה מורכבות WSCP / Chl באמצעות lysates תא E.coli overexpressing WSCPs רקומביננטי ותמציות Chl גולמי. בדרך זו אנו יכולים לדלג על זמן רב שלבי חלבון טיהור והצורך לשבור תחליבים כדי להפריד את טיפות המים משלב האורגני עשויים להיות גם נמנע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין את ההרכבה ישירות טיפות מים. התחולה הכללית של השיטה החדשה עושה את זה לשימושכלי פול ללימוד cofactor מחייב והרכבה, ומנגנוני ואנרגיה אלקטרונים ההעברה קומפלקסים חלבונים-פקטור הטרנסממברני ידי עיצוב ובניית אנלוגים חלבון מסיס במים מלאכותית פשוטה שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
DN מודה תמיכה מן PEPDIODE פרויקטים FP7 האיחוד האירופי (GA 256,672) ו REGPOT-2012-2013-1 (GA 316,157), ומענק מחקר אישי (מס '268/10) מן הקרן הלאומית למדע. אנו מודים פרופ 'שמואל רובינשטיין, מבית הספר להנדסה מדעים, אוניברסיטת הרווארד, קיימברידג' מסצ'וסטס, ארה"ב שהקדשת תמונות מיקרוסקופיה confocal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochemistry. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA - Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
