Abstract
हृदय रोग के कारण गहन जीवन शैली में परिवर्तन करने के लिए पूरी दुनिया विपत्तियां। दिल उत्थान की मरम्मत और कारण चोट और बीमारी के लिए खो दिया cardiomyocytes बहाल करने के लिए महान वादा रखती है। कुछ कम रीढ़ की मजबूत हृदय उत्थान के विपरीत, वयस्क स्तनधारी दिलों आम तौर पर दिल उत्थान और मरम्मत के लिए कम से कम क्षमता दिखा। हालांकि, हाल के अध्ययन (P7 करने के लिए पी 1) 1-7 प्रसव के बाद दिन के बीच, नवजात माउस दिल शिखर लकीर (यानी, शल्य विच्छेदन और बाएं निलय सुप्रीम का जोखिम) के बाद महत्वपूर्ण पुनर्योजी क्षमता को बरकरार रखे हुए है कि खोजने के साथ काफी वैज्ञानिक ब्याज खड़ा किया है। इस खोज के ऊपर एक बड़ा विवाद को दोहराने या इस महत्वपूर्ण खोज पर विस्तार करने के प्रयासों में इस्तेमाल किया विविध सर्जरी से संबंधित प्रक्रियाओं के कारण हो सकता है। ये निर्देश गतिशील रूप से एक माउस मॉडल में शिखर लकीर के लिए सामग्री और कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं। इस कृंतक surviva की मुख्य कदमएल सर्जरी हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण, थोरैकोटॉमी, दिल निलय सुप्रीम की शल्य विच्छेदन, और सिवनी और चूहों की वसूली शामिल है। हृदय अनुसंधान के लिए शिखर लकीर माउस मॉडल के आवेदन का विस्तार कर सकता वर्णित दृष्टिकोण।
Protocol
सभी माउस प्रयोगों प्रोटोकॉल संख्या H0083R3 साथ राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) में पशु की देखभाल और उपयोग कार्यक्रम द्वारा अनुमोदित किया गया। NHLBI IACUC दर्दनाशक दवाओं के बिना प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी।
नवजात चूहों में 1. हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण
- सर्जरी से पहले एक आटोक्लेव में स्पंज और शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित। सभी सर्जिकल सामग्री को तैयार है और 270 डिग्री सेल्सियस के लिए 240 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए अग्रिम में एक गर्म मनका अजीवाणु 15-20 मिनट पर स्विच।
- ताजा बिस्तर और घोंसले के शिकार सामग्री के साथ एक साफ माउस पिंजरे में उनके नर्सिंग माँ से सब C57BL 6 / पिल्ले (उम्र P1) के स्थानांतरण। पिल्ले एक शल्य चिकित्सा कक्ष में रखा जाता है एक बार, अपने समय मां से अलग कर बिताया और मातृ cannibalization के जोखिम को कम करने के लिए कम से कम करने के लिए तुरंत शिखर सर्जरी प्रदर्शन करते हैं।
- एक बर्फ बिस्तर पर स्पंज रखो और ~ 3 मिनट हाइपोथर्मिया संज्ञाहरण को प्राप्त करने के लिए तो स्पंज पर एक पिल्ला जगह है। एपी को देख कर संज्ञाहरण की पुष्टिNea और akinesia और एक रियर पैर बन्द रखो। बहुत कम समय पिल्ला अगतिक और श्वासरोध, और जीवित रहने की दर 12 कम कर सकते हैं संज्ञाहरण का एक अत्यधिक अवधि नहीं कर देगा अक्सर क्योंकि नवजात शिशुओं की स्थिति की जाँच करें।
2. Thoracotomy
- एक शल्य benchtop क्षेत्र पर बर्फ बिस्तर से पिल्ला स्थानांतरण और एक लापरवाह स्थिति में उसके हाथ, पैर, और पूंछ स्थिर करने के लिए टेप का उपयोग करें।
- Betadine का उपयोग कर छाती कीटाणुरहित और धीरे से एक 70% शराब प्रस्तुत करने का पैड का उपयोग कर यह साफ।
- एक Vannas वसंत कैंची का उपयोग कर छाती गुहा के आगे पसलियों के बीच क्षेत्र के साथ एक अनुप्रस्थ त्वचा चीरा करें, और उसके बाद दिल के लिए उपयोग की सुविधा के लिए आगे पसलियों के बीच मांसपेशियों काटना कुंद।
नोट: खून की कमी शल्य प्रक्रिया के दौरान कम से कम है जब जीवित रहने की दर में सुधार होगा।
हार्ट वेंट्रिकुलर एपेक्स 3. शल्य विच्छेदन
- हाथ से, धीरे अमल करने के लिए पेट पर दबाव लागूदिल के शीर्ष। स्पष्ट दृश्य के लिए बाँझ कपास इत्तला दे दी applicators के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र के आसपास रक्त को अवशोषित। दिखावा संचालित नियंत्रण नवजात शिशुओं के लिए, 4 (सिवनी और चूहों की वसूली) चरण के लिए सीधे आगे बढ़ना।
- एक आवर्धक दीपक और कैंची iridectomy का उपयोग कर के तहत, धीरे एल.वी. चैम्बर सामने आ रहा है, जब तक बाएं वेंट्रिकल (एल.वी.) के टुकड़ों लकीर प्रदर्शन करते हैं। एल.वी. का उच्छेदन भागों को कम करने के लिए सावधान रहें। करीब 15% लकीर एल.वी. चैम्बर के इष्टतम जोखिम को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
- एल.वी. चैम्बर सामने आ रहा है एक बार दिल छाती गुहा के लिए देता है कि सुनिश्चित करें।
4. सिवनी और चूहों की रिकवरी
- बाँझ प्रोलाइन 6-0 टांके का उपयोग कर छाती गुहा सील करने के लिए एक साथ पसलियों और मांसपेशियों सीवन, और फिर ध्यान से त्वचा गोंद का उपयोग त्वचा चीरा साइट को बंद करें।
- वसूली के लिए ~ 3 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के तहत नवजात शिशु गर्म है, और उसके बाद एक 70% शराब प्रस्तुत करने का पैड befo का उपयोग करते हुए रक्त और गोंद के निशान को साफअपने littermates करने के लिए इसे reintroducing रहे हैं। मां से अलग बिताए समय को कम करने के शिखर लकीर के बाद पिल्ला अस्तित्व को बेहतर बनाता है, क्योंकि 10 मिनट के भीतर पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया को पूरा करने की कोशिश करो।
- प्रत्येक सर्जरी के बाद, पूरा नसबंदी के लिए लगभग 20 सेकंड के लिए गर्म मनका अजीवाणु के मोतियों के साथ संपर्क में सर्जिकल उपकरण जगह है। सर्जिकल उपकरण प्रत्येक सर्जरी से पहले आर टी को शांत करने की अनुमति दें।
- एक कूड़े में सभी पिल्ले के लिए सर्जरी पूरी करने के बाद मां का घोंसला करने के लिए उन्हें लौटने से पहले मां के बिस्तर और मलमूत्र के साथ पिल्ले मिश्रण।
नोट: आम तौर पर, आईसीआर / सीडी 1 चूहों बेहतर पालक C57BL / 6 से माताओं, लेकिन फिर भी एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के नर्सिंग माताओं के बीच में हैं, को बढ़ावा देने प्रवृत्ति बदलती हैं। एक नर्सिंग माँ बदल रहा है, मातृ cannibalization द्वारा मृत्यु दर को कम करने के एक नर्सिंग माँ को P0 पिल्ले को हटाने और फिर P1 पर शिखर लकीर प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। केवल दिखावा ऑपरेशन या शिखर आर या तो प्रदर्शनपिल्ले की एक कूड़े में esection, मिश्रण दिखावा और शल्य चिकित्सा पिल्ले पिल्ले 6 की शल्य चिकित्सा समूह के जीवित रहने की दरों में कमी कर सकता है।
5. शल्य चिकित्सा के बाद विश्लेषण
- एक दिन सर्जरी के बाद, पिल्ले की निगरानी दिखावा और शल्य चिकित्सा समूहों के बीच कोई अंतर नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, और जीवित रहने की दर को मापने के लिए पिल्ले की संख्या गिनती। सर्जरी ठीक से प्रदर्शन कर रहे हैं, जीवित रहने की दरों दिखावा और सर्जिकल दोनों समूहों में इसी तरह के और अधिक से अधिक से अधिक 60% होना चाहिए।
- हार्ट अलगाव और निर्धारण।
- 1 दिन में पिल्ले और ग्रीवा अव्यवस्था से मौत के आश्वासन के साथ सीओ 2 के द्वारा कत्ल और 21 दिन के बाद सर्जरी के माध्यम से 2 के बाद सर्जरी euthanize, तो एक 70% शराब तैयार करने का उपयोग कर छाती साफ।
- छाती के midline त्वचा और मांसपेशियों काटकर अलग कर देना और फिर छाती खुला।
- वक्ष गुहा से पूरे दिल आबकारी एवं 4% paraformaldehyde हे / आरटी पर एन के 5 मिलीलीटर में प्रत्येक नमूने की पूरे दिल को ठीक।
- अगले दिन, 70% इथेनॉल के लिए नमूने हस्तांतरण। नमूने आयल एम्बेडिंग से पहले एक सप्ताह तक संग्रहित किया जा सकता है।
- स्लाइस 5-माइक्रोन मोटी आयल पूरे वेंट्रिकल के माध्यम से वर्गों और पुनर्योजी प्रतिक्रिया 5, 7 की जांच करने के लिए मानक hematoxylin और eosin (एच एंड ई) और मैसन का Trichrome धुंधला प्रदर्शन करते हैं। विशेष रूप से, एच एंड ई दाग पेशी प्रतिस्थापन की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है और मैसन का Trichrome दाग प्रयोग किया जाता है तंतुमय प्रतिक्रियाओं 5 की जांच करने के लिए।
- रुचि के क्षेत्र का चयन करें और स्वयं एक स्लाइड स्कैनर का उपयोग नमूना के अनुसार कम से कम तीन foci की स्थापना की। छवि और तयशुदा मापदंडों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार 40 × बढ़ाई धुंधला स्लाइड का विश्लेषण।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
माउस पिल्ले 1, 2, और 21 दिनों के बाद शिखर लकीर euthanized थे, और उनके दिल और एच ई और मैसन का Trichrome दाग के लिए एकत्र किए गए थे। मैसन का Trichrome दाग में ब्लू रंग एपिकार्डियल बाह्य मैट्रिक्स 5 के बयान को इंगित करता है। चित्रा 1 ए के रूप में दिखाया सफल शिखर लकीर के साथ, एक खून का थक्का प्रभावी ढंग से, एल.वी. एक दिन के बाद शिखर लकीर सील करने के लिए बनाई है। खून का थक्का और जल्दी हृदय फाइब्रोसिस के एक क्रमिक अवशोषण मनाया जाता है, और मायोकार्डियम की पूरी उत्थान 21 दिनों के शिखर लकीर के बाद (चित्रा 1 बी और सी) के लिए जगह लेता है जब तक दौरे ऊतक द्वारा प्रतिस्थापन होता है। रूपात्मक विश्लेषण 21 दिन शल्यक्रिया के बाद (चित्रा 1 सी और डी) पर resected और दिखावा संचालित दिलों के बीच कोई अंतर को दर्शाता है।
चित्रा 1. प्रतिनिधि एच ई और मैसन काTrichrome दाग। नवजात माउस दिलों 1 (ए), 2 (बी), या शिखर लकीर के बाद 21 (सी) के दिन और दिखावा ऑपरेशन (डी) के बाद 21 दिनों की वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम। प्रत्येक subfigure के लिए, बाएं पैनल के पैमाने पर पट्टी 1 मिमी है और सही पैनल के पैमाने पर पट्टी 100 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
इस लेख के लिए प्रकाशन फीस डॉ जियान होउ को ललित विज्ञान उपकरण से एक उपहार द्वारा प्रायोजित किया गया।
Acknowledgments
लेखकों डीआरएस धन्यवाद। जेम्स हॉकिन्स, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े से जेड यू-शी यू और जुआन क्यू, और माउस सर्जरी और तैयारी और आयल वर्गों के धुंधला के साथ उनकी सहायता के लिए रक्त संस्थान (NHLBI)। लेखकों संपादकीय सहायता के लिए एनआईएच अध्येताओं संपादकीय बोर्ड के आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
