Abstract
Kardiovaskulær sykdom plager hele verden på grunn av intensiv livsstilsendringer. Hjerte regenerering har store løftet for å reparere og restaurere kardiomyocytter tapt på grunn av skader og sykdom. I motsetning til den robuste hjerte regenerering av visse lavere virveldyr, voksne pattedyr-hjerter typisk vise minimal kapasitet for hjerte regenerering og reparasjon. Imidlertid har nyere studier utløste betydelig vitenskapelig interesse med funn at mellom postnatal dag 1 til 7 (P1 til P7), beholder den neonatale mus hjertet betydelig regenerativ potensial etter apikale reseksjon (dvs. kirurgisk amputasjon og eksponering av venstre ventrikkel apex). En stor uenighet dette funnet kan være på grunn av de ulike kirurgi-relaterte prosedyrer som brukes i arbeidet med å gjenskape eller utvide på dette viktige funn. Disse instruksjonene dynamisk presentere de materialer og metoder for apikale reseksjon i en musemodell. De viktigste trinnene i denne gnager survival kirurgi involvere hypotermi anestesi, toraktomi, kirurgisk amputasjon av hjertet ventrikkel apex, og sutur og utvinning av mus. Tilnærmingen beskrevet kunne utvide anvendelsen av den apikale reseksjon musemodell for kardiovaskulær forskning.
Protocol
Alle mus eksperimenter ble godkjent av Animal Care og bruk Program ved National Institutes of Health (NIH) med protokollnummer H0083R3. Den NHLBI IACUC godkjent protokollen uten smertestillende.
1. Hypotermi Anestesi i Neonatal Mus
- Sterilisere svamper og kirurgisk utstyr i en autoklav før operasjonen. Forberede alle kirurgiske materialer og slå på en varm perle sterilisator 15-20 min på forhånd for å nå 240 ° C til 270 ° C.
- Overfør alle C57BL / 6 unger (alder P1) fra sin ammende mor til en ren mus bur med friskt sengetøy og hekkende materialer. Når valpene blir tatt i en operasjon rom, utføre apikale operasjonen raskt for å minimere sin tid brukt skilt fra moren og for å redusere risikoen for mors kannibalisering.
- Sett svamper på en is seng og deretter plassere en valp på svampen for ~ 3 min å oppnå hypotermi anestesi. Bekreft anestesi ved å observere apnea og akinesi og knipe en bakre foten. Sjekk status for nyfødte ofte fordi for lite tid ikke vil gjøre valpen akinetisk og apneic, og en overdreven varigheten av anestesi kan redusere overlevelsen 12.
2. Torakotomi
- Overfør valpen fra isen sengen på en kirurgisk Borstemmaskin området og bruke tape for å immobilisere sin armer, ben og hale i liggende stilling.
- Desinfiser brystet ved hjelp av betadine og forsiktig rense den ved hjelp av en 70% alkohol prep pad.
- Lag en tverrgående snitt i huden langs frem interkostale delen av brysthulen ved hjelp av en Vannas Spring Scissor, og deretter sløv dissekere frem interkostalrom muskler for å lette tilgangen til hjertet.
MERK: Overlevelse bedre når blodtap minimeres under den kirurgiske prosessen.
3. Kirurgisk Amputasjon of the Heart Ventrikulært Apex
- For hånd, press forsiktig på magen til exteriorize denapex av hjertet. Absorbere blod rundt den kirurgiske området med steril bomull-tipped applikatorer for klar visualisering. For humbug-opererte kontroll nyfødte, gå direkte til trinn 4 (Sutur og gjenoppretting av mus).
- Under et forstørrelses lampe og ved hjelp av iridectomy saks, forsiktig utføre stykkevis fjerning av venstre ventrikkel (LV) til LV kammeret er utsatt for. Vær nøye med å minimere resected deler av LV. Omtrent 15% reseksjon er nødvendig for å oppnå optimal eksponering av LV kammer.
- Sørg for at hjertet returnerer til brysthulen når LV kammeret utsettes.
4. Sutur og gjenoppretting av Mus
- Sutur ribbeina og musklene sammen for å forsegle brysthulen ved hjelp av sterile Proline 6-0 sting, og lukk deretter huden innsnitt området forsiktig med huden lim.
- Varm den nyfødte under en varmelampe for ~ 3 min for å bli frisk, og deretter rense blodet og lim spor ved hjelp av en 70% alkohol prep pad before gjeninnføre det til sine kullsøsken. Prøv å fullføre hele kirurgisk inngrep innen 10 min fordi minimere tiden brukt skilt fra moren forbedrer valpen overlevelse etter apikal reseksjon.
- Etter hver operasjon, plasseres kirurgisk verktøy i kontakt med perler av den varme perle sterilisatoren i omtrent 20 sekunder for fullstendig sterilisering. La de kirurgiske verktøy for å avkjøles til romtemperatur før hver operasjon.
- Etter å ha fullført operasjoner for alle valpene i et kull, bland valpene med mors sengetøy og ekskrementer før du returnerer dem til morens reir.
MERK: Vanligvis ICR / CD-en mus er bedre fostermødre enn C57BL / 6, men selv blant ammende mødre med samme genetisk bakgrunn, fremme instinkter variere. Hvis du endrer en ammende mor er nødvendig for å redusere dødeligheten av mors kannibalisering, fjerne P0 valpene til en ammende mor og deretter utføre apikale reseksjon på P1. Bare utføre enten humbug drift eller den apikale resection i ett kull av valper, fordi blande humbug og kirurgiske unger kunne redusere overlevelsen av den kirurgiske gruppen av valpene 6.
5. Post-kirurgisk Analysis
- En dag etter operasjonen, overvåke valpene, sørge for at det ikke er noen forskjell mellom humbug og kirurgiske grupper, og telle antall valper å måle overlevelse. Hvis operasjoner er utført på riktig måte, bør overlevelse være lik og større enn 60% i både humbug og kirurgiske grupper.
- Hjerte isolasjon og fiksering.
- Avlive valpene på dag 1 og 2 etter operasjonen via halshogging og dag 21 etter kirurgi av CO2 med en forsikring om døden ved halshugging, rengjør deretter brystet ved hjelp av en 70% alkohol prep.
- Incise midtlinjen hud og muskel i brystet og deretter åpne brystet.
- Skjære hele hjerter fra brysthulen og feste hele sentrum av hver prøve i 5 ml av 4% paraformaldehyd O / N ved RT.
- På den neste dag, overføre prøvene til 70% etanol. Prøver kan lagres i opptil en uke før parafin innebygging.
- Slice 5-mikrometer tykke parafinsnitt gjennom hele ventrikkelen og utføre standard hematoxylin og eosin (H & E), og Masson s Trichrome farging for å undersøke den regenerative respons 5, 7. Spesifikt er H & E flekken brukes til å undersøke muskel utskifting og Masson s Trichrome flekk benyttes å undersøke fibrotiske reaksjoner 5.
- Velg område av interesse og sette opp minst tre brennpunkter per prøve manuelt ved hjelp av et lysbilde skanner. Bilde og analysere farging lysbilder på 40 × forstørrelse i henhold til produsentens instruksjoner med standard parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Museunger ble avlivet 1, 2, og 21 dager etter apikal reseksjon, og deres hjerter ble samlet for H & E og Masson er Trichrome flekken. Blå farge i Masson sin Trichrome flekken indikerer avsetning av epikardial ekstracellulære matrise 5. Med vellykket apikale reseksjon, er en blodpropp effektivt dannet for å forsegle den LV en dag post-apikal reseksjon, som vist i figur 1A. En gradvis resorpsjon av blodpropp og tidlig hjertefibrose observeres, og erstatning av myokardialt vev skjer helt til fullstendig regenerering av myokard finner sted 21 dager etter reseksjon apikale (figur 1B og C). Morfologisk analyse viser ingen forskjell mellom resekterte og humbug-opererte hjerter på 21 dager etter operasjon (figur 1C og D).
Figur 1. Representant H & E og Masson sTrichrome flekken. Ventrikulært myocardium av neonatal mus hjerter 1 (A), 2 (B), eller 21 (C) dager etter apikale reseksjon og 21 dager etter humbug drift (D). For hver subfigure, er omfanget linjen i venstre panel 1 mm og omfanget linjen i panelet til høyre er 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne artikkelen ble sponset av en gave fra fine Science Tools Dr. Jian Hou.
Acknowledgments
Forfatterne takker legene. James Hawkins, Zu-Xi Yu og Xuan Qu fra National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) for deres hjelp med musen kirurgi og forberedelse og farging av parafinsnitt. Forfatterne er takknemlige til NIH Fellows Editorial Board for redaksjonell bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
