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Immunology and Infection

प्रोबायोटिक खमीर के परिवर्तन और जठरांत्र इम्यून ऊतकों से उनके वसूली चूहे में मौखिक Gavage के बाद

Published: February 8, 2016 doi: 10.3791/53453
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Summary

यहाँ प्रस्तुत तकनीकों कि, विकसित करने के लिए बदलने, प्रशासन, और प्रोबायोटिक खमीर Saccharomyces boulardii की heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति का परीक्षण किया जा सकता है के लिए एक एकीकृत वर्णन है।

Introduction

प्रोबायोटिक सूक्ष्मजीवों कुशलतापूर्वक और आर्थिक रूप से जठरांत्र संबंधी मार्ग को heterologous प्रोटीन पहुंचाने की एक साज़िश संभावित साधन हैं। इन जीवों जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से पारित होने के जीवित रहने का अभी तक यह 1 उपनिवेश नहीं है, नियंत्रित खुराक सक्षम करने और जोखिम को सीमित करने के लिए दवा व्यक्त करने में सक्षम हैं। इसके अलावा, आसानी से इन जीवों इंजीनियर करने के लिए बड़े पैमाने पर heterologous प्रोटीन उत्पादन करने की क्षमता उनमें सिंथेटिक वितरण कणों के लिए एक किफायती विकल्प प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण के विकास, के रूप में हाल ही में boulardii 2 प्रोबायोटिक खमीर Saccharomyces की एक auxotrophic तनाव का उपयोग का प्रदर्शन किया, प्रयोगशाला तकनीक पारंपरिक रूप से एक दिए गए अध्ययन के भीतर संयुक्त नहीं, खमीर और आणविक जीव विज्ञान से जानवर से निपटने की तकनीक और तरीकों को लेकर प्रतिरक्षा के ज्ञान की आवश्यकता है। इस प्रकार, हालांकि अलग-अलग वर्णित प्रक्रियाओं को खुद में उपन्यास नहीं हैंप्रयोगशाला प्रोटोकॉल, इस पांडुलिपि के लक्ष्य murine जठरांत्र संबंधी मार्ग के लिए दवा वितरण वाहनों के रूप में प्रोबायोटिक खमीर के प्रायोगिक परीक्षण के लिए आवश्यक तकनीक के लिए एक एकीकृत परिचय प्रस्तुत करने के लिए है। परंतु लिए आवश्यक प्रोटोकॉल का एक संकलन है: 1) खमीर की auxotrophic उत्परिवर्ती उपभेदों कि आनुवंशिक रूप से आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती की पीढ़ी; 2) खमीर संस्कृतियों के परिवर्तन heterologous प्रोटीन व्यक्त करने के लिए; 3) मौखिक gavage के माध्यम से आंत के लिए पुनः संयोजक खमीर के प्रशासन; और 4) murine आंत और उनके heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के आकलन से व्यवहार्य पुनः संयोजक प्रोबायोटिक खमीर की वसूली।

सबसे पहले, हालांकि कई सकारात्मक और नकारात्मक चयन के तरीकों खमीर प्रजातियों के हेरफेर के लिए मौजूद हैं, ऐसे auxotrophic मार्कर के उपयोग के माध्यम के रूप में नकारात्मक चयन दोनों दक्षता और जिसके साथ खमीर बदल दिया है और चयनित किया जा सकता आसानी बढ़ जाती है। एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर transformants की सकारात्मक चयन, सह मेंntrast, काफी खमीर में गड़बड़ी की लागत बढ़ जाती है। इसके अलावा, एंटीबायोटिक युक्त ठोस मीडिया पर खमीर का चयन सिंथेटिक ड्रॉप आउट ठोस मीडिया (अप्रकाशित टिप्पणियों) पर auxotrophic खमीर के चयन के सापेक्ष untransformed पृष्ठभूमि कालोनियों की वृद्धि हुई वृद्धि के लिए अनुमति दे सकते हैं। Auxotrophic खमीर उपभेदों जो आवश्यक अमीनो एसिड या uracil के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण एंजाइमों की कमी है। ऐसे खमीर केवल विकसित कर सकते हैं, तो याद आ रही मेटाबोलाइट या चयापचय जीन के साथ पूरक है, इस प्रकार नकारात्मक चयन को सक्षम करने के लिए जब खमीर बाहर मीडिया सिंथेटिक ड्रॉप है कि आवश्यक मेटाबोलाइट का अभाव है पर चढ़ाया जाता है। कई आमतौर पर इस्तेमाल Saccharomyces cerevisiae प्रयोगशाला उपभेदों पहले से ही auxotrophic म्यूटेंट 3 वास्तव में कर रहे हैं। औद्योगिक, नैदानिक, और प्रोबायोटिक खमीर में तनाव, हालांकि, आम तौर पर सभी आवश्यक पोषक तत्वों के संश्लेषण के लिए क्षमता के साथ prototrophic हैं। ऐसे खमीर के अधिक कुशल आनुवंशिक हेरफेर सक्षम करने के लिए, auxotrophic जीन चुनिंदा लक्षित किया जा सकताउपभेदों कि एंटीबायोटिक दवाओं के बिना उत्पन्न करने के लिए चुना जा सकता है। 6 - auxotrophic मार्कर जीन की विशिष्ट लक्ष्यीकरण पीसीआर की मध्यस्थता जीन व्यवधान CRISPR / Cas9 को निशाना बनाने से 4 मुताबिक़ पुनर्संयोजन या अधिक हाल ही में पर भरोसा कर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यूवी mutagenesis जल्दी खमीर उपभेदों कई plasmids के साथ जो परिवर्तन के लिए तकनीकी रूप से कठिन 7 में भी auxotrophic म्यूटेंट उत्पन्न कर सकते हैं। पीसीआर लक्ष्यीकरण और CRISPR / Cas9 बड़े पैमाने पर कहीं वर्णित किया गया है, भाग में प्रस्तुत इस पांडुलिपि की एक विस्तृत एक यूवी mutagenesis दृष्टिकोण auxotrophic उपभेदों कि खमीर transformants की सकारात्मक एंटीबायोटिक चयन के बजाय नकारात्मक चयन के लिए अनुमति देगा बनाने के लिए का वर्णन प्रोटोकॉल है।

heterologous प्रोटीन की मौखिक प्रसव के लिए इस तरह के auxotrophic उपभेदों के उपयोग में अगले आवश्यक कदम प्लास्मिड डीएनए के साथ खमीर परिवर्तन है। yeas का पहला सफल परिवर्तन के बादटी स्फेरोप्लास्ट 1,978 8 में Saccharomyces cerevisiae के लिए सूचना दी, कई संशोधनों दक्षता बढ़ाने के लिए और कम करने खमीर प्रजातियों के साथ जो आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता करने के लिए विशेषता किया गया है। एस में डीएनए के सफल परिवर्तन के लिए electroporation का प्रयोग cerevisiae पहली बार 1985 9 में वर्णित किया गया था और तब से osmotically समर्थन कोशिकाओं 10 1 एम सोर्बिटोल ऊष्मायन के अलावा के माध्यम से सुधार किया गया है। Electroporation दक्षता इसके अलावा खमीर प्रजातियों और तनाव, सेल नंबर और विकास के चरण, electroporation मात्रा क्षेत्र की ताकत, और विशिष्ट बफ़र्स 11 पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया है। के रूप में यह कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है लिथियम एसीटेट (LiOAc) परिवर्तन, मूल इतो एट अल। 12 से वर्णित है, सबसे अधिक इस्तेमाल परिवर्तन प्रोटोकॉल के बीच है। अतिरिक्त विश्लेषण से पता चला कि LiOAc खमीर परिवर्तन की क्षमता में काफी बढ़ जाती है जब कोशिकाओं मध्य लॉग चरण में एकत्र कर रहे हैंविकास की और गर्मी 42 डिग्री सेल्सियस 12 में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और डीएनए की उपस्थिति में हैरान हैं। खूंटी के साथ पूरे बरकरार खमीर की ऊष्मायन संभवतः कोशिका झिल्ली के लिए डीएनए की कुर्की में सुधार के माध्यम के रूप में अच्छी तरह से झिल्ली 13 पर अन्य प्रभाव के माध्यम से कुशल परिवर्तन के लिए आवश्यक है। लिथियम खुद भी बरकरार कोशिकाओं 14 की पारगम्यता बढ़ जाती है। हालांकि सबसे प्रयोगशाला एस cerevisiae उपभेदों आसानी से LiOAc परिवर्तन 3 का उपयोग तब्दील किया जा सकता है, अन्य प्रजातियों खमीर और अधिक कुशलता से वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग तब्दील किया जा सकता है। Pichia pastoris, उदाहरण के लिए, सबसे अधिक कुशलता से electroporation बजाय LiOAc परिवर्तन से 13 के माध्यम से बदल रहा है। यह महत्वपूर्ण है, इसलिए, कई परीक्षण करने के लिए परिवर्तन के तरीकों और जब करने के प्रयास में आनुवंशिक रूप से संशोधित एक uncharacterized खमीर तनाव ऊष्मायन अवधि और अभिकर्मक सांद्रता अनुकूलन करने के लिए। यह पांडुलिपि इस प्रकार दोनों LiOAc टीआर का वर्णनansformation और auxotrophic उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार एस के परिवर्तन के लिए तकनीक के रूप में electroporation boulardii। इच्छुक पाठकों खमीर परिवर्तन, वैकल्पिक प्रोटोकॉल, और कार्रवाई 13,15 के संभावित तंत्र के आगे की चर्चा के विकास के लिए पूरी तरह से विवरण के लिए हाल ही में समीक्षा करने के लिए निर्देशित कर रहे हैं। प्लाज्मिड एक आसानी से पहचाने जा प्रोटीन एन्कोडिंग के साथ खमीर के परिवर्तन के लिए उचित अभिव्यक्ति और heterologous प्रोटीन के समारोह सुनिश्चित करने के लिए नीचे की ओर परीक्षण के लिए इसके अलावा आवश्यक है। असंख्य विभिन्न प्रोटीन चिकित्सीय अध्ययन का परम उद्देश्य और immunoblotting, एलिसा, और अन्य तकनीकों से एंटीबॉडी प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपलब्ध के आधार पर चुना जा सकता है। इन तकनीकों के लिए प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से अन्यत्र 16,17 वर्णित किया गया है, और मानक घटता की तुलना द्वारा तब्दील खमीर से heterologous प्रोटीन के उत्पादन के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रदर्शन के और दिखाने के लिए प्रयोजनों के लिएखमीर जीव विज्ञान में एक बहुत अधिक इस्तेमाल किया प्रोटीन के सफल उत्पादन, इस पांडुलिपि प्लाज्मिड एन्कोडिंग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) है, जो बाद में पता लगाने के लिए अनुमति देता है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग के साथ परिवर्तन प्रस्तुत करता है।

समान रूप से प्रोबायोटिक जीवों कि अभिव्यक्त भागों तीन और चार में वर्णित के रूप में heterologous प्रोटीन, उचित प्रशासन और जठरांत्र ऊतकों के भीतर इन सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। मौखिक gavage के माध्यम से पुनः संयोजक खमीर का प्रशासन सीधे पेट, जिसमें से C57BL / 6 चूहों स्वाभाविक रूप से 18 उल्टी के काबिल नहीं हैं में खमीर की नियंत्रित मात्रा के वितरण के लिए अनुमति देता है। हालांकि, अनुचित जानवर से निपटने और gavage esophageal नुकसान और वेध, गैस्ट्रिक वेध, सांस की नली प्रशासन, और आकांक्षा निमोनिया 19,20 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। गरीब तकनीक और अनुभवहीनता इसके अलावा murine प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रयोगात्मक resu में परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैंएलटीएस, जो मौखिक gavage 21,22 पर पशु तनाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है। उचित तकनीक में अभ्यास इस प्रकार न केवल पशु असुविधा attenuate कर सकते हैं, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक परिणामों की शुद्धता को बढ़ा सकते हैं। इस पांडुलिपि का वर्णन करता है और पुनः संयोजक खमीर की नियंत्रित खुराक के प्रशासन के लिए जानवर से निपटने और मौखिक gavage को दर्शाता है।

अंत में, यह खमीर और heterologous प्रोटीन की उपस्थिति के लिए लसीकावत् ऊतकों का विश्लेषण करके पुनः संयोजक खमीर के सफल प्रसव पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। जठरांत्र प्रतिरक्षा ऊतकों जो सबसे अधिक आसानी से और जाहिर है खमीर की उपस्थिति के लिए जांच की जा सकती Peyer पैच रहे हैं। Peyer पैच कि श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरण 23 के प्रमुख साइटों रहे हैं छोटी आंत के साथ माध्यमिक लसीकावत् अंग हैं। लुमेन से एंटीजन transcellularly microfold के माध्यम से (एम) उपकला कोशिकाओं में स्थानांतरित कर रहे हैं और Peyer पैच में जारी किया जाता है, इस प्रकार उजागर लगा देनाडी प्रतिजन कोशिकाओं पेश ल्यूमिनल सामग्री आंतों के लिए। हालांकि आंतों उपकला भर कण तेज भी जाम कोशिकाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, इन कोशिकाओं को केवल ऊपर ले कणों कम से कम व्यास 24 में 0.02 माइक्रोन के लिए दिखाया गया है। Transepithelial डेन्ड्राइट CD103 + वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) भी 25 लुमेन आंतों से छोटे कणों को लेने से बढ़ाया; हालांकि, वर्तमान में प्रदर्शित किया कि CD103 + डीसी बैक्टीरिया से बड़ा कणों को ले कोई रिपोर्ट कर रहे हैं। इस प्रकार, अक्षत प्रोबायोटिक खमीर, व्यास में 3-6 माइक्रोन के बीच औसत आकार के, सबसे एम कोशिकाओं द्वारा हाथ में लिया और Peyer पैच को हस्तांतरित करने की संभावना है। यहाँ वर्णित है, हालांकि इस प्रक्रिया को भी आसानी से प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के तेज के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, संग्रह और व्यवहार्य पुनः संयोजक खमीर के लिए Peyer पैच की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल है।

सारांश में, के वितरण के लिए पुनः संयोजक प्रोबायोटिक खमीर का आकलनआंत के लिए rapeutic प्रोटीन जानवर से निपटने और इम्यूनोलॉजी के लिए आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में फैले तकनीक में दक्षता की आवश्यकता है। 1 के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं प्रोटोकॉल) पीढ़ी और auxotrophic खमीर उपभेदों की स्क्रीनिंग जो आसानी से नकारात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के बिना चुना जा सकता है, 2) वैकल्पिक प्रोटोकॉल खमीर बदलने और heterologous प्रोटीन की अभिव्यक्ति सक्षम करने के लिए, 3) उचित जानवर से निपटने के लिए तकनीक और मौखिक gavage के प्रदर्शनों पुनः संयोजक खमीर की intragastric वितरण, और Peyer पैच विच्छेदन के लिए 4) प्रोटोकॉल और व्यवहार्य पुनः संयोजक खमीर और कार्यात्मक heterologous प्रोटीन के लिए स्क्रीनिंग। संयुक्त, इन प्रोटोकॉल पीढ़ी और एक प्रोबायोटिक खमीर जठरांत्र संबंधी मार्ग को heterologous चिकित्सीय प्रोटीन देने में सक्षम तनाव के परीक्षण के लिए अनुमति देगा।

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Protocol

1. यूवी mutagenesis Auxotrophic खमीर उपभेदों उत्पन्न करने के लिए

  1. पराबैंगनी विकिरण खुराक की जरूरत निर्धारित करने के लिए अस्तित्व घटता उत्पन्न
    1. मानक प्रक्रियाओं के अनुसार 26 YPD (खमीर निकालने peptone डेक्सट्रोज) मीडिया और अन्य 1 टेबल में सूचीबद्ध अभिकर्मकों तैयार है और YPD मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में एकल कालोनियों टीका लगाना। 30 डिग्री सीओ / एन पर एक रोलर ड्रम पर संस्कृतियों सेते हैं कम से कम 8 घंटे के लिए संतृप्ति के लिए।
    2. कोशिकाओं को एक प्लास्टिक क्युवेट में पानी 1:10 गिराए द्वारा एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग हे / एन संस्कृतियों का सेल एकाग्रता का निर्धारण। 20 मिलीलीटर बाँझ आसुत जल में 10 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं पतला।
    3. एक बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश में पतला कोशिकाओं डालो और, ढक्कन के साथ हटा दिया, एक यूवी बल्ब नीचे प्लेट 14 सेमी जगह है।
    4. ऐसी है कि प्रत्येक वेतन वृद्धि निम्नलिखित सीरियल 5,000 μJ करने के लिए कोशिकाओं और पराबैंगनी विकिरण के 10,000 μJ खुराक, कोशिकाओं के 500 μl निकालने का पर्दाफाश कोशिकाओं0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ 25,000 μJ, 30,000 μJ, 40,000 μJ, और 50,000 यूवी की μJ विकिरण के लिए जोखिम के बाद जांचा जाता है। स्थानांतरण निकाले सेल के नमूने 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों बाँझ और क्रमानुसार बाँझ पानी 1:10 वेतन वृद्धि पर पतला।
    5. 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर एक microcentrifuge में centrifugation द्वारा प्रत्येक कमजोर पड़ने में गोली कोशिकाओं। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और खमीर कोशिकाओं चढ़ाना के लिए बाँझ पानी का एक उचित मात्रा 100 μl में resuspend। YPD ठोस मीडिया वाले प्लेटों पर resuspended कोशिकाओं की पूरी मात्रा पिपेट और एक बाँझ स्प्रेडर का उपयोग समान रूप से प्रत्येक थाली भर में कोशिकाओं को वितरित करने के लिए।
    6. Parafilm में लपेटें प्लेट किनारों तस्वीर-पुनर्सक्रियन और यूवी प्रेरित म्यूटेशन की मरम्मत को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में मीडिया और कवर प्लेटों के सूखने को रोकने के लिए। प्लेटें सेते उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए व्यवहार्य खमीर कालोनियों (चित्रा 1) के विकास के लिए अनुमति देने के लिए।
    7. कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा गणनाकालोनियों के आर, वैकल्पिक रूप से गिना कालोनियों बंद चिह्नित करने के लिए एक पेन की मदद से, एक हाथ पकड़ा इलेक्ट्रॉनिक काउंटर कलम, या एक काउंटर के साथ बढ़ाई साथ खड़े हो जाओ। पराबैंगनी विकिरण से प्रत्येक μJ खुराक पर कुल चढ़ाया कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में प्लॉट विकिरणित खमीर (चित्रा 2) के लिए एक अस्तित्व की अवस्था उत्पन्न करते हैं।
      नोट: अगुणित खमीर उपभेदों द्विगुणित उपभेदों के लिए पराबैंगनी विकिरण के रिश्तेदार की कम मात्रा की आवश्यकता के लिए ही अस्तित्व प्रतिशत तक पहुंचने की उम्मीद की जा सकती है। खमीर की एक ऐसी तनाव rad1 एस के रूप में कार्य डीएनए की मरम्मत एंजाइमों, कमी cerevisiae उत्परिवर्ती, बहुत कम मात्रा में पराबैंगनी विकिरण की उपस्थिति का संकेत एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    8. यूवी mutagenesis की खुराक निर्धारित अस्तित्व वक्र 1.1.7 में स्थापित करने के लिए चर्चा करते हुए जांच के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। अस्तित्व की अवस्था जहां y 50 के बराबर होती है साथ बिंदु के एक्स मूल्य पराबैंगनी विकिरण खुराक, जिस पर खमीर के 50% के जीवित रहने के लिए है। इस कम प्रतिशत अस्तित्व में म्यूटेंट स्क्रीनिंग एक में हो सकता हैसफलतापूर्वक उत्परिवर्तित उपभेदों के उच्च उपज, विशेष रूप से द्विगुणित खमीर के लिए। गुम्मट एस के लिए 50% अस्तित्व खुराक boulardii, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है, लगभग 18,000 μJ है।
      नोट: हालांकि इस तरह के उच्च यूवी खुराक ब्याज की auxotrophic मार्कर जीन के अलावा अन्य सेलुलर रास्ते के लिए जीन में म्यूटेशन के खतरे को बढ़ा, इस खामी auxotrophic मार्कर जीन की दोनों प्रतियों में म्यूटेशन के लिए प्रेरित करने की जरूरत के खिलाफ संतुलित होना चाहिए। इस तरह के 90% से कम के रूप में अगुणित उपभेदों, जिसमें केवल एक ही जीन उत्परिवर्तित प्रतिलिपि किया जाना चाहिए, एक उच्च प्रतिशत अस्तित्व में स्क्रीनिंग के लिए, अतिरिक्त म्यूटेशन का खतरा कम हो जाती है और अभी भी auxotrophic म्यूटेंट का पर्याप्त उत्पादन के लिए अनुमति देता है।
  2. यूवी mutagenesis और auxotrophic खमीर उपभेदों के लिए स्क्रीनिंग
    1. कदम 1.1.1-1.1.3 में वर्णित के रूप में खमीर तैयार करें।
    2. 50% अस्तित्व के लिए इसी पराबैंगनी विकिरण की खुराक के लिए खमीर का पर्दाफाश, 1.1.8 में चुना गया है। गुम्मट एस के लिए boulardii, इस खुराक वानिर्धारित एस लगभग 18,000 μJ (चित्रा 2) होने के लिए।
    3. लीजिए यूवी के 1 मिलीलीटर की मात्रा में खमीर और गोली 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर एक microcentrifuge में centrifugation द्वारा किरणित। 100 μl बाँझ पानी में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं।
      1. म्यूटेंट का चयन
        1. ऐसे ura3 साथ के रूप में चयन का उपयोग करते हैं - auxotrophic म्यूटेंट, प्लेट एक कार्यात्मक Ura3 एंजाइम की कमी कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए 5-fluoroorotic एसिड (5 FOA) युक्त मीडिया पर खमीर किरणित।
          नोट: Ura3 के कार्यात्मक प्रतियां युक्त किसी भी खमीर, विष 5-फ्लूरोरासिल 5-FOA में परिवर्तित कर देंगे कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी और ura3 की आसान चयन के लिए अनुमति देता है - कालोनियों कि एक कार्यात्मक Ura3 27 की कमी है। TRP1; α-एमिनोअडिपिक एसिड युक्त मीडिया का उपयोग और 28 MET2 और MET15 मार्कर के अनुरूप चयन दृष्टिकोण LYS2 और LYS5 के लिए संभव हो रहे हैं; 5-फ्लोरोanthranilic एसिड 29; और मिथाइल पारा 30,31, क्रमशः।
        2. 5-FOA युक्त कम से कम मीडिया पर resuspended कोशिकाओं के 100 μl पिपेट और एक बाँझ प्रसारित करने के लिए समान रूप से कोट प्लेट का उपयोग करें। Parafilm में लपेटें प्लेटें और उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए सेते व्यवहार्य खमीर कालोनियों के विकास के लिए अनुमति देने के लिए।
        3. YPD, uracil पर restreaking द्वारा 5-FOA प्लेटों पर आने वाले किसी कॉलोनी के phenotype - - ura3 की पुष्टि करें और 5 FOA प्लेट (चित्रा 3)। एक भी कॉलोनी का हिस्सा इकट्ठा करने के लिए एक बाँझ दंर्तखोदनी की नोक का प्रयोग करें और धीरे ताजा YPD, uracil भर में कोशिकाओं को खींचें -, और 5 FOA प्लेटें। फिर लिपटे प्लेटों सेते उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए।
          नोट: के रूप में उठाया, मोटे तौर पर परिपत्र वृद्धि व्यवहार्य कालोनियों दिखाई देगी, जबकि गैर व्यवहार्य कोशिकाओं केवल किसी भी उठाया वृद्धि (चित्रा 3) के बिना एक अपारदर्शी धब्बा के रूप में दिखाई देगा।
      2. एससीआरम्यूटेंट के eening
        1. यदि एक auxotrophic उत्परिवर्ती जिसके लिए चयन के तरीके उपलब्ध नहीं हैं पैदा करने, यूवी के धारावाहिक 1:10 dilutions बाँझ पानी में खमीर कोशिकाओं किरणित तैयार करने और YPD मीडिया पर dilutions पिपेट, एक बाँझ प्रसारित करने के लिए समान रूप से कोट प्लेट का उपयोग।
        2. Parafilm में लपेटें प्लेटें और उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए सेते हैं। जो व्यक्ति कमजोर पड़ने कालोनियों के विकास कि आसानी से एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, प्रति प्लेट कालोनियों आम तौर पर कोई लगभग 100 से अधिक के लिए अनुमति का निर्धारण करते हैं।
        3. खमीर नमूनों की दोहराएँ यूवी mutagenesis इस निर्धारित कमजोर पड़ने पर 1.2.1-1.2.3 और प्लेट कोशिकाओं में वर्णित है। YPD मीडिया पर पतला खमीर पिपेट, एक बाँझ स्प्रेडर का उपयोग कोशिकाओं को वितरित करने के लिए, और लिपटे प्लेटों सेते उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए।
        4. ब्याज की कमी मेटाबोलाइट चयनात्मक मीडिया पर प्रतिकृति चढ़ाना द्वारा auxotrophs के लिए स्क्रीन। सबसे पहले, एक प्लेट स्टैंड पर एक बाँझ मखमल पैड सुरक्षितऔर मखमल पर यूवी किरणित कालोनियों के साथ थाली पलटना, थाली उन्मुखीकरण अंकन।
        5. अगले, एक ताजा प्लेट मखमल पर ब्याज की कमी मेटाबोलाइट पलटना और हल्के से थाली करने के लिए मखमल से कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए नीचे दबाएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर मूल थाली स्टोर। लपेटें और उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए नई प्लेट सेते हैं।
        6. एक चयनात्मक मीडिया पर YPD से फिर से streaking कालोनियों द्वारा प्रतिकृति चढ़ाना, स्क्रीन म्यूटेंट के लिए विकल्प के रूप में। एक भी कॉलोनी का हिस्सा लेने और धीरे से एक ताजा YPD प्लेट और एक प्लेट ब्याज की कमी मेटाबोलाइट भर में कोशिकाओं को खींचें करने के लिए एक बाँझ दंर्तखोदनी की नोक का प्रयोग करें। फिर लिपटे प्लेटों सेते उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-4 दिनों के लिए।
          नोट: देखभाल सच auxotrophic कोशिकाओं का एक सजातीय आबादी पुष्टि करने के लिए एकल कालोनियों और बाहर लकीर कालोनियों को कई बार चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए।
    4. इसके अलावा inoculat द्वारा विकिरणित कोशिकाओं के phenotype पुष्टिदोनों YPD और उचित मेटाबोलाइट (- मीडिया एक ura3 के लिए - उत्परिवर्ती जैसे, uracil में) की कमी मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में एकल कालोनियों हैैं। 30 डिग्री सीओ / एन पर एक रोलर ड्रम पर सेते मेटाबोलाइट के अभाव में YPD मीडिया में कोशिकाओं के विकास को नहीं, बल्कि इस बात की पुष्टि करने के लिए।
      नोट: ठोस मीडिया पर विकास पैटर्न स्पष्ट रूप से खमीर auxotrophic स्थिति का संकेत चाहिए, हालांकि, यह कुछ खमीर तनाव को सहन करने के लिए और ठोस मीडिया पर छोटे, धीमी गति से बढ़ रही है, लेकिन अभी तक कालोनियों के रूप में तरल मीडिया (अप्रकाशित टिप्पणियों) में एक ही परिस्थितियों को सहन नहीं संभव है। तरल संस्कृतियों में टीका इस प्रकार अच्छी तरह से यूवी किरणित म्यूटेंट के विकास पैटर्न पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए।
    5. इस बात की पुष्टि auxotrophic म्यूटेंट की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, 10 मिलीलीटर YPD में inoculating कोशिकाओं द्वारा ग्लिसरॉल शेयरों तैयार है और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम हे / एन पर incubating। 2500 XG और महाप्राण मीडिया पर 3 मिनट के लिए centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। 50% में Resuspend कोशिकाओंबाँझ फ़िल्टर ग्लिसरॉल, -80 डिग्री सेल्सियस पर एक cryovial, और दुकान के लिए स्थानांतरण।
      नोट: यूवी mutagenized खमीर संभावित ब्याज की auxotrophic मार्कर की तुलना में अन्य कई जीन में उत्परिवर्तन होते हैं। सत्यापित auxotrophic म्यूटेंट के उपयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले, इन उपभेदों आगे जीन अनुक्रमण और पीएच, पित्त अम्ल तनाव के लिए प्रतिरोध का मूल्यांकन, और प्रोबायोटिक उपभेदों के लिए प्रासंगिक अन्य विशेषताओं के माध्यम से, के रूप में कहीं 2 वर्णित विश्लेषण किया जाना चाहिए। 6 - इसके अतिरिक्त, पीसीआर अनुरूपता या CRISPR के उपयोग / Cas9 अधिक चुनिंदा auxotrophic मार्कर यूवी mutagenesis 4 के लिए एक विकल्प के रूप में माना जाना चाहिए बदलना निशाना।

2. खमीर परिवर्तन

  1. खमीर की LiOAc परिवर्तन
    1. YPD मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में एकल खमीर कालोनियों टीका लगाना और 30 डिग्री सीओ / एन पर एक रोलर ड्रम पर सेते हैं।
    2. लॉग चरण विकास को प्रेरित और प्लाज्मिड तेज की दक्षता बढ़ाने के लिए, डीtermine सेल एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एकाग्रता एक प्लास्टिक क्युवेट में बाँझ पानी में कोशिकाओं का एक 1:10 कमजोर पड़ने को मापने के लिए। ताजा गर्म YPD के 50 मिलीलीटर में - (2.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल लगभग 2 x 10 6) और एक कक्षीय मंच प्रकार के बरतन संस्कृति जब तक 200 rpm के लिए सेट पर कोशिकाओं सेते .16-0.2 के 600 एक आयुध डिपो के लिए हे / एन संस्कृतियों पतला लगभग 1 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल, आम तौर पर लगभग 4 घंटा तक पहुँचता है।
      नोट: परिवर्तन दक्षता सफलतापूर्वक तब्दील खमीर कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) प्लास्मिड डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति की संख्या के एक समारोह के रूप में मापा जा सकता है। प्लास्मिड डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति अधिक तब्दील कालोनियों में दक्षता परिणाम वृद्धि हुई है। लॉग चरण विकास के दौरान कोशिकाओं और खमीर संग्रह Subculturing एक पहलू है कि परिवर्तन दक्षता 12 बढ़ जाती है।
    3. 3 मिनट के लिए 2500 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    4. तितर resuspending द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब सतह पर तैरनेवाला और हस्तांतरण कोशिकाओं Aspirate1 मिलीलीटर बाँझ पानी में एट।
    5. centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं एक microcentrifuge में 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर तैरनेवाला aspirate और 1 मिलीलीटर ते / LiOAc (Tris EDTA LiOAc) बफर में मेजबान द्वारा कोशिकाओं धो लें।
    6. 2 एक्स 10 9 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के लिए ते / LiOAc बफर में centrifugation और resuspend कोशिकाओं को दोहराएँ।
    7. निम्न में से प्रत्येक के साथ परिवर्तन के मिश्रण तैयार: ते / LiOAc बफर में तैयार खमीर के 50 μl, वाहक डीएनए (10 माइक्रोग्राम / μl) के 5 μl, और प्लास्मिड डीएनए (1 माइक्रोग्राम) के 1 μl। प्लास्मिड डीएनए के माइक्रोग्राम डीएनए की मात्रा बढ़ रही है या बढ़ा परिवर्तन दक्षता 32 के लिए नेतृत्व नहीं हो सकता है के रूप में titrated किया जा सकता है
      नोट: एक उत्परिवर्ती खमीर तनाव एक auxotrophic मार्कर की कमी के लिए, केवल एक प्लाज्मिड मार्कर एन्कोडिंग नमूना प्रति तब्दील किया जा सकता है। इसके अलावा, एक प्लाज्मिड जैसे GFP के रूप में एक आसानी से पहचाने जा प्रोटीन, एन्कोडिंग का उपयोग करते हैं, उचित तह और heterologous जनसंपर्क की अभिव्यक्ति की कुशल निर्धारण के लिए अनुमति देगाखमीर तनाव परिवर्तन करने के बाद से otein।
    8. प्रत्येक तैयारी करने के लिए, खूंटी / LiOAc / ते और अच्छी तरह से भंवर के 300 μl जोड़ें। खूंटी के साथ बरकरार कोशिकाओं के ऊष्मायन कुशल परिवर्तन 13 के लिए आवश्यक है।
    9. एक बीकर 200 rpm पर एक कक्षीय मंच पर रखा प्रकार के बरतन में microcentrifuge ट्यूबों रखकर आंदोलन के साथ 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर तैयारियों को सेते हैं।
    10. एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया और गर्मी झटका कोशिकाओं को DMSO के 35 μl जोड़ें। हालांकि वहाँ DMSO 33 के अतिरिक्त लाभ की रिपोर्ट के परस्पर विरोधी हैं, अक्षत खमीर कोशिकाओं की गर्मी झटका बहुत परिवर्तन दक्षता 12 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है।
    11. 2.1.5 के रूप में centrifugation के माध्यम से pelleting, श्वास या सतह पर तैरनेवाला बंद pipetting, और 1 मिलीलीटर में resuspending बाँझ पानी से कोशिकाओं को धो लें। धीरे सेल गोली को तोड़ने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और।
      नोट: यह अच्छी तरह से क्योंकि मीडिया के उपयोग सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए महत्वपूर्ण हैसक्षम कोशिकाओं को पैदा करने में डी खमीर विकास और कॉलोनी गठन को बाधित कर सकते हैं।
    12. दोहराएँ सेल pelleting 2.1.5 के रूप में, सतह पर तैरनेवाला aspirate, और 100 μl बाँझ पानी में कोशिकाओं resuspend। एक चयनात्मक थाली पर पूरी मात्रा पिपेट और एक बाँझ प्रसारित करने के लिए समान रूप से कोट तब्दील खमीर के साथ प्लेट का उपयोग करें।
    13. Parafilm में लपेटें लेपित प्लेटों के किनारों मीडिया के सूखने को रोकने और उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2 दिनों के लिए सेते तब्दील खमीर कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देने के लिए। सफल, कुशल परिवर्तन और Saccharomyces cerevisiae की auxotrophic चयन परिवर्तन तैयारी प्रति कालोनियों के एक उच्च संख्या पैदावार, हालांकि उपज अन्य नस्लों (चित्रा 4) के लिए काफी कम हो सकता है।
    14. अल्पावधि (आम तौर पर 1-3 सप्ताह) उल्टा और 4 डिग्री सेल्सियस पर कवर के लिए स्टोर खमीर प्लेटें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए 1.2.5 में वर्णित के रूप में तब्दील हो खमीर की ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करें।
      नोट: आगे के अध्ययन के परीक्षण तब्दील सीएफयू प्लाज्मिड स्थिरता का निर्धारण और heterologous प्रोटीन की उचित अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं। प्लाज्मिड स्थिरता 34, immunoblotting के उपयोग की पूरी तरह से वर्णन सेल के नमूने 17 से बरामद विकृत प्रोटीन का पता लगाने के लिए, एंजाइम immunosorbent परख (एलिसा) का पता लगाने से जुड़े ठीक से तीन आयामी प्रोटीन 16, और खमीर अध्ययन में GFP के उपयोग के 35 कहीं और उपलब्ध हैं मुड़ा हुआ है। चित्रा 6 तब्दील करने में सफल एस GFP अभिव्यक्ति का एक प्रतिनिधि छवि को दर्शाता है untransformed कोशिकाओं को cerevisiae रिश्तेदार। इस तरह के एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग कुशलता से सफल heterologous प्रोटीन के उत्पादन को निर्धारित करने का एक साधन है।
  2. खमीर के electroporation
    1. YPD मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में एकल खमीर कालोनियों टीका लगाना और 30 डिग्री सीओ / एन पर एक रोलर ड्रम पर सेते हैं।
    2. बाँझ पानी में कोशिकाओं का एक 1:10 कमजोर पड़ने को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग सेल एकाग्रता का निर्धारण। डिलगभग 0.3 के एक आयुध डिपो के 600 बराबर करने के लिए 100 मिलीलीटर ताजा गर्म YPD मीडिया में वीणा हे / एन संस्कृतियों। , 4-5 घंटा के लगभग 1.6 के एक आयुध डिपो 600 तक पहुंच गया है जब तक आम तौर पर 200 rpm के लिए एक कक्षीय मंच प्रकार के बरतन सेट पर 30 डिग्री सेल्सियस पर उपसंस्कृतियाँ सेते हैं। प्रत्येक 100 मिलीलीटर उपसंस्कृति दो परिवर्तन प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त वातानुकूलित कोशिकाओं को उत्पन्न होगा।
    3. 3 मिनट के लिए 2500 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 50 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे पानी में बाँझ resuspending द्वारा कोशिकाओं धो लें। , कोशिकाओं pelleting सतह पर तैरनेवाला श्वास, और ताजा बर्फ के ठंडे 50 मिलीलीटर बाँझ पानी में resuspending द्वारा धोने दोहराएँ।
    4. कोशिकाओं को फिर से गोली और 50 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे electroporation बफर (1 sorbitol एम, 1 मिमी CaCl 2) में resuspend।
    5. 20 में 2.2.3 के रूप में दोहराएँ स्पिन, महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, और resuspend कोशिकाओं मिलीलीटर 0.1 एम LiOAc / 10 मिमी डीटीटी। 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम पर सेल निलंबन सेते हैं। LiOAc और डीटीटी में कोशिकाओं की preincubation synergistically बढ़ जाती हैelectroporation 36 की दक्षता।
    6. 2.2.3 के रूप में गोली कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 50 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे electroporation बफर में resuspending द्वारा धो लें। 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए बर्फ के ठंडे electroporation बफर में centrifugation और resuspend कोशिकाओं को दोहराएँ।
    7. वातानुकूलित खमीर कोशिकाओं, बाँझ electroporation cuvettes, और प्लास्मिड डीएनए: बर्फ पर तैयार करें। इसके तत्काल बाद 1 मिलीलीटर electroporation बफर में वातानुकूलित कक्षों की अंतिम मेजबान के बाद, लगभग 1 ग्राम के डीएनए के साथ 400 μl वातानुकूलित खमीर कोशिकाओं गठबंधन और एक बर्फ के ठंडे 0.2 माइक्रोन electroporation क्युवेट में जोड़ें। डीएनए की मात्रा में वृद्धि का उपयोग थोड़ा परिवर्तन दक्षता 11 को बढ़ा सकता है। 5 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया सेते हैं, तो 2.5 केवी और 25 μF को electroporator सेट के साथ electroporate।
      नोट: 2.1.7 में वर्णित है, एक उत्परिवर्ती खमीर तनाव एक auxotrophic मार्कर कमी केवल एक प्लाज्मिड नमूना प्रति उत्परिवर्तित मार्कर एन्कोडिंग के साथ तब्दील किया जा सकता है। इसके अलावा, का उपयोग करते हुएएक प्लाज्मिड कि इस तरह के GFP के रूप में एक आसानी से पहचाने जा प्रोटीन encodes उचित तह और परिवर्तन करने के बाद heterologous प्रोटीन की अभिव्यक्ति के कुशल निर्धारण के लिए अनुमति देता है।
    8. YPD के मिश्रण 1: 1 का 8 स्थानांतरण एक मिलीलीटर में electroporated कोशिकाओं 1 एम सोर्बिटोल और कोशिकाओं 60 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम पर सेते दें।
    9. 2.2.3 के रूप में गोली कोशिकाओं और 100 μl 1 में resuspend: 1 YPD: 1 sorbitol एम। 1 एम सोर्बिटोल युक्त चयनात्मक मीडिया पर पूरी मात्रा प्लेट, Parafilm में प्लेटों के किनारों लपेट, और उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2-5 दिनों के लिए प्लेटें सेते तब्दील खमीर कोशिकाओं के विकास के लिए अनुमति देने के लिए।
      नोट: यह परीक्षण तब्दील खमीर के लिए महत्वपूर्ण 2.1.14 और 2.2.7 में वर्णित है, heterologous प्रोटीन की उचित अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए है।

3. तब्दील खमीर के साथ चूहों के मौखिक Gavage

  1. देखभाल और प्रयोगशाला के उपयोग के लिए एक गाइड के अनुसार सभी जानवरों की देखभाल और हैंडलिंग प्रक्रियाओं का प्रदर्शनimals और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति की मंजूरी।
  2. चयनात्मक मीडिया के 5-10 मिलीलीटर में तब्दील auxotrophic खमीर की एकल कालोनियों inoculating द्वारा हे / एन खमीर संस्कृतियों तैयार करें। 30 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर ड्रम पर कम से कम 8 घंटे के लिए संस्कृतियों हे / एन सेते हैं जब तक संतृप्त।
    नोट: 4.7 में वर्णित के रूप में इस तरह के रूप में GFP प्लाज्मिड एन्कोडिंग परीक्षण प्रोटीन का उपयोग, gavaged खमीर में प्रोटीन अभिव्यक्ति के परीक्षण में आसानी के लिए अनुमति देगा।
  3. प्रोटीन अभिव्यक्ति की अधिक से अधिक शामिल करने के लिए और लॉग चरण विकास के लिए प्रेरित करने, हे उपसंस्कृतियाँ से तैयार / 2.1.2 में वर्णित के रूप में उपयुक्त मीडिया के लगभग 50 .16-0.2 में एमएल के एक आयुध डिपो के 600 बराबर करने के लिए गिराए द्वारा एन संस्कृतियों।
  4. 1.1.2 के रूप में subcultured कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण और / एमएल 10 9 कोशिकाओं को समायोजित करें। एक 100 μl खुराक सटीकता में सुधार और नमूना लोडिंग के कम करने के लिए समूह के प्रति कुछ सौ μl अतिरिक्त मात्रा के साथ, प्रत्येक माउस के लिए तैयार करें।
  5. के लिए 2500 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं3 मिनट या 1 मिनट के लिए 16,000 XG पर एक microcentrifuge में। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और बाँझ पानी के एक बराबर मात्रा जोड़ने और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं Resuspend।
  6. 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज और लोड खमीर नमूना पर एक उचित गेज gavage सुई (15-20 ग्राम चूहों के लिए 22 जी) को ठीक करें, एक 100 μl वेतन वृद्धि के लिए किसी भी बुलबुले और सवार सेट खत्म करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है। gavage चूहों पर नियंत्रण करने के लिए बाँझ पानी के साथ एक अतिरिक्त सिरिंज लोड और किसी भी contaminating खमीर की उपस्थिति के लिए जाँच करें।
  7. तर्जनी और अंगूठे कसकर गर्दन (चित्रा 6A) के आसपास की त्वचा लोभी के साथ, माउस गैर प्रमुख हाथ का उपयोग कर gavaged जा करने के लिए उठाओ। छोटी उंगली के नीचे पूंछ टक कम शरीर के आंदोलन को रोकने के लिए। सुनिश्चित करें कि पकड़ सुरक्षित है और आदेश gavage दौरान आंतरिक ऊतकों को नुकसान को रोकने के लिए अपने सिर बढ़ने से माउस पर प्रतिबंध लगाता हो।
    नोट: इस तरह के अनुमान है कि माउस के खिलाफ सुई धारण करके कितनी दूर gavage सुई डाला जाना चाहिएबल्ब भी उरोस्थि के जिफाएडा प्रक्रिया के साथ है। सुई के इस लंबाई आमतौर पर डालने gavage सुई बल्ब पेट में प्रवेश करने की अनुमति देगा।
  8. प्रमुख हाथ का प्रयोग, धीरे, मुंह और गले के पीछे की छत के साथ सुई angling केंद्र के बाईं ओर थोड़ा रखकर माउस घेघा में gavage सुई डालें। माउस सुई के बल्ब निगल और सुई बिंदु 3.7 (चित्रा 6B) में अनुमान से थोड़ा आगे उतरना करने के लिए अनुमति देने के लिए के लिए प्रतीक्षा करें। किसी भी प्रतिरोध gavage सुई की प्रविष्टि के दौरान या किसी भी समय माउस हांफी के लिए शुरू होता है, तो महसूस किया है, तो धीरे सुई को हटाने और फिर से घेघा खोजने की कोशिश।
  9. बाद माउस gavage सुई के बल्ब निगल लिया है, धीरे से सीधे माउस पेट में खमीर के 100 μl (10 8 CFU) प्रशासन के लिए सिरिंज सवार दबाना।
    नोट: हालांकि चूहों प्रशासन 18,19 के बाद gavaged समाधान के किसी भी उल्टी करने में असमर्थ हैं 21,37 के दौरान घटित करने के लिए। gavage सुई के उचित प्रविष्टि के रूप में अच्छी तरह से की मात्रा और समाधान का चिपचिपापन समायोजन के रूप में, भाटा की सीमा और सटीक खुराक सुनिश्चित करने में मदद कर सकते हैं।
  10. ध्यान से माउस पेट और घेघा से gavage सुई को हटाने और पिंजरे के लिए माउस वापसी। जाँच करें कि माउस साँस लेने और यह सुनिश्चित करें कि gavage सुई ठीक से प्रक्रिया के दौरान और कहा कि कोई समाधान aspirated था डाला गया था gavage के बाद सामान्य रूप से चल रहा है।

4. Murine Peyer पैच की फसल और व्यवहार्य खमीर कालोनियों के अलगाव

  1. उचित समय बिंदु पद gavage पर, आम तौर पर 4 घंटा, IACUC का उपयोग करते हुए बलिदान चूहों के तरीकों को मंजूरी दे दी। एक पैर की अंगुली चुटकी निम्नलिखित जवाबदेही की कमी के लिए जाँच करें, और माउस बलिदान करने के लिए इस तरह के गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के रूप में एक माध्यमिक उपाय का उपयोग। अतिरिक्त समय के अंक भी परीक्षण किया जा सकता है के रूप में कई अध्ययनों से पता चला है कि कार्यकुशलता और ऊपर के समयउपकला पार ले कण निर्भर 38,39 है।
  2. पूरी तरह से उजागर पेट के साथ माउस निर्धारित करना और 70% EtOH के साथ छिड़काव द्वारा पेट क्षेत्र बाँझ। फर और कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक अनुप्रस्थ चीरा, किसी भी आंतरिक ऊतकों को नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा। मैन्युअल चीरा पेरिटोनियम, पतली serosal पेट अंगों को कवर अस्तर बेनकाब करने के लिए आगे खोलने जिज्ञासा। धीरे पेरिटोनियम उठा और आंतों को बेनकाब करने के लिए एक अनुप्रस्थ चीरा बनाते हैं।
  3. ध्यान से छोटी आंत mesenteric धमनियों, वसा, और अन्य ऊतकों से दूर तंग करने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करें। बड़ी आंत के शुरू में आंतों के ऊतकों की बड़ी जेब पेट से छोटी आंत का पर्दाफाश, माउस पेट के ऊपरी बाएँ चक्र में, cecum करने के लिए।
  4. 1-3 मिमी छोटी आंत साथ अपारदर्शी ऊतक का लगभग परिपत्र पैच (चित्रा 7) की तलाश द्वारा Peyer पैच अलग। घुमावदार विच्छेदन Scis का प्रयोगप्रायोजक, Peyer के पैच के गुंबद दूर कटौती, यह सुनिश्चित करने के लिए है कि आसपास के पटल Propria में से कोई भी एकत्र किया जाता है मार्जिन छोड़ने।
    नोट: सबसे चूहों 4-8 आसानी से दिखाई Peyer पैच के बीच की है। प्रत्यक्ष उपरि प्रकाश व्यवस्था के साथ एक क्षेत्र में प्रक्रिया के प्रदर्शन कितनी आसानी से देखे जा सकते हैं Peyer पैच में वृद्धि होगी।
  5. पूरा Iscove संशोधित Dulbecco के मीडिया (IMDM) में Peyer पैच विच्छेदित लीजिए।
    नोट: यह आदेश खमीर प्लेटों के जठरांत्र जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए संग्रह मीडिया में बाँझ तकनीक का उपयोग करें और एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से तनाव Peyer पैच संग्रह मीडिया को खत्म करने। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर ताजा पूरा IMDM साथ धो Peyer पैच और 1 मिलीलीटर सिरिंज से एक सवार का उपयोग धीरे Peyer पैच को तोड़ने के लिए। 7 मिनट के लिए 1800 rpm पर centrifugation द्वारा तनावपूर्ण गोली कोशिकाओं। में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओंलगभग 100 μl के अंतिम मात्रा।
  7. चयनात्मक खमीर मीडिया पर तनावपूर्ण कोशिकाओं को लागू करें और एक थाली स्प्रेडर का उपयोग कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए। Parafilm में लपेटें प्लेट किनारों और उल्टा 30 डिग्री सेल्सियस पर नीचे 2 दिनों के लिए प्लेटें सेते किसी भी व्यवहार्य खमीर murine Peyer पैच से बरामद की वृद्धि के लिए अनुमति देने के लिए।
    नोट: Peyer 'पैच से खमीर की वसूली के बाद आगे की पढ़ाई पुष्टि करने के लिए कि उपभेदों इन प्रतिरक्षा ऊतकों को ठीक से मुड़ा हुआ heterologous प्रोटीन देने में सक्षम हैं जरूरी हैं। 2.1.14 में वर्णित है, इस तरह के तरीकों जैसे GFP 2,40 के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के लिए immunoblotting, एलिसा, या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शामिल हो सकते हैं।

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Representative Results

एक अस्तित्व वक्र पराबैंगनी विकिरण के बाद की पीढ़ी पतला खमीर कोशिकाओं है कि इस तरह अलग कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) के रूप में करने में सक्षम हैं के चढ़ाना की आवश्यकता है। प्रत्येक 500 μl नमूने के रूप में ऊपर वर्णित एकत्र लगभग 5 x 10 6 कोशिकाओं होता है; हालांकि, प्रति प्लेट 100 से अधिक कालोनियों सही भेद करना मुश्किल है। Undiluted नमूने के रूप में अच्छी तरह से विकिरणित कोशिकाओं के धारावाहिक 1:10 dilutions इस प्रकार सुनिश्चित करता है कि CFU, प्रत्येक यूवी खुराक पर समझा जा सकता है के रूप में चित्रा 1 में प्रदर्शन चढ़ाना। CFU गिनती, कमजोर पड़ने कारक से गुणा किया, फिर की कुल संख्या से विभाजित किया गया है क्रम में प्रत्येक खुराक में प्रतिशत अस्तित्व को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक 500 μl नमूने में मूल किरणित कोशिकाओं। चित्रा 2 द्विगुणित जंगली प्रकार एस की गणना प्रतिशत से पता चलता है boulardii कोशिकाओं 0 μJ, 5000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 22,500 μJ 25,000 जीवित करने में सक्षमμJ, 35,000 μJ, और 50,000 μJ। ये आंकड़े एक स्पष्ट वक्र है कि खुराक 50% अस्तित्व के लिए इसी खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्थापित।

यूवी खुराक और खमीर कोशिकाओं के विकिरण के चयन के बाद, यह एक कार्यात्मक auxotrophic मार्कर जीन की कमी की पुष्टि करने के लिए स्क्रीन उत्परिवर्ती कालोनियों के लिए महत्वपूर्ण है। एक चयन विधि का प्रयोग करें, 1.2.3.1 में वर्णित है और 3 चित्र में दिखाया गया है, काफी phenotype पुष्टि की क्षमता बढ़ जाती है। दिखाया URA3 चयन का एक उदाहरण है कि अक्षुण्ण Ura3 द्वारा विष 5-फू करने के लिए 5-FOA के रूपांतरण का लाभ लेता है। TRP1; अनुरूप दृष्टिकोण LYS2 और LYS5 के लिए उपलब्ध हैं और MET2 और MET15 और इन म्यूटेशन के लिए चयन की दक्षता में वृद्धि हुई है। देखभाल के स्क्रीनिंग के दौरान अलग-अलग कालोनियों का चयन करने के लिए लिया जाना चाहिए। YPD और 5 FOA, लेकिन नहीं uracil पर उत्परिवर्ती कालोनियों के लगातार विकास -, प्लेटें indicatauxotrophic phenotype तों।

चित्रा 4 जंगली प्रकार एस के लिए परिवर्तन दक्षता से पता चलता है boulardii (एसबी) आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला एस के सापेक्ष cerevisiae तनाव (एससी) दोनों LiOAc (LiOAc) और electroporation (इलेक्ट्रो) तकनीक का उपयोग कर। हालांकि LiOAc परिवर्तन एस के लिए बहुत ही कुशल है cerevisiae, एस के लिए परिवर्तन दक्षता boulardii बहुत electroporation का उपयोग कर सुधार हुआ है। तब्दील खमीर से उचित प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक उदाहरण के रूप में चित्रा विधि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के 5 शो का उपयोग करें। Brightfield (ए) और प्रतिदीप्ति (बी) छवियों एस लिए दिखाए जाते हैं cerevisiae एक URA3 प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP के साथ बदल, बदल खमीर से heterologous प्रोटीन के कार्यात्मक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन है। प्रकोष्ठों बेहतर दृश्य concanavalin ए में लेपित coverslips का उपयोग कर (कोट एक 2 से 5 μl के लिए स्थिर किया जा सकतामिलीग्राम / प्रत्येक 22 x 22 माइक्रोन coverslip और शुष्क हवा पर पानी में मिलीलीटर शेयर समाधान)।

चित्रा 6A एक C57BL / 6 माउस सिर्फ मौखिक gavage करने से पहले आयोजित पता चलता है। हाथ माउस मजबूती से ऐसी है कि माउस किसी भी दिशा में सिर को स्थानांतरित करने में सक्षम नहीं है की पीठ और गर्दन grasps। इस पकड़ gavage सुई सही रखा जा करने के लिए और बाद माउस gavage सुई निगल ऊतकों को नुकसान के कम जोखिम के साथ। चित्रा 6B आयोजित gavage सुई से पता चलता है की अनुमति देता है। ऊष्मायन अवधि के बाद, बलिदान माउस की छोटी आंत ध्यान के अलावा आसपास के ऊतकों से, के रूप में 7 चित्र में दिखाया छेड़ा जाना चाहिए। इस हेरफेर आसपास के किसी भी इकट्ठा करने के बिना Peyer पैच की और पैच की साफ विच्छेदन के लिए आसान पहचान के लिए अनुमति देता है लामिना प्रोप्रिया। अंत में, चित्रा 8 Peyer पैच से व्यवहार्य खमीर CFU की खासियत वसूली से पता चलता है। समाधान की खमीर मीडिया और प्लेट्स परिवर्तन अभिकर्मकों पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) 50%: YPD: ते / LiOAc: 250 ग्राम खूंटी 3350 20 ग्राम peptone 50 मिलीलीटर 10x ते 500 मिलीलीटर बाँझ पानी 20 ग्राम डेक्सट्रोज 50 मिलीलीटर 10x (1 मी) LiOAc बाँझ फ़िल्टर 10 ग्राम खमीर निकालने 400 मिलीलीटर बाँझ पानी 1 एल पानी बाँझ फ़िल्टर आटोक्लेव ते 10x: YPD प्लेटों: खूंटी / ते / LiOAc: 100 मिमी Tris 20 ग्राम peptone 400 मिलीलीटर 50% खूंटी 10 मिमी EDTA 20 ग्राम डेक्सट्रोज 50 मिलीलीटर 10x ते 7.5 और फिल्टर बाँझ पीएच 20 ग्राम अगर 50 मिलीलीटर 10x (1 मी) LiOAc 10 ग्राम खमीर निकालने 1 एल पानी आटोक्लेव 20% ग्लूकोज: Uracil - चयनात्मक मीडिया कैरियर डीएनए (एसएस डीएनए): 200 ग्राम डेक्सट्रोज 2 जी एमिनो एसिड मिश्रण uracil कमी -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और 100 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए गर्मी का उपयोग किस्में पिघल करने के लिए और बर्फ पर दुकान करने से पहले 1 एल पानी अमीनो एसिड के बिना 6.7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस बाँझ फ़िल्टर 1 एल पानी <टीआर> autoclaving या बाँझ छानने द्वारा जीवाणुरहित उपयोग करने से पहले 20% ग्लूकोज 01:10 जोड़े 50% ग्लिसरॉल: Uracil - प्लेटों: Electroporation बफर: 500 मिलीलीटर ग्लिसरॉल एक 250 मिलीलीटर कुप्पी में: 1 sorbitol एम 500 मिलीलीटर पानी 2 जी एमिनो एसिड मिश्रण uracil कमी 1 मिमी 2 CaCl आटोक्लेव अमीनो एसिड के बिना 6.7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस आसुत जल के साथ भरें 150 मिलीलीटर पानी आटोक्लेव और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान एक 2 एल कुप्पी में: 20 ग्राम अगर 750 मिलीलीटर पानी आटोक्लेव बोतल अलग से, फिर 100 मिलीलीटर 20% ग्लूकोज के साथ एक साथ मिश्रण पूरा IMDM 5-FOA + प्लेटों: LiOAc / डीटीटी 500 मिलीलीटर Iscove संशोधित Dulbecco के मीडिया एक एल 2 फ्लास्क में आटोक्लेव: 0.1 एम LiOAc 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन glutamine 100x 20 ग्राम अगर 10 मिमी डीटीटी 500 μl 2-मर्केप्टोइथेनाल 750 मिलीलीटर पानी 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम मिक्स: 2.5 मिलीलीटर सोडियम पाइरूवेट 100 मिमी अमीनो एसिड के बिना 6.7 ग्राम खमीर नाइट्रोजन बेस uracil के बिना 2 जी एमिनो एसिड मिश्रण 150 मिलीलीटर गर्म पानी जब शांत, जोड़ें: 0.05 छ uracil पाउडर 1 ग्राम 5-FOA हलचल और फिल्टर बाँझ autoclaved अगर समाधान में जोड़े 100 मिलीलीटर 20% ग्लूकोज के साथ मिक्स

तालिका 1. अभिकर्मकों सूची। वर्णित अभिकर्मकों समाधान, खमीर मीडिया और प्लेटें, और परिवर्तन बफ़र्स इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल की प्रत्येक बनाने के लिए आवश्यक हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. खमीर कालोनियों YPD मीडिया पर हो। उदाहरण YPD थाली व्यवहार्य कॉलोनी पी की इकाइयों (CFU) के गठन दिखायूवी विकिरण के बाद robiotic खमीर। प्रकोष्ठों क्रमानुसार इस तरह पतला थे कि व्यक्ति CFU प्रतिष्ठित और गिना जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. जीवन रक्षा द्विगुणित प्रोबायोटिक खमीर के लिए वक्र। व्यवहार्य एस की संख्या कुल चढ़ाया कोशिकाओं का एक प्रतिशत के रूप में boulardii CFU पराबैंगनी विकिरण (ठोस लाइन) में से प्रत्येक μJ खुराक के लिए साजिश रची गई थी। खड़ी लाल रेखा इस खमीर तनाव का 50% अस्तित्व के लिए इसी खुराक μJ यूवी इंगित करता है। एक rad1 एस cerevisiae उत्परिवर्ती, जो पराबैंगनी म्युटाजेनेसिस से होने वाले नुकसान की मरम्मत नहीं कर सकते हैं, एक नियंत्रण (धराशायी लाइन)। के रूप में दिखाया गया है कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ A>

चित्र तीन
चित्रा 3. ura3 की पुष्टि - यूवी के phenotype YPD, uracil पर कोशिकाओं किरणित -, और 5 FOA प्लेटों व्यक्ति यूवी उत्परिवर्ती कालोनियों से प्रकोष्ठों एक बाँझ दंर्तखोदनी के टिप का उपयोग कर एकत्र की है और धीरे YPD, uracil भर परेशान रहे थे -।, और 5 -FOA प्लेटें। कोशिकाओं को पहले दो सीधा क्रासिंग लाइनों में परेशान कर रहे थे तो एक नया दंर्तखोदनी दूसरी लाइन से गुजरती हैं और कोशिकाओं के प्रसार जब तक व्यक्ति की कोशिकाओं को अलग जारी रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक सच ura3 - उत्परिवर्ती (mut) YPD मीडिया पर और 5 FOA की उपस्थिति में बढ़ता है, लेकिन uracil के अभाव में नहीं। नियंत्रण ura3 - एस cerevisiae (ura3 -) और URA3 + sup> एस boulardii (URA3 +) की तुलना के लिए दिखाए जाते हैं और खमीर मीडिया की समुचित तैयारी पुष्टि करने के लिए। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Saccharomyces स्ट्रेन के परिवर्तन दक्षता। जंगली प्रकार एस boulardii (एसबी) और एक प्रयोगशाला एस cerevisiae तनाव (एससी) में वर्णित LiOAc (LiOAc) और electroporation (इलेक्ट्रो) प्रोटोकॉल का उपयोग तब्दील हो गया। परिणाम के रूप में मतलब CFU प्लाज्मिड एक केनामाइसिन प्रतिरोध मार्कर एन्कोडिंग की माइक्रोग्राम प्रति प्राप्त की साजिश रची है। सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि चित्रण त्रुटि सलाखों के साथ डुप्लिकेट प्रयोगों का मतलब बताते हैं।es / ftp_upload / 53,453 / 53453fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
परिवर्तित खमीर द्वारा चित्रा 5. कार्यात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति। एस cerevisiae खाली प्लाज्मिड (ए) और प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP (बी) के साथ बदल एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। GFP प्लाज्मिड के साथ बदल खमीर कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति कार्यात्मक GFP के सफल उत्पादन इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 मौखिक gavage के लिए एक C57BL / 6 माउस के समुचित से निपटने। माउस आयोजित tightl हैपूंछ छोटी उंगली के नीचे tucked के साथ गैर प्रमुख हाथ में Y ताकि कोई आंदोलन संभव है (ए)। gavage सुई मुँह की छत के साथ ग्रसनी में डाला जाता है। माउस gavage सुई के बल्ब निगल करने के लिए अनुमति दी है, समाधान तो पेट में प्रवेश करने के रूप में सवार उदास (बी) है। इजाजत दी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. तैयारी और Peyer पैच के विच्छेदन। छोटी आंत तीर Peyer पैच के कुछ ओर इशारा करते हुए के साथ अन्य आंतरिक अंगों और ऊतकों से दूर विच्छेदित दिखाया गया है। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा की पर।

आंकड़ा 8
8 चित्रा Peyer पैच से खमीर वसूली। एक माउस के साथ एस gavaged से व्यवहार्य CFU विच्छेदन, homogenization के बाद पता चला है, और कुल Peyer पैच कोशिकाओं के चढ़ाना का एक उदाहरण boulardii। प्रकोष्ठों YPD खमीर मीडिया पर चढ़ाया और 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे। माउस प्रति बरामद CFU की ठेठ उपज 10 से कम है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

साथ में, प्रोटोकॉल के साथ साथ आंत के लिए heterologous चिकित्सीय प्रोटीन की डिलीवरी के लिए विकास और auxotrophic प्रोबायोटिक खमीर उपभेदों के परीक्षण के लिए आवश्यक चरण का वर्णन है। इस हेरफेर और पुनः संयोजक प्रोबायोटिक खमीर का परीक्षण तकनीक और संसाधनों के साथ जो किसी भी व्यक्ति प्रयोगशाला वर्तमान में परिचित नहीं हो सकता की आवश्यकता है। इस प्रकार, हालांकि कई पिछले अध्ययनों कई खमीर और माउस उपभेदों के लिए ऊपर प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, इन तरीकों को नहीं 'लेखक एक विस्तृत ज्ञान, एकीकृत रूप में प्रस्तुत किया गया है। इसके अलावा, वर्तमान पांडुलिपि प्रोबायोटिक खमीर की आनुवंशिक हेरफेर, जो अच्छी तरह से कम आमतौर पर इस्तेमाल प्रयोगशाला खमीर उपभेदों से विशेषता है के लिए वर्तमान मानकीकृत प्रोटोकॉल आदत डाल पर विशेष जोर देता है। दोनों mutagenesis के लिए कई कदम और परिवर्तन (भाग 2) (1 भाग में चर्चा की) ऐसी द्विगुणित के हेरफेर, प्रोबायोटिक खमीर ISOLAT के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिएतों। यह पांडुलिपि भी जानवर से निपटने (भाग 3) और Peyer पैच छोटी आंत के प्रतिरक्षा ऊतकों (भाग 4) के विच्छेदन के साथ जुड़े संभावित नुकसान की चर्चा है।

कई औद्योगिक और चिकित्सकीय प्रासंगिक खमीर उपभेदों तुरंत बड़े पैमाने पर आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुकूल नहीं हैं, यह इस तरह के auxotrophic म्यूटेंट कि उगाया जा सकता है और चयनित महंगी एंटीबायोटिक दवाओं के बिना के रूप में पहली उपभेदों उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। यूवी mutagenesis ऐसे ही एक दृष्टिकोण है कि auxotrophic जीन 7,41 के त्वरित अविशिष्ट उत्परिवर्तन के लिए अनुमति देता है। जीवन रक्षा घटता आसानी से (आंकड़े 1 और 2) उत्पन्न किया जा सकता म्यूटेंट स्क्रीनिंग के लिए उचित खुराक निर्धारित करने के लिए। हालांकि, इस दृष्टिकोण लक्ष्य म्यूटेशन कि विकास दर या खमीर तनाव के अन्य गुणों को प्रभावित कर सकता है बंद उत्प्रेरण का जोखिम रहता है। लक्षित नॉकआउट बजाय पीसीआर constructs या CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है। इसके बाद स्क्रीनिंग या चयन(चित्रा 3) म्यूटेंट के auxotrophic खमीर की पहचान के लिए अनुमति देता है। 5-FOA मीडिया पर चढ़ाना द्वारा चयन का उपयोग, उदाहरण के लिए, अभी भी एक कार्यात्मक URA3 auxotrophic जीन युक्त किसी भी खमीर का तेजी से समाप्त करने के लिए अनुमति देता है। जब संभव हो, इस चयन दृष्टिकोण एक स्क्रीन है, जो उत्पन्न सभी कालोनियों के विश्लेषण की आवश्यकता के लिए बेहतर हो सकता है। या तो चयन या स्क्रीनिंग के साथ, तथापि, यह auxotrophic स्थिति की पुष्टि करने के लिए चयनात्मक मीडिया पर अलग-अलग खमीर कालोनियों के दोहराया streaking प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

उत्पन्न म्यूटेंट के परिवर्तन अलग प्रोटोकॉल के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। हालांकि LiOAc परिवर्तन, कई खमीर उपभेदों के परिवर्तन में प्रभावी है, विशेष रूप से सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगशाला एस के लिए cerevisiae उपभेदों, इस तरह के electroporation के रूप में वैकल्पिक प्रोटोकॉल अन्य खमीर अधिक से अधिक क्षमता (चित्रा 4) के साथ अलग कर बदल सकते हैं। प्रत्येक नया तनाव यूएसआई परीक्षण किया जाना चाहिएएकाधिक प्रोटोकॉल एनजी परिवर्तन के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए। ऊष्मायन बार और डीएनए की एकाग्रता परिवर्तनीय, उदाहरण के लिए, समग्र परिवर्तन दक्षता प्रभावित कर सकते हैं और परीक्षण किया और अनुकूलित किया जाना चाहिए प्रत्येक तनाव के लिए 33।

मौखिक gavage सीधे murine जठरांत्र संबंधी मार्ग, जिनकी प्रतिरक्षा ऊतकों तो खमीर और heterologous प्रोटीन के लिए यत्न किया जा सकता करने के लिए इन पुनः संयोजक खमीर की नियंत्रित खुराक के वितरण के लिए अनुमति देता है। उचित मौखिक gavage तकनीक (चित्रा 6) जानवर असुविधा को कम करने और प्रयोगात्मक परिशुद्धता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, Peyer पैच आंत से पुनः संयोजक खमीर के तेज का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण साइटों रहे हैं। प्रतिरक्षा ऊतक के इन समूहों प्रतिजन नमूना और श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रेरण के महत्वपूर्ण साइटों रहे हैं। व्यास में खमीर 3-6 माइक्रोन सहित बड़े एंटीजन, सबसे आदेश ga पार करने में Peyer पैच के एम कोशिकाओं द्वारा उठाए जाने की संभावना हैstrointestinal उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत। केयर जब Peyer पैच विदारक (चित्रा 7) पैच के बजाय आंतों लुमेन या लामिना propria एकत्र कर रहे हैं की तुलना में भीतर से है कि केवल कोशिकाओं सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। आगे कदम भी विच्छेदन बरामद खमीर (8 चित्रा) में उचित अभिव्यक्ति और heterologous प्रोटीन के समारोह का आकलन करने के बाद लिया जाना चाहिए। खमीर lysates और immunoblotting से कुल प्रोटीन की तैयारी प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए एक मानक तरीका है; हालांकि, इस दृष्टिकोण प्रोटीन तह और समारोह के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। प्रोटीन समारोह का आकलन करने के लिए, खमीर एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग GFP के साथ बदल गया है और Peyer पैच से वसूली के बाद एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत विश्लेषण कार्यात्मक GFP अभिव्यक्ति (चित्रा 5) का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

संक्षेप में, इस पांडुलिपि कदम फैले इधर-उधर विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए एक एकीकृत सेट प्रस्तुतmurine आंत से प्रोबायोटिक खमीर की वसूली के लिए auxotrophic म्यूटेंट की पीढ़ी हूँ। प्रोटोकॉल पारंपरिक रूप से विशेषज्ञता के एक ही क्षेत्र के भीतर गिर नहीं है कि संकलन करके, इन विवरण प्रोबायोटिक मौखिक दवा वितरण वैक्टर के रूप में तैयार करने के लिए खमीर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का परीक्षण आगे की पढ़ाई की सुविधा होगी। उम्मीद है कि इस अध्ययन के लेखकों चर्चा को प्रोत्साहित करने और प्रत्येक खमीर तनाव परीक्षण के लिए प्रयोगात्मक विधियों के अनुकूलन को बढ़ावा देंगे, उपन्यास, प्रोबायोटिक आधारित पुनः संयोजक उपचारों के विकास के लिए सबसे कारगर तरीकों के लिए रास्ता साफ हो गया।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों इम्यूनोलॉजी और टीकों और एक एनआईएच नई अन्वेषक पुरस्कार (1DP2AI112242-01) के लिए बच्चों के केंद्र ट्रेसी जे मेमने को सम्मानित माध्यम से धन स्वीकार करते हैं। लेखकों को भी rad1 एस के उदार योगदान के लिए धन्यवाद Natalya पी Degtyareva cerevisiae।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartSpec 3000 Spectrophotometer BioRad 170-2501 Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum Eppendorf M1053-4004 Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400 Stratagene 400075-03 Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS 11983044 Fisher Scientific Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter  F378620002 Bel-Art Scienceware Hand held colony counter pen
Replica plating device Fisherbrand 09-718-1 Example of replica plating stand and pads 
Velveteen squares Fisherbrand 09-718-2
L shaped sterile cell spreaders  Fisherbrand 14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes Sigma-Aldrich D7656-1ML Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles Braintree Scientific N-PK 002 For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1 ml sterile slip-tip disposable tuberculin syringe Becton Dickinson BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps Electron Microscopy Sciences 77937-28 Example of blunt forceps needed for dissection 
Straight and curved dissection scissors Electron Microscopy Sciences 72966-02 and 72966-03 Examples of scissors needed for dissection
IMDM Life technologies 12440053

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इम्यूनोलॉजी अंक 108, Auxotroph, Peyer पैच gavage heterologous प्रोटीन GFP यूवी mutagenesis प्रोबायोटिक
प्रोबायोटिक खमीर के परिवर्तन और जठरांत्र इम्यून ऊतकों से उनके वसूली चूहे में मौखिक Gavage के बाद
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Hudson, L. E., Stewart, T. P.,… More

Hudson, L. E., Stewart, T. P., Fasken, M. B., Corbett, A. H., Lamb, T. J. Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice. J. Vis. Exp. (108), e53453, doi:10.3791/53453 (2016).

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