Abstract
Hjärt-kärlsjukdom plågar hela världen på grund av intensiva livsstilförändringar. Hjärta förnyelse är mycket lovande för att reparera och återställa cardiomyocytes förlorade på grund av skador och sjukdomar. I motsats till den kraftiga hjärtregenerering av vissa lägre ryggradsdjur, vuxna hjärtan däggdjur visar vanligtvis minimal kapacitet för hjärt förnyelse och reparation. Dock har nya studier väckt stort vetenskapligt intresse med konstaterandet att, mellan postnatal dag 1-7 (P1 till P7), behåller neonatal mushjärta betydande regenerativ potential efter apikal resektion (dvs kirurgisk amputation och exponering av vänster kammare apex). En stor kontrovers över detta fynd kan bero på de olika kirurgi relaterade metoder som används i arbetet med att replikera eller expandera på denna viktiga fynd. Dessa instruktioner dynamiskt presentera material och metodik för apikal resektion i en musmodell. De framträdande stegen i denna gnagare survival kirurgi innebär hypotermi anestesi, torakotomi, kirurgisk amputation av hjärtventrikulära apex och sutur och återvinning av möss. Tillvägagångssättet beskrivs skulle kunna expandera tillämpningen av den apikala resektion musmodell för kardiovaskulär forskning.
Protocol
Alla mus experiment har godkänts av Animal Care och användning Program vid National Institutes of Health (NIH) med protokoll nummer H0083R3. NHLBI IACUC godkände protokollet utan smärtstillande medel.
1. Hypotermi Anestesi i neonatal möss
- Sterilisera svampar och kirurgisk utrustning i en autoklav innan operationen. Förbered alla kirurgiska material och slå på en varm pärla autoklav 15-20 min i förväg för att nå 240 ° C till 270 ° C.
- Överföra alla C57BL / 6 valpar (okänd P1) från deras ammande mamma till en ren mus bur med nytt strö och häckande material. När valparna tas i en operation rum, utför apikalkirurgi snabbt för att minimera sin tid separeras från mamman och för att minska risken för moderns cannibalization.
- Sätt svampar på en is säng och sedan placera en valp på svampen för ~ 3 minuter för att uppnå hypotermi anestesi. Bekräfta anestesi genom att observera apnea och akinesi och nyper en bakre foten. Kontrollera status för nyfödda ofta eftersom för lite tid inte kommer att göra valpen akinetiskt och apnoisk och en orimligt lång tid i anestesi kan sänka överlevnaden 12.
2. Torakotomi
- Överför valpen från isen sängen på en kirurgisk bänk område och använda tejp för att immobilisera dess armar, ben och svans i ryggläge.
- Desinficera bröstet med hjälp av Betadine och försiktigt rengöra den med en 70% alkohol prep pad.
- Gör en tvär hud snitt längs den fjärde interkostal delen av brösthålan med hjälp av en Vännäs Spring Scissor, och sedan trubbigt dissekera fram interkostal musklerna att underlätta tillgången till hjärtat.
OBS: Överlevnaden förbättras när blodförlusten minimeras under den kirurgiska processen.
3. Kirurgisk Amputation av hjärtan kammar Apex
- För hand, tryck försiktigt på magen för att exteriorize denspetsen av hjärtat. Absorbera blod runt operationsområdet med sterila bomullspinne applikatorer för tydlig visualisering. För skenopererade kontroll nyfödda, gå direkt till steg 4 (Suture och återställning av möss).
- Under ett förstoringsglas lampa och använder iridektomi sax, försiktigt utföra styckevis resektion av den vänstra kammaren (LV) tills LV kammare exponeras. Var noga med att minimera resekterade delarna av LV. Cirka 15% resektion är nödvändigt för att uppnå optimal exponering av LV kammaren.
- Se till att hjärtat återgår till brösthålan när LV kammaren exponeras.
4. Suture och återställning av möss
- Sutur revben och muskler tillsammans för att täta brösthålan med sterila Proline 6-0 suturer och stäng sedan försiktigt huden snitt webbplats med hjälp av hud lim.
- Värm det nyfödda barnet under en värmelampa för ~ 3 min för återvinning, och sedan rena blodet och lim spår med hjälp av en 70% alkohol prep pad before återinföra det till sina kullsyskon. Försök att slutföra hela kirurgiska ingrepp inom 10 minuter på grund av att minimera den tid separeras från mamman förbättrar överlevnad efter apikala resektion.
- Efter varje operation, placera kirurgiska verktyg i kontakt med pärlorna i den heta pärla autoklav under ca 20 sek för fullständig sterilisering. Låt kirurgiska verktyg svalna till RT före varje operation.
- Efter att ha avslutat operationer för alla valpar i en kull, blanda valparna med moderns sängkläder och exkrementer innan han återvände dem till moderns boet.
OBS: I allmänhet, ICR / CD-1-möss är bättre fostermödrar än C57BL / 6, men även bland ammande mödrar av samma genetiska bakgrund, som främjar instinkter varierar. Vid byte en ammande mamma är nödvändig för att minska dödligheten genom moderns cannibalization, ta bort P0 valparna till en ammande mamma och sedan utföra apikala resektion på P1. Endast utföra antingen skenoperation eller apikala resection i en kull valpar, eftersom blandning bluff och kirurgiska valpar kunde minska överlevnaden av den kirurgiska gruppen av valpar 6.
5. postkirurgiska Analys
- En dag efter operationen, övervaka valpar, se till att det inte finns någon skillnad mellan bluff och kirurgiska grupper, och räkna antalet ungar för att mäta överlevnaden. Om operationer utförs på rätt sätt, bör överlevnaden vara liknande och mer än 60% i både sham och kirurgiska grupper.
- Hjärta isolering och fixering.
- Euthanize valparna på dag 1 och 2 efter operationen via halshuggning och dag 21 efter operation av CO2 med en försäkran om döden genom halshuggning, rengör bröstet med hjälp av en 70% alkohol prep.
- Incisionsfilm mittlinjen huden och musklerna i bröstet och sedan öppna kistan.
- Excidera hela hjärtan från brösthålan och fixera hela hjärtat i varje prov i 5 ml 4% paraformaldehyd O / N vid RT.
- På nästa dag, överför proven till 70% etanol. Prover kan förvaras upp till en vecka innan paraffininbäddning.
- Skiva 5-um tjocka paraffinsektioner genom hela kammaren och utföra standard hematoxylin och eosin (H & E) och Masson s trikromfläckning att undersöka den regenerativa svar 5, 7. Närmare bestämt är H & E färgning används för att undersöka muskel ersättning och Massons Trichrome fläcken används att undersöka fibrotiska svar 5.
- Välj intresseområde och inrätta minst tre härdar per prov manuellt med en bild scanner. Bild och analysera färgnings glider vid 40 gångers förstoring enligt tillverkarens anvisningar med standardparametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musungar avlivades 1, 2, och 21 dagar efter apikala resektion, och deras hjärtan uppsamlades för H & E och Massons Trikrom-färgning. Blå färg i Massons Trichrome fläck indikerar avsättningen av epikardiala extracellulärmatrix 5. Med framgångsrik apikala resektion, är en blodpropp effektivt utformad att täta LV en dag efter apikala resektion, såsom visas i figur 1A. En gradvis resorption av blodpropp och tidiga hjärtfibros observeras, och ersätts med myokardialvävnad sker tills fullständig regenerering av hjärtmuskeln sker 21 dagar efter apikal resektion (Figur 1B och C). Morfologisk analys visar ingen skillnad mellan opererande och skenopererade hjärtan på 21 dagar efter operation (Figur 1C och D).
Figur 1. Representant H & E och MassonsTrichrome fläcken. Ventrikulär myokardium av neonatal mus hjärtan 1 (A), 2 (B), eller 21 (C) dagar efter apikala resektion och 21 dagar efter skenoperation (D). För varje delfigur är skalfältet i vänstra panelen 1 mm och skalfältet i den högra panelen är 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publiceringsersättningar för den här artikeln var sponsrad av en gåva från Fine Science Tools till Dr. Jian Hou.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr.. James Hawkins, Zu-Xi Yu och Xuan Qu från National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) för deras hjälp med mus kirurgi och förberedelse och färgning av paraffin. Författarna är tacksamma mot NIH Fellows Editorial Board för redaktionellt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-03 | Iridectomy scissors |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Iris Forceps, Straight, Serrated | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Iris Forceps, Curved, Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm | Fine Science Tools | 14105-12 | |
| Round Handled Suture Tying Forceps, Straight | Fine Science Tools | 18025-12 | |
| Round Handled Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
| Magnifying Lamp | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Heating lamp | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Prolene sutures | Ethicon | 8889H | |
| Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Alcohol Prep Pad | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm) |
| Bench top protector sheet | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50 |
| 0.9% Sodium Chloride, 250ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER |
| Slide scanner | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
References
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2 (2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1 (2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
