Protocol
Tutte le procedure operative sono state completate in conformità con la Johns Hopkins University e il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti e le esigenze di servizio di sanità pubblica. Questo protocollo segue il Hopkins University cura e l'uso degli animali Comitato Johns, comitato istituzionale di revisione approvato le linee guida (numero di protocollo M013M490). Dati di sopravvivenza finale è stato registrato per le procedure chirurgiche descritte di seguito. Entrambi gli animali donatori e beneficiari ricevono l'anestesia di prelazione con buprenorfina a 0.1 mg / kg sc un'ora prima di un intervento chirurgico e la buprenorfina destinatario animale è ri-somministrato alla stessa dose dopo il trapianto e ri-dosato come necessario nelle prime 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
1. donatori Allograft recupero
Nota: Inizia la parte del donatore del trapianto 40 minuti prima del trapianto destinatario di minimizzare il tempo di anestesia destinatario e per facilitare un tempo di fine simultaneo o leggermente orecchioora di fine lier contro la preparazione destinatario.
- Utilizzare strumenti di microchirurgia sterili standard e guanti sterili per la procedura. Il nostro laboratorio utilizza la sterilizzazione in autoclave di strumenti di microchirurgia.
- Anestetizzare il mouse donatore (maschio) con isoflurano vaporizzatore induzione al 4%. Uso Clippers meccanici atraumatica rimuovere i capelli dalla cervicale, toracica, addominale e della regione. Posto l'animale in posizione supina e mantenere isoflurane sul 1-2% attraverso un cono naso. Garantire un'adeguata anestesia durante tutta la procedura, valutando periodicamente il riflesso di punta di ritiro pizzico.
- Prima l'incisione cutanea, ampiamente preparare il dispositivo applicando iodopovidone antisettico seguito da alcol isopropilico utilizzando un tampone di cotone sterile.
- Inizia con una incisione cutanea superficiale trasversale con le forbici in tutta la pelle cervicale e addominale. Collegare i due incisioni bilateralmente lungo le linee ascellare media.
- Utilizzando pinze microchirurgichesezionare la regione cervicale bilaterale per identificare, legare e dividere le vene giugulari esterne con 6-0 sutura di seta e forbici. Quindi, utilizzando elettrocauterizzazione dividere i muscoli sternocleidomastoideo per esporre le vene giugulari interne e le arterie carotidi comuni, a livello bilaterale. Passare una sutura 6-0 di seta sotto il lato sinistro e il lato destro carotide comune e le vene giugulari interne in modo sfuso.
NOTA: Saranno legate e divise in seguito al passaggio 1.9. - Acutamente dividere i muscoli cinghia e associati tessuto areolare sciolto, che si trova anteriori alla trachea, con le forbici per liberare i restanti allegati della regione cervicale.
- Utilizzando elettrocauterizzazione bipolare e la dissezione tagliente, dividere i pettorale muscoli principali e le clavicole per esporre i vasi succlavi e legare (6-0 sutura di seta) e dividere prossimale.
- Poi, delicatamente, afferrare ed estrarre il pene dell'animale. Lungo il dorso del pene visualizzare la vena dorsale del pene, e disinfettare laregione con alcol isopropilico. Utilizzando un ago 30 G, iniettare 30.000 unità di eparina per via endovenosa attraverso la vena dorsale e permettono al pene di rinculo indietro alla sua posizione originale. Può verificarsi perdite parziale della soluzione di eparina nel tessuto circostante.
- Utilizzando i legami di massa precedentemente posizionati intorno carotide comune e la vena giugulare interna, legare e dividere le strutture, bilateralmente.
- Successivo utilizzo forbici per rendere una incisione intraddominale trasversale. Sviscerare l'intestino per esporre la infraepatica vena cava inferiore e iniettare 2 ml di soluzione di cardioplegia fredda Euro-Collins nel infraepatica vena cava inferiore. Garantire la corretta iniezione visualizzando scolorimento del fegato e la cessazione del battito cardiaco prima di passare al passo successivo.
NOTA: la soluzione Euro-Collins è preparato nel nostro laboratorio, vedi tabella di reagenti e strumenti specifici. - Utilizzando le forbici accedono cavità intratoracica tramite un DIAFRAMMA bilateraleincisione ragmatic dall'addome esposta. Estendere l'incisione cefalica attraverso i muscoli intercostali e le costole. Riflettere parete toracica esponendo il cuore, il timo, e grandi vasi assicurando allo stesso tempo la conservazione dei vasi toracici interni lungo la parete toracica.
- Iniettare la sovraepatica vena cava inferiore con 4 ml di soluzione di cardioplegia fredda Euro-Collins.
- Identificare la radice dell'aorta e tracciare distalmente alla aorta discendente. Acutamente tagliare l'aorta discendente (conservando lunghezza massima).
- Identificare il tronco polmonare e dividere appena prossimale al suo punto di filiale (conservando lunghezza massima). Quindi, utilizzando 2 ml di soluzione di cardioplegia fredda Euro-Collins, lavare il tronco polmonare e il cuore mettendo un morbido punta del catetere di plastica nel lume del tronco polmonare.
- Utilizzando una sutura di seta 6-0, legare e sezionare la vena cava inferiore, confluenza delle vene polmonari, e rami accessorie del cava bilaterale cava superiore. Poi elevaree sezionare la cefalica cuore dagli attaccamenti lungo bronchi fusto principale e la trachea con attenzione a non inserire le vie respiratorie. Utilizzando elettrocauterio bipolare acuto e sezionare la parete toracica, il timo, e il cuore completamente liberandolo dal mouse donatore.
- Infine, tagliare la parete toracica allogenico ex vivo a una dimensione inferiore, con le forbici, che attraversa lo sterno e costae laterali, con attenzione a non interrompere i vasi toracici interni (Figura 1A). Per ridurre al minimo emorragia dopo rivascolarizzazione, utilizzare electrocauterization bipolare lungo i confini dello sterno osteomusculocutaneous.
- Posizionare il allogenico in 10 ml di freddo (4 o Celsius) soluzione Euro-Collins se il destinatario non è preparato per incasso. Tuttavia, se il destinatario è pronto per inserto, trasferire l'alloinnesto direttamente al campo operatorio destinatario.
2. Destinatario Preparazione
Nota: Per ridurre al minimo il tempo di anestesia destinatario,iniziare la preparazione destinatario in una stazione operativa separata circa 40 minuti prima del completamento del raccolto allograft donatore.
- Utilizzare un insieme separato di strumenti di microchirurgia sterili standard e guanti sterili per la procedura.
- Anestetizzare il mouse destinatario (maschio o femmina) con isoflurano vaporizzatore induzione al 4%. Utilizzando Clippers meccanici atraumatica rimuovere i capelli dalla regione cervicale e toracica destra.
- Posizionare il mouse in posizione supina e l'angolo l'arto superiore destro leggermente inferiormente formando un angolo di 110 gradi tra la testa e arto superiore destro. Mantenere l'anestesia sul 1-2% isoflurano attraverso un cono naso.
- Posizionare petrolio pomata oftalmica sugli occhi del mouse utilizzando un cotton-fioc. Prima l'incisione cutanea, ampiamente preparare il sito operatorio utilizzando iodopovidone antisettico seguito da alcol isopropilico.
- Utilizzando le forbici, fare una incisione cutanea dalla linea mediana lungo la destra bor inferioreder della mandibola e prolungare l'incisione infero lateralmente alla regione toracica destra. Utilizzando smussa con pinze microvascolari, mobilitare la vena giugulare esterna circonferenziale libero nave da tessuti molli e avventizia. Dividere tutti i rami con elettrocauterizzazione, e rimuovere il lobo destro della ghiandola sottomandibolare utilizzando dissezione tagliente e elettrocauterizzazione di spazio libero per il trapianto allogenico.
- Assicurare una lunghezza sufficiente della vena giugulare esterna per rovesciare su un bracciale, e legare la vena giugulare esterna usando una sutura 6-0 seta. Inserire la vena attraverso il lume di un bracciale pretagliati poliimmide e utilizzare un morsetto microvascolare bulldog per risolvere il complesso nave-polsino in posto. Poi con le forbici, prossimale dividere la vena giugulare esterna, Evert sopra il polsino, e fissare con una sutura in nylon 10-0. (Figura 1B)
- Dividere il muscolo sternocleidomastoideo destro con elettrocauterizzazione bipolare per esporre l'arteria carotide comune. Mob circonferenzialeilize l'arteria cefalica al distale punto più all'interno della regione cervicale. Questa operazione viene eseguita utilizzando scollamento della nave con una pinza per rimuovere tessuti molli e avventizia circostante.
- Utilizzando sutura di seta 6-0, legare e sezionare l'arteria carotide comune. Passare l'arteria attraverso il lume di un bracciale pretagliati poliimmide e fissarlo con un bulldog microvascolare morsetto più vicino possibile al toracico possibile. Dividete il vaso distale, dilatare delicatamente il recipiente con un dilatatore microchirurgico, Evert sopra il polsino, e fissare con una sutura in nylon 10-0. (Figura 1B)
NOTA: Il dilatatore microchirurgica specifico è descritto nella tabella di reagenti e strumenti specifici.
3. Allograft dell'inserzione
- Mantenere la strumentazione sterili standard guanti sterili per posizionare il allotrapianto all'interno della regione cervicale destinatario in un testa in giù e posizione obliqua.
- Quindi, posizionare il aor donatore discendentelumen tic sul costrutto bracciale arteriosa del destinatario e fissarlo con una sutura di nylon 10-0 (Figura 1C e 1D).
- Moda la stessa anastomosi come al punto 3.2 tra l'arteria polmonare donatore e il estroflesso esterna giugulare vena-polsino costrutto del mouse destinatario (Figura 1C e 1D).
- Innanzitutto rimuovere morsetto microvascolare venoso (morsetto vena giugulare esterna) e poi allentare il blocco arterioso (arteria carotide comune morsetto). Durante la riperfusione arteriosa, controllare la totalità del allogenico di affrontare qualsiasi emorragia. Se emorragia viene visualizzato, riapplicare la pinza arteriosa per ridurre al minimo la perdita di sangue e ridurre la fonte di sanguinamento con elettrocauterizzazione bipolare.
- Controllare l'innesto e di garantire l'emostasi. Rilasciare e rimuovere completamente il morsetto microvascolare arteriosa. Osservare il cuore a mostrare segni di riperfusione, che saranno istantaneamente apparente con l'espansione del volume rapida delle camere cardiache, e attendere bmangiare per iniziare entro 0,5-1 min. Utilizzare salina calda (35 ° C) per inumidire il cuore.
- Telo parete toracica in posizione anatomica in modo da non indurre alcuna attorcigliamento o tensioni sui anastomosi. Chiudere la pelle della ferita chirurgica sta usando 6-0 punti di sutura in nylon continui (Figura 1E).
4. Cura postoperatoria
- Somministrare un 0,3 ml di soluzione salina normale bolo fluido intraperitoneale immediatamente dopo l'intervento per la sostituzione del fluido.
- Poi via sottocutanea iniettare buprenorfina (0,1 mg / kg) e enrofloxacina (5mg / kg) per la profilassi del dolore e infezione, rispettivamente.
- Posto l'animale sotto una lampada di calore fino risveglio dall'anestesia e tornare al decubito sternale. Durante il recupero, ispezionare il collo per visualizzare il battito cardiaco fibrillazione del allotrapianto garantire un'adeguata perfusione allogenico.
- Una volta sveglio e in posizione supina, restituire il mouse in una gabbia separata (senza la compagnia di altri topi) Dove riceva cibo e acqua ad libitum. A causa di qualsiasi movimento restrittiva minore temporanea del arto superiore destro, lasciare una fonte di cibo gelatina sul pavimento della gabbia.
- Osservare il mouse destinatario per 1 ora dopo l'intervento e poi tornare alla struttura gabbia dove possa ricevere cibo e acqua ad libitum e viene ispezionato tre volte al giorno per le prime 24 ore di attività e di apporto nutrizionale. Monitorare i topi per i segni di dolore e di angoscia e ri-dosaggio con buprenorfina (0.1mg / kg) per via sottocutanea due volte al giorno come necessario per la prima 72 ore. Esaminare gli animali ogni giorno da allora in poi e pesare ogni settimana.
- Consultare un membro del personale veterinario, se eventuali topi mostrano segni di dolore, angoscia, o diminuito l'assunzione di cibo. Considerare presto l'eutanasia (nel nostro protocollo la tecnica eutanasia impiega CO 2 overdose per 7 minuti, seguita da dislocazione cervicale).
- Cessazione del battito cardiaco allogenico è definito come un endpoint specifico spingendo il mouse per essere sacrificed.
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Representative Results
Singenico C57BL / 6 trapianti raggiunto sopravvivenza a lungo termine. Il disegno del eterologo (Figura 1) si sono dimostrati efficaci da una prospettiva di sopravvivenza degli animali e la capacità di valutare la sopravvivenza allograft corso. Questo è stato dimostrato attraverso la pelle sovrastante rimanente praticabile, crescita attiva dei capelli allogenico in corso, e battiti cardiaci sono stati in grado di valutare con la visualizzazione e il dito palpazione. Dati di sopravvivenza è rappresentata in Figura 2 per singenici topi trapiantati. Il tempo di sopravvivenza medio è stato superiore a 109 giorni. Sulla base dei dati di sopravvivenza, è ragionevole concludere che l'aspetto tecnico del allotrapianto trapiantato è progettato per perfusione l'interezza della parete toracica, timo, e il cuore. Inoltre, la capacità degli animali singenici per sopravvivere lungo termine sostiene inoltre che questo modello di topo non solo è possibile, ma può essere replicata. Questo proof-of-concept en parete toracica in blocco, il timo, e trapianto di cuore convalida °e modello murino di studio combinato organo solido e vascolarizzato allotrapianto composito.
Figura 1. fotografie intraoperatorie. (A) La parete toracica, il timo, e allotrapianto cuore recuperati con successo, tagliati, e visualizzati ex vivo dalla faccia posteriore. I vasi toracici interni bilaterali sono conservati. (B) Il destinatario esterno vena giugulare (freccia) e arteria carotide comune (punta di freccia) sono estroflesso fisso sopra i polsini poliimmide in preparazione per anastomosi vascolare. (C) per alloinnesto anastomosi vascolari sono stati completati. La freccia indica la anastomosi tra l'arteria polmonare donatore e il ricevente vena giugulare esterna. La freccia indica la anastomosi tra l'aorta discendente donatore e il ricevente carotide comune. L'asterisco indica il timo e la parete toracica riflessa viene visualizzata overlying il timo. (d) Un maggiore ingrandimento mostra i anastomosi microvascolare-polsino. (e) Completo allotrapianto inserto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. En bloc parete toracica, il timo, e il cuore la sopravvivenza dell'organo trapiantato di Kaplan-Meier curve di sopravvivenza della parete toracica blocco, timo, e allotrapianto cuore in singenici C57BL / 6 topi it (n = 3;. Tempo medio di sopravvivenza è stato superiore a 109 giorni). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono una moltitudine di fenomeni che fattore nella ricerca immunologica di allotrapianto, che includono ma non sono limitati a meccanismi di rigetto acuto e cronico, la presentazione diretta e indiretta dell'antigene, destinatario di sensibilizzazione o l'induzione di chimerismo misto. 19 modelli animali sono diventati il gold standard per lo studio di Immunologia dei Trapianti, e modelli di topo sono comunemente implementate a causa del loro basso costo, la disponibilità di transgenici e gene topi knockout, anticorpi monoclonali disponibili in commercio, relativa diminuzione veterinari e delle abitazioni richieste, e la facilità di replica. Fino ad oggi, più modelli trapianto di cuore sono stati progettati per studiare il trapianto di organi solidi. 19,22-27 Allo stesso modo, una pletora di modelli murini sono stati sviluppati per studiare vascolarizzati allotrapianto composito. 28 Tuttavia, lo studio di organo solido combinato e vascolarizzata allotrapianto composito è limitato,e le tecniche devono ancora essere stabilite nei topi. La parete toracica blocco, timo, e trapianto di cuore modello murino it qui presentato è uno strumento affidabile e replicabile per studiare gli effetti e dei meccanismi immunologici di organo solido combinato e vascolarizzato allotrapianto composito.
Per avanzare ulteriormente il campo dei trapianti, la promessa di prolungare la sopravvivenza dell'organo trapiantato e ridurre al minimo l'immunosoppressione attraverso nuove modalità di trattamento deve essere perseguito. Un tale approccio è attraverso l'induzione di chimerismo misto (attecchimento parziale delle cellule ematopoietiche del donatore nel ricevente), che può portare a donatore tolleranza specifiche senza immunosoppressione, anche se in alcuni casi chimerismo non è sostenuta. 29,30 midollo osseo trasfusione / trapianto di organi solidi in coppia con 31 o vascolarizzato allotransplanation 32,33 composito richiede una precondizionamento costituiscono una sfida significativa. Vascolarizzato midollo osseo, unas parte di un vascolarizzato allogenico costrutto composito, in grado di aggirare questo problema. Vascolarizzato trapianto di midollo osseo consente il trasferimento ininterrotto di cellule del midollo osseo del donatore nel microambiente donatore conservato, ed è considerato essere superiore a cellulare trapianto di midollo osseo, solo l'induzione di tolleranza e riduzione del fabbisogno immunosoppressione. 34-36 Inoltre, l'incorporazione del tessuto del timo con vascolarizzato trapianto di midollo osseo ha dimostrato di aumentare il chimerismo cellule T del donatore di origine in ultima analisi, giocando un ruolo di supporto nel induzione e mantenimento di chimerismo. 2,9 Le strategie di cui sopra di prolungare la sopravvivenza dell'organo trapiantato e minimizzando immunosoppressione è stata la fondazione di concettualizzare un organo solido combinato, il timo, e vascolarizzato modello di topo allotrapianto composito.
Il eterotopico en parete toracica in blocco, il timo, e il trapianto di cuore è un amalgama di molteplici suomodelli animali torical. Trapianto di cuore eterotopico cervicale con un polsino non sutura nei topi è stato ben definito e considerato meno tecnicamente impegnativo di un trapianto di cuore eterotopico addominale microvascolare. 19, infatti, la tecnica di bracciale è stato implementato in diversi altri modelli di trapianto animale. 37-44 Heterotopic Il trapianto dello sterno nei ratti è stato introdotto nel 1999 da Santiago et al. come metodo alternativo per studiare vascolarizzato trapianto di midollo osseo. 1 Sono stati in grado di mostrare chimerismo lungo termine periferica, la tolleranza e la sopravvivenza dopo la sospensione della terapia immunosoppressiva in giorno postoperatorio 30. 1 Bozkurt et al., successivamente ha sviluppato un modello di ratto nel 2013 per incorporare il timo e la piena portata della porzione osteomyocutaneous della parete toracica. Va notato, tuttavia, che questo modello differisce dal nostro modello in molteplici aspetti. Questo comprende: (1) il loro modello sia priva di solidiorgani, (2) essendo completata in ratti utilizzando tecniche tradizionali di microchirurgia, (3) legatura dei vasi toracici interne durante il raccolto donatore, (4) l'attuazione di un unilaterale singolo peduncolo tramite una carotide comune e la vena giugulare esterna, e (5 ) trapianto di eterologo nella regione inguinale. 2 Tuttavia, il modello era in grado di dimostrare che il timo del donatore origine gioca un ruolo significativo non solo per chimerismo aumento ma anche per la manutenzione chimerismo rispetto al trapianto di midollo osseo vascolarizzato sola. 2 modelli suine successive di co-trapianto del timo e del cuore hanno mostrato un effetto superiore sulla sopravvivenza trapianto di cuore. 10,11 i vantaggi di ciascuno dei modelli animali, ma la mancanza di meccanicistica studi in vivo pertinenza organo solido combinato, timo e vascolarizzato allotrapianto composito ha spinto il nostro gruppo di progettare questo modello.
L'esperienza dell'executing questo romanzo modello esposto certe lezioni che richiedono la nostra squadra di istituire modifiche al fine di ottenere una migliore sopravvivenza degli animali. Questo modello ha tentato con un solo operatore, che alla fine ha prolungato il tempo operatorio e l'anestesia a più di 3-4 ore e anche prolungato il tempo di ischemia fredda. Gli animali non si svegliava al termine del procedimento. Implementazione di un approccio in due team di tagliare il tempo operatorio e l'anestesia totale a 90 min. Ciò ha rispecchiato in 60 min tempo di anestesia del mouse destinatario e 0-10 min allogenico tempo di ischemia fredda. Durante allogenico riperfusione, il mouse è suscettibile di emorragia, che può limitare la sua capacità di sopravvivenza nell'immediato peri-operatorio. Sosteniamo l'ispezione meticolosa del allotrapianto ex vivo di potenziali fonti di emorragia, così come dolce rilascio del morsetto bulldog microvascolare durante allotrapianto riperfusione. Inserendo eterologo in posizione riflessa è più facile identificare i siti specifici disanguinamento. Inoltre, questa posizione dell'innesto inserto favorisce la disposizione più ergonomica dei vasi minimizza il rischio di attorcigliamento recipiente. Infine, con il primo 48 ore di recupero, giusta gamma estremità superiore del topo ricevente di movimento può essere impedito per quanto riguarda la gabbia arrampicata per ottenere cibo e acqua. Pertanto, si consiglia il posizionamento delle fonti alimentari di gelatina lungo la gabbia per facilitare apporto nutrizionale. In genere per giorno postoperatorio 3, gamma completa di movimento viene restituito entro il arto superiore destro.
Anche se ci sono limitazioni per questo modello, che comprendono la necessità di competenze tecniche in microchirurgia, disponibilità di due microscopi simultanei, e l'esigenza di un approccio in due squadra, ha comunque dimostrato di essere un approccio di successo per eseguire studi immunologici meccanicistici legati alla organo solido combinato e vascolarizzato allotrapianto composito. La sua applicazione più ampio potrebbe contribuire ulteriormente a sviluppare nuovi immunprotocolli osuppressive, studiando meccanismi di rigetto acuto e cronico, e l'attuazione di possibili strategie per indurre e sostenere chimerismo, e prolungare la sopravvivenza dell'organo trapiantato.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euro-Collins Solution | The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose. |
||
| Suture | Ethilon | MWI 72667 | 6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies) |
| Polyimide Cuff Vein (21G) | Vention Medical | 141-0043 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Polyimide Cuff Artery (24G) | Vention Medical | 141-0027 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Soft plastic tip catheter | Terumo | SR*OX2419CA | 24G x 3/4" |
| Microsurgical dilator | S&T | D-5a.1 | Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d |
References
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