Abstract
Thymus, den primære organ for generering av αβ T-celler og ryggraden i det adaptive immunsystemet hos virveldyr, har lenge vært ansett som den eneste kilde til αβT celler. Likevel begynner thymus involusjon tidlig i livet som fører til en drastisk redusert produksjon av naive αβT celler i periferien. Likevel kan selv hundreåringer bygge immunitet mot nyervervede patogener. Nyere forskning tyder extrathymic αβT celle utvikling, men vår forståelse av trasé som kan kompensere for thymic tap av funksjon er fortsatt rudimental. γδ T-celler er lymfocytter som medfødt som utgjør hoved T-celle-undersett i vevet. Vi har nylig tilskrevet en hittil lite verdsatt enestående funksjon til en γδ T-celle undersett ved å vise at knappe enhet av CD4 + Vδ1 γδ + T-celler kan transdifferentiate αβT inn i cellene i inflammatoriske tilstander. Her, vi pROVIDE protokollen for isolasjon av denne progenitor fra perifert blod og etterfølgende dyrking. Vδ1 celler er positivt anriket fra PBMC fra friske pasienter ved å bruke magnetiske kuler, etterfulgt av et andre trinn hvor vi målrette knappe fraksjon av CD4 + -celler med en ytterligere magnetisk merkingsteknikk. Den magnetiske kraft av den andre merking overstiger en av den første magnetiske etiketten, og således tillater effektiv, kvantitative og spesifikk positiv isolasjon av populasjonen av interesse. Vi introduserer så teknikken og dyrkingsbetingelser som kreves for kloning og effektivt å utvide cellene og for identifisering av de genererte kloner ved FACS-analyse. Dermed gir vi en detaljert protokoll for rensing, kultur og ex vivo utvidelse av CD4 + Vδ1 + γδ T-celler. Denne kunnskapen er en forutsetning for studier som er knyttet til denne αβT celle progenitor`s biologi og for de som tar sikte på å identify de molekylære triggere som er involvert i transdifferensiering.
Introduction
I virveldyr, adaptiv immunitet som er strukturert i mobilnettet og en humoral del av immunitet spiller en stor rolle i forsvaret mot patogener. Erkjennelsen av et bredt spekter av antigener medieres av hyperpolymorphic T- og B-cellereseptorer (TCR / BCR), som med hensyn til T-celler antas å bli produsert hovedsakelig i thymus 1. Dertil, blodkreft stamceller (HSCs), avledet fra benmarg, frø thymus og differensiere sammen veldefinerte faser endelig gir opphav til alle T-celle linjene. Thymus seeding stamfedre er CD4 - og CD8 - og utgjør dermed den umodne, dobbel negativ (DN) thymocytt brøkdel. Thymusavledede signaler deretter indusere sin avstamning engasjement og differensiering til enten αβ eller γδ T-celler. Uttrykket av funksjonelt omorganisert TCR-y og TCR-S kjede gener i DN2 / 3 tymocytter fører til y δTCR komplekser, som driver celleproliferasjonstest end fremme differensiering i γ At celler 2,3. I motsetning til dette rearrangement av en funksjonell TCR-β-kjeden, som kan sammenkobles med preTα å bygge en preTCR pT, induserer transkripsjons stanse av den TCR-γ kjeden i DN3 thymocytter og deres overgang til CD4 + CD8 + dobbelt-positive thymocytter 4 . På dette stadium, rekombinasjon av den TCR-kjede α inntreffer, sletter den TCR-δ locus som ligger godt innenfor den TCR-α locus, således lertid produksjons en γδTCR i disse cellene ugjenkallelig 5-9. Rearrangert αβTCRs blir deretter valgt for sin evne til å binde selv-MHC svakt (positiv seleksjon), som ikke kan overstige en viss terskelverdi for å unngå autoimmunitet (negativ seleksjon). Ifølge deres evne til å binde MHC klasse I eller II, de valgte αβT celler utvikle seg til single-positive CD4 + eller CD8 + T-celler, som exit thymus som naive T-celler.
Men involusjon av thymus starter tidlig i livet fører til eksponentielt redusert produksjon av naive T-celler som er nesten slukket etter oppvekst 10. Ikke desto mindre er størrelsen av T-celle basseng holdes konstant gjennom hele livet, noe som kan forklares bare delvis av post-tymisk homeostatisk proliferasjon av T-celler og spredning av langlivede immunologisk hukommelse 11. Følgelig må extrathymic T-celleutvikling oppstår. Nyere forskning har fått betydelig attraksjon som preget αβT cellestamfedre, som-at extrathymic sider-ga opphav til funksjonell αβ T-celler 12-17. Likevel er detaljert kunnskap om extrathymic αβT celle forløpere som uavhengig fra en thymus differensiere i αβT celler som fragmentarisk som bakgrunn at vi har på ruten de tar dermed.
Vi har nylig identifisert den lille T-celle enhet av Vδ1 + + celler som γδT en extrathymic αβT celle prognitor 18, som da er isolert fra perifert blod fra friske pasienter kan transdifferentiate inn αβT celler i en mild inflammatorisk miljø. Interessant og i strid med homeostatic spredning av post-thymic T-celler, transdifferensiering av Vδ1 CD4 + celler genererer nye T cellereseptorer, og dermed utvide repertoaret mangfold, slik at potensielt nye antigener kan bli gjenkjent og kan beskytte verten mot nyervervede patogener. Dette legger til plastisitet av T-celler og gir en hittil lite verdsatt ny vei for extrathymic T-celleutvikling.
Den kvantitative isolasjon fra lymfocyttiske kilder, generering av encellede kloner og deres effektiv ekspansjon er avgjørende for målet å identifisere disse markørene og molekyler som utløser denne αβT celle precursor`s extrathymic utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Moral Uttalelse: Alle prosedyrer ble utført i henhold til Helsinkideklarasjonen, og ble godkjent av klinisk etikk-komité ved Universitetet i Tübingen (prosjekter 38 / 2009B02 og 470 / 2013B02).
1. Isolering av perifere mononukleære blodceller (PBMC)
- Ta 50-100 ml fra en frisk frivillig via venepunktering ved anvendelse av en 50 ml sprøyte inneholdende 1000 IE heparin-sulfat og fortynne blodet 1: 2 med PBS (pH = 7,2).
- Nøye lag 35 ml av blod: PBS-oppløsning på 15 ml blod separering oppløsning som Biocoll (d = 1,077 g / ml) i en 50 ml konisk rør. Sentrifuger i 15 minutter ved 800 xg ved romtemperatur.
MERK: Bremse må ikke brukes. - Samle celler av lymfocytisk lag med en pipette og vaske cellene to ganger i det minste i 50 ml PBS (sentrifuger i 12 min, ved 400 xg). Fjern supernatanten etter sentrifugering med en pipette.
- Lyse resterende erytrocytter ved å henge og incubating den lymfatisk fraksjon med 1-5 ml av en hypoton buffer løsning for 2-4 min.
MERK: Varighet av eksponering og volum lysebuffer avhenge av den anvendte lysebuffer, og på mengden av røde blodlegemer som er igjen i lymfocyttfraksjonen. - Fortynn cellene med PBS (01:10) og sentrifuger ved 250 xg i 12 min og deretter resuspender og vask cellepelleten en gang i 10 ml PBS ved 300 xg i 12 min.
- Resuspender lymfocytter i PBS og tell cellene i et Neubauer tellekammer ved hjelp av Trypan blå løsning.
MERK: Vanligvis er> 1 x 10 8 lymfocytter mottatt fra 100 ml nytappet perifert blod.
2. Isolering av Vδ1 T celler
- Ta <1 x 10 6 isolerte lymfocytter for en innledende FACS bestemmer hyppigheten av Vδ1 CD4 T-celler.
MERK: Befolkning størrelsen på denne T-celle foretak kan variere sterkt mellom individer og i henhold til deres immunologisk tilstand. Typically, ca. 1% av T-celler er Vδ1 + og omtrent 1-5% av Vδ1 + cellene er CD4 +.- Fortynn cellene med 1 ml FACS-buffer, som består av PBS inneholdende 2% FCS og 5 mM EDTA. Sentrifuge ved 660 x g i 2 min, og dekanter supernatanten. Tilbakeløps volum på omtrent 100 pl FACS buffer er tilstrekkelig for den etterfølgende farging. I korthet vortex og inkuberes cellene med 5 mL Fc-Blokkering reagens i 5 minutter ved RT for å øke spesifisiteten for FACS farging.
- Legg humane monoklonale antistoffer direkte til cellene uten å fjerne Fc-Blokkering reagens. Sørg for å farge cellene med antistoffer mot Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) og TCRαβ (01:25). Klargjør isotypekontroll med de tilsvarende immunglobulinisotyper. Inkuber cellene med antistoff i 20 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellene i 1 ml FACS-buffer (sentrifuge i 2 min, ved 660 x g), dekanter supernatant og fortsett til FACS oppkjøp i den gjenværende buffervolum.
- Pelletisere cellene (som ikke brukes i FACS-analyse) ved sentrifugering i 12 min; 300 g; 8 ° C. Fjern supernatanten og resuspender cellen pelletin 60 ul MACS-buffer per 1 x 10 7 celler. Tilsett 20 mL Fc-Blocking reagens per 1 x 10 7 celler og inkuber i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tilsett 10 pl FITC-konjugert anti-humant antistoff Vδ1 per 1 x 10 7 celler direkte til cellene. Inkuber i 12 min ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellene ved hjelp av 14 ml MACS-buffer (sentrifuger i 12 min, ved 300 g; 8 ° C). Kast supernatant helt og resuspender cellene i 80 mL MACS buffer per 1x10 7 celler.
- Ta 1-2 x 10 5 celler og fortynn dem i 100 ul FACS-buffer for verifisering av merkingen ved hjelp av FACS-analyse. Ingen ytterligere additiver er nødvendig for dette trinnet. Sørg for at det er et tilstrekkestrekkelig forskjell i lysstyrken for Vδ1 - og Vδ1 + celler. Hvis dette ikke er tilfelle, gjenta trinn 2.3) og 2.4).
- Tilsett 20 ul anti-FITC mikrokuler per 1 x 10 7 celler til de gjenværende celler, bland godt og inkuber i 15 minutter i mørke ved 4 ° C. Deretter vaskes cellene ved bruk av minst 10 ml MACS-buffer (sentrifuger i 12 min, ved 300 xg; 8 ° C).
- Under sentrifugeringen likevekt den forhåndskjølt magnetisk kolonne plassert i en magnet med 500 ul MACS-buffer.
- Suspender cellene i 500 mL MACS-buffer (for celle tall høyere enn 1 x 10 8, skalere opp dette volumet tilsvarende) og gjelder cellene nøye på kolonnen. Samle gjennomstrømnings som inneholder Vδ1 - celler.
- Vask kolonnen tre ganger med 500 ul MACS-buffer og samle gjennomstrømnings igjen i det samme rør. Legg merke til at reservoaret må være tom før påføring buffer til kolonnen.
- Fjerne kolonnen fra magnetanordningen og plassere den i et 15 ml konisk rør. Raskt å skylle kolonnen med 1 ml MACS-buffer ved fast å skyve stempelet inn i kolonnen. Samle opp eluatet i et rør.
NB: For å oppnå en renhet på> 98%, er det vanligvis nødvendig å gjenta trinn 2.7 til 2.9) med en andre kolonne. - Bekrefte renheten av celler ved FACS-analyse 18 med det samme antistoff-panel som før (se 2.1.2) og telle cellene.
3. Isolering av Vδ1CD4 + T celler
- Suspender 25 ul av CD4-perler med en vortex for> 30 sek. Vask kulene (den minimale mengde som angitt av produsenten) i 1 ml MACS-buffer i et 1,5 ml reaksjonsrøret ved å plassere røret i en magnet i 1 min. Kast supernatanten forsiktig med en liten-skala pipette (200 ul) og resuspender perlene i det opprinnelige volum av MACS-buffer.
- Pelletisere Vδ1 + celler (sentrifuge for en2 min; 300 xg) og aspirer supernatanten og resuspender alle Vδ1 + celler i 500 mL MACS-buffer og legge dem til røret som inneholder perlene. Det blandes kraftig og inkuberes i 20 min ved 4 ° C med konstant skråstilling (for eksempel i en rotator).
- Plasser røret som inneholder cellene på en magnet for 2 min. Pass på at det ikke er noen rester i lokket.
MERK: CD4 + celler vil ha bundet til de magnetiske kuler, og fester seg til den side av røret som vender mot magneten. - Åpne forsiktig lokket samtidig holde røret inne i magnetanordningen og samle supernatanten som inneholder CD4 - Vδ1 + -celler ved hjelp av en liten-skala pipette. Plasser CD4 - Vδ1 + -celler i et separat rør og plassere dette rør inn i magnet på nytt for å unngå eventuelt resterende CD4-celler eller perler fra populasjonen.
- Vask CD4 - celler i 5 ml MACS-buffer (sentrifuger i 12 min, ved 300 xg) and resuspender dem i en konsentrasjon på 1 x 10 5 celler per 100 ul media. CD4 - celler kan lett dyrkes under de vilkår som er gitt nedenfor (4,2).
- Plasser røret med CD4 + celle mål utenfor magnetfeltet, resuspender cellene i 500 mL MACS-buffer og sette dem tilbake i den magnetiske enheten. Gjenta trinn 3.3 til 3.5 to ganger for å oppnå en høyere renhet. Fjern supernatanten ved pipettering
- Suspender CD4 + celler i 100 ul kulturmedium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin) og tilsett 10 pl av en perle-løsne-løsning. Inkuber ved RT i 45 min med konstant skråstilling (for eksempel i en rotator).
- Plassere cellene i en magnet i 1 min. Samle forsiktig supernatanten inneholdende perle-fri Vδ1 + CD4 + celler ved hjelp av en liten-skala pipette.
- Utenfor magnet, resuspender perler med 100 ul kulturmedier og gjentatrinn 3,6 og 3,7 ganger for å oppnå høyere celletall av CD4 + celler.
- Pelletisere cellene (sentrifuger ved 300 xg, for 12 min) og kast supernatanten helt ved pipettering. Suspender cellene i friske, forvarmet media og telle dem. Undersøke renheten av Vδ1 + CD4 + celler ved FACS-analyse som er vist i trinn 2.1.1-2.1.3.
4. Single-celle Kloning av Limited fortynning
- Isolere perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra en allogen donor som vist på 1,1 til 1,6.
- Bestråle 2,5 x 10 7 allogene PBMC med 80 Gy i 25 ml dyrkningsmedier ved hjelp av γ-stråling.
- Legg IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) og PHA (2 ug / ml) til de bestrålte feeder-celler og fordele dem i 96-brønn U-formede plater, 5 x 10 4 mater celler i 50 mL per brønn.
- Fortynn de Vδ1 + CD4 + celler til en konsentrasjon på 0,3 celler pr 50 ul. Pipette 50 ul av celleløsning til hver brønn huse de bestrålte celler og cytokiner.
MERK: Dermed er cytokinene fortynnes til den endelige konsentrasjon på 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 og 1 ug / ml PHA. Inkuber 96-brønners plater i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 fuktet atmosfære.- Eventuelt, dyrke rester renset Vδ1 + CD4 + celler som bulk kultur under samme dyrkningsforhold som kloner.
- Forsyne cellene hver 3-4 dager med cytokiner og ferske media. For dette utveksling halvparten av mediet i brønnene med 50 mL friskt medium ved pipettering. Legg to ganger konsentrasjonen av cytokiner til alle tilskudd. Legg 5x10 4 bestrålte mater celler per brønn annenhver runde med fôring.
- Ved hjelp av et mikroskop, observere første kloner blir synlig etter 3-4 uker, mens de metaboliserer, og dermed endre farge på kulturmediet, og danner kolonier.
MERK: For pelsther dyrking, resuspender kloner godt og overfør dem til å skille 96-brønners plater. Analyser cellene via FACS som angitt i 2.1.1-2.1.3. Kloner holdes under disse forholdene etter hvert kan endre sin TCR fra Vδ1 til αβTCR. Tidspunktet for denne transdifferensiering varierer fra klon til klon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser de forskjellige stadier og resultatet av isolering av Vδ1 T-celler fra perifert blod. Figur 1A viser en typisk fordeling av Vδ1 + -celler i CD3 + lymfocytter, så vel som ko-reseptor ekspresjon av Vδ1 + populasjonen. I denne donor, er frekvensen av Vδ1 + -celler (rød) 2,3% av totalt antall lymfocytter og CD4-ekspresjon (grønn) av Vδ1 + lymfocytter er 2,6%. Til sammen representerer målgruppen for isolering 0,06% av totalt antall lymfocytter i denne donor. Figur 1B viser en optimal fargeintensitet for Vδ1 + celler før du går videre til den magnetiske merking. Farging med det primære antistoff bør resultere i klart atskilte Vδ1 negative og positive Vδ1 populasjoner, slik at Vδ1 + celler effektivt kan merkes, og som er adskilt med magnetmagnetiske kuler. figur 1C avbilder Vδ1 + celler etter isoleringsprosedyren ved FACS-analyse. Renheten av Vδ1 + er vanligvis> 99% CD3 + -celler. For å øke renheten, er isolerte cellene påføres på en andre kolonne isolasjon. Dette resulterer i betydelig celletap men dette trinn fører til kvantitativ eliminering av potensielt forurensende TCRαβ + CD4 + celler.
Resultatene av CD4 + isolasjon er vist i figur 2. På grunn av det lave antall CD4 + Vδ1 + celler, og siden cellene ekspanderes i en begrenset fortynning enkelt-celle kloning tilnærming renhet av CD4 + celler mindre enn 100% mulig tolereres. I forsøket vist her, renheten av Vδ1 + CD4 + celler var omtrent 90% (figur 2A, til høyre blot) og etterfølgende enkeltcelle kloning resulterte i mer enn 60 Vδ1+ CD4 + T-cellekloner. Derimot har i Vδ1 CD4 + - fraksjonen ingen CD4 + celler forble (figur 2B), som fremhever at effektiviteten av denne isolasjon strategien. Av notatet, CD4 + celler (blå) uttrykker Vδ1 på en identifiserbar lavere nivå enn CD4 - celler (red) (Figur 2A, begge blotter). Således må farging av Vδ1 + -celler være overdreven-som beskrevet i protokoll-i en tilstrekkelig merking og vellykket isolering av CD4 + fraksjonen i Vδ1 + T-celle-pool.
I figur 3A, er den typiske fenotypen til en ny klon presentert. TCR består av en Vδ1 og en Vγ9 kjede og de klonale celler uttrykker CD3 og CD4. Figur 3B viser prosessen med å transdifferensiering av en klon isolert med den teknikk som presenteres. Transdifferensiering inkluderer downregulatipå over V'1-kjeden til et lavt ekspresjonsnivå, som er parallell med de novo uttrykk for en αβTCR. Dette fører til en transient TCR-dobbelt-positive fenotype som til slutt gir opphav til enkelt-positive αβTCR-uttrykkende T-celler. Ko-reseptor uttrykk kan også endre seg i løpet av transdifferensiering. I likhet med thymocytter, en CD4 + CD8 + DP fenotype forekomme, noe som etterhvert utvikler seg til enten SP CD4 + eller CD8 + T-celler αβ. Under dyrkningsforholdene som presenteres her, er transdifferensiering en sjelden hendelse som bare én av 50 kloner endret sin Vδ1 + TCR inn αβTCR.
Figur 1. FACS analyser overvåke alle faser av isoleringsprosessen V δ1 T-celler fra perifert blod. (A </ strong>) Fordeling av Vδ1 + celler (rød) i CD3 + celler i perifert blod lymfocytter og deres co-reseptor uttrykk. CD4 + Vδ1 + celler er angitt i blått (sirkel). (B) Farging av Vδ1 brøkdel før du går videre til magnetisk merking. (C) FACS-analyse av Vδ1 + celler fra positive fraksjon etter isolering. Tallene angir prosent av gated celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. FACS-analyser av V δ en CD4 + isolater (A) CD4 + fraksjonen, og (B) CD4 -. Fraksjonetter at CD4 + celleisolasjon. Tallene angir prosent av gated celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Fenotypisk analyse av en klone rett etter oppdagelsen. (A) TCR sammensetning og co-reseptor uttrykk for en fersk isolert klone. Vδ1 og Vγ9 TCR er co-uttrykkes med CD3 og CD4. (B) Prosess av transdifferensiering i en CD4 + Vδ1 + klone. Endring av TCR uttrykk (øverst), og skifte av co-reseptor uttrykk (nederst) 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å studere fenotype, biologien og funksjonen av en knapp (T-) celleenhet, nemlig Vδ1 + CD4 + -T-celler, benyttes det to markører: Vδ1 og CD4 for sin positive magnetiske celleisolasjon. Vδ1 er frittstående reseptor, mens CD4 uttrykkes på T-hjelperceller, på et lavere nivå på monocytter og dendrittiske celler, og på et meget lavt nivå på hematopoetiske stamceller.
Teknikker for anriking og seleksjon av celler i høy renhet inkluderer fluorescensaktivert cellesortering (FACS), en teknikk som skiller en populasjon av celler i underpopulasjoner basert på fluorescerende merking. Celler farget ved hjelp av fluoroforen-konjugerte antistoffer kan skilles fra hverandre, avhengig av hvilken fluorofor (er) at de har bundet. Sorterere kan oppnå renhet nær 98% 19, noe som er nyttig hvis det bare er en nødvendighet som sorterings selv. Ulempene ved denne teknikken inkluderer at sorterte celler viser en nedgang i celle vievne, og i vår målgruppen også et redusert potensial for transdifferention. En redusert cellelevedyktigheten etter sortering er antatt å være på grunn av skjærkreftene og hydrodynamiske belastning som FACS pålegger celler. Dessuten, for å holde cellene levedyktige og uten forurensning for etterfølgende kultur, må forsøket gjennomføres i aseptiske sterile betingelser som er vanskelig å håndtere. I tillegg anbefales FACS sortering høyt antall celler for sortering.
Isolasjon Kits er utviklet fra flere selskaper for direkte magnetisk merking og sortering av celler i henhold til flere markører overflaten. Sin strategi er avhengig av fjerning av den magnetiske etiketten fra cellene etter det første slag ved hjelp av en frigjørings reagens, som enten enzymatisk eller kompetitivt fjerner magnetiske etiketten fra struktur til hvilken det var bundet. Dette tillater en andre magnetisk merking og separering av cellene for en annen overflatemarkør av interesse that oppnås ved hjelp av enten direkte eller indirekte merking med magnetiske kuler. Fjerning av etiketten anbefaler å arbeide ved lave temperaturer (på is, ved 2-8 ° C) i lengre perioder, eksponering for et kjemisk og gjentatte vasketrinn. Dersom målcellene i den andre parameteren separasjon er tilstede i en lav konsentrasjon etter valg (<10% målceller i positiv fraksjonen etter at den første separasjon) og med en andre runde for å fjerne gjenværende ofany magnetisk merkede celler er nødvendig. Denne fremgangsmåten er-foruten å ha et betydelig tap av målceller på grunn av gjentatte vasketrinn-med høy risiko for indusering av cellulær skade og tap av funksjon på grunn av mekaniske og fysiologiske stressfaktorer. Sammenlignet med FACS sortering imidlertid cellepreparater forbli sterile og mindre celle tall kan sorteres.
Strategien som vi forfølge kombinerer to fortløpende utført positive valg, men fjerning av den første etiketten er ikke nødvendig som magnetic etiketter avviker i størrelsesordenen av de magnetiske krefter av flere log faser. Mens det første anti-fluorkrom magnetisk merkede perletypen er liten, med en diameter på 50 nm, den andre anti-fluorkrom magnetisk merkede perleformede tiltak 1 til 4,5 um, noe som er større enn volumet / styrken av den første magnetiske etiketten 20 til 90-fold. I tillegg utelater den andre positive sort stress i cellene, som er forbundet med magnetisk kolonne retensjon / release-celler som forblir i en 1,5 ml hetteglass som er satt inn en magnetisk enhet, slik at merkede cellene er festet til veggen av ampullen. Vaskeprosedyrer kan holdes på en liten skala. Dette utdypes protokollen reduserer celle tap og øker celle levedyktighet siden cellene opplever mindre manipulasjon og bestå isolasjon prosessen raskere enn protokoller ved hjelp av Multi isolasjon kit systemer.
Følgelig tillater denne protokollen for å separere og med et lite antall celler, og en annen fordel: sorterte cellene forbli sterile gjennom hele prosedyren. Påfølgende kloning eksperimenter med begrenset fortynning sørger for effektiv utbygging av enkeltmedlemmer av de isolerte celler, her den svært knappe Vδ1 + CD4 + γδ T-celle enhet 18. Sorterte cellene viser utmerket levedyktighet og clonogenicity og forbli fullt funksjonell.
For fremtidige applikasjoner, bruker denne strategien for å kvantitativt velge og hell rense små T celle virksomheter fra ulike menneskelige kilder inkludert nytappet perifert blod, (mobilisert) leukaferese produkter, ledningen blod og benmarg ved å kombinere to fortløpende utført positive valg ved hjelp av magnetiske etiketter som skiller seg av størrelsesorden i deres magnetiske krefter og dermed oppbevaring kapasitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
