Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Een studie van de Complexatie van Mercury (II) met Dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Opmerking: alle relevante veiligheidsinformatiebladen (VIB) te raadplegen voor gebruik. Kwik chloride is een giftige chemische stof. Persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, veiligheidsbril en laboratoriumjas) moet gedragen worden bij af te voeren en alle bijbehorende oplossingen. Gooi oplossingen duidelijk gelabeld chemisch afval flessen aangewezen voor zware metalen.

1. Bereiding van 5 mM Ontgaste ammoniumformaatbuffer, pH 7,5

  1. Oplossen in 450 ml HPLC kwaliteit water 0,1576 g ammoniumformiaat buffer. Stel de pH van de bovenstaande oplossing met 1 M mierenzuur en 1 M ammoniumhydroxide tot 7,5. Breng deze oplossing over in een maatkolf van 500 ml en voeg HPLC water om de kalibratie lijn naar een 5 mM ammoniumformiaatoplossing maken.
  2. Ontgas de 5 mM ammoniumformaatbuffer onder vacuum voor 10 min en spoelen met argon. Tweemaal herhalen en opslag oplossing onder argon. Op de dag van gebruik, filteren de buffer oplossing door een filter van 0,2 micron before gebruik.

2. Voorbereiding van de Mercury (II) Chloride Solutions

  1. Weeg 0,2375 g kwik (II) chloride. Oplossen in 25 ml van 5 mM ammoniumformaatbuffer een 0,035 M kwik (II) chloride oplossing leidt.
  2. Voeg 0,214 ml van 0,035 M kwik (II) chloride-oplossing met 9,785 ml van 5 mM ammoniumformaatbuffer een 7,5 x 10 -4 M oplossing te creëren. Deken van de 7,5 x 10 -4 M kwik (II) oplossing met argon gas.

3. Bereiding van CGGC voorraadoplossing

  1. Los 2,0 mg van het tetrapeptide dicysteinyl, CGGC in 0,118 ml HPLC kwaliteit acetonitril en voeg 1,0647 ml van 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer die werd ontgast in argon tot een 5 mM voorraadoplossing CGGC verkregen.
  2. Voeg 225 ul van 5 mM CGGC stockoplossing aan 1.275 ui 5 mM ammonium vorming pH 7,5 buffer tot een 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing.

4. VoorbereidingVerschillende reactiemengsels van kwik (II) en CGGC

  1. Bereiding van 1: 0,5 verhouding van kwik (II): CGGC oplossing
    1. Plaats 255 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer.
    2. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg dan 15 pi van 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing in de 1,5 ml microcentrifuge. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Laat de oplossing gedurende 10 minuten staan ​​vóór injectie in de massaspectrometer.
  2. Bereiding van 1: 1 verhouding van kwik (II): CGGC oplossing
    1. Plaats 240 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer.
    2. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. DanVoeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1.
  3. Bereiding van 1: 2 verhouding van kwik (II): CGGC oplossing
    1. Plaats 210 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer.
    2. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 60 ul van 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1.

5. Voorbereiding van de LMOE Stock Solution

  1. Los 3,5 mg van het tetrapeptide dicysteinyl, LMOE in 0,145 ml HPLC kwaliteit acetonitril aan het peptide te lossen. Voeg 13,067 ml van 5 mM ammoniumformiaat Dan, pH 7,5 buffer die is ontgast argon produceren 0,5 mM LMOE oplossing.
  2. Vortex de oplossing totdat al peptide wordt opgelost. Voeg 1,125 ml 0,5 mM LMOE-oplossing en 0,375 ml van 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer tot een 1,5 ml microcentrifugebuis een 7,5 x 10 -5 M LMOE oplossing. Vortex tot gemengd.

6. Voorbereiding van de verschillende reactiemengsels van Mercury (II) en LMOE Solution

  1. Bereiding van 1: 0,5 verhouding van kwik (II): LMOE oplossing
    1. Plaats 255 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer.
    2. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 15 ul van 7,5 x 10 -4 M MOEL oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1.
  2. Bereiding van 1: 1 verhouding van kwik (II): LMOE oplossing
    1. Plaats 24081, l van 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer.
    2. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 30 ul van 7,5 x 10 -4 M MOEL oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1.
  3. Bereiding van 1: 2 verhouding van kwik (II): LMOE oplossing
    1. Plaats 210 pl 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Voeg 30 ul van 7,5 x 10 -4 M kwik (II) chloride-oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis met ammoniumformiaat buffer.
    2. Vortex de oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 60 ul van 7,5 x 10 -4 M MOEL oplossing in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven in paragraaf 4.1.

7. Analyzing de reactiemengsels van Mercury (II) en CGGC Monsters door Orbitrap ESI massaspectrometrie

  1. De voorbereiding van de ESI massaspectrometer 16
    1. Teken 100 ul kalibratienormen in een 500 ul glazen spuit.
    2. Plaats de spuit in de spuit bakermat van de MS pomp, sluit de buis, en injecteer in de massa spectrofotometer.
    3. Stel de bestandsnaam van de run door het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam.
    4. Selecteer verwerven gegevens knop in de data-acquisitie module en het verzamelen van 150 scans.
    5. Analyseer het chromatogram de kalibratienormen controleren door het openen dataverwerkingsmodule van de software. Open de module, ga naar het menu Bestand en selecteer "open" en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer dat de pieken in het chromatogram correleren met de massa's van de standaarden in rekening.
    6. Reinig de 500 ul glazen spuit door het opstellen van 500 pi HPLC kwaliteit methanol en vervolgens afzien van de methanol in een bekerglas.
    7. Opstellen van 500 pi van HPLC-kwaliteit methanol in het glas spuit en spoel het systeem per stap 7.1.2.
    8. Selecteer de methode setup module van de software om de parameters. Kies de scan mode menu en identificeren van de analysator als FTMS, en klik vervolgens op "OK". Dan door te klikken op de verschillende iconen op het real-time overzicht spectrum pagina, stel de volgende parameters: schede gasstroom: 10, Bron temperatuur: 0, capillaire spanning: 37 V, Tube lens: 95 V, Spray spanning: 4,20 kV , debiet 10,00 pl / min, Analyzer: FTMS, Aantal scans: 150.
  2. Running CGGC samples op ESI massaspectrometer
    1. Voer het 5 mM ammoniumformiaat pH 7,5 buffer.
      1. Plaats 500 pi van 5 mM ammoniumformiaat buffer in de 500 pi glas spuit, plaats deze in de spuit bakermat van de MS-pomp, en bevestig de slang.
      2. Lopen buffer door de slang voor 1-2 min.
      3. Stel de bestandsnaam van de rundoor het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam.
      4. Selecteer verwerven gegevens knop in de module en het verzamelen van 150 scans.
      5. Klik op de run knop om collectie te stoppen na 150 scans worden verzameld.
      6. Open de data browser module, ga dan naar het menu Bestand en selecteer "open" en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer of er geen pieken op 483, 683, 1163 en 1363 m / z aanwezig dat het peptide of kwik (II) peptide complexen lijken zijn.
    2. Start het 1: 0,5 kwik (II): CGGC verhouding oplossing.
      1. Plaats 250 pl van 1: 0,5 kwik (II): CGGC verhouding van het monster in de spuit.
      2. Plaats de spuit in de spuit bakermat van de MS pomp, sluit de buis en prime het apparaat.
      3. Selecteer een bestandsnaam voor de run door het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam.
      4. Druk op de te verwerven gegevens knop in de data-acquisitie module en het verzamelen van 150 scans en klik op de run-knop om de collectie te stoppen.
      5. Open de module, ga naar het menu Bestand en selecteer "open" en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer of het chromatogram bevat pieken waaronder de één voor de CGGC peptide alleen.
      6. Was de spuit door opzuigen met 500 gl buffer ammoniumformiaat en vervolgens afgeven van de ammoniumformaatbuffer in een bekerglas.
      7. Selecteert u de knop afval op het MS en spoel de slang drie keer met 500 ul ammoniumformaat buffer.
      8. Was de spuit door opzuigen met 500 pl methanol en vervolgens afgeven van de methanol in een bekerglas.
      9. Spoel de buis één keer met 500 pi methanol.
      10. Select knop load detector op de MS.
      11. Voeg 500 ul van ammoniumformiaat buffer op de spuit.
      12. Plaats de spuit in de spuit bakermat van de MS pomp, sluit de buis en prime het apparaat.
      13. Selecteer een bestandsnaam voor de buffer wordt beheerd door het selecteren van het pictogram van het bestand en het typen van de bestandsnaam.
      14. Pershet verwerven data-knop en het verzamelen van 150 scans en klik vervolgens op de stop-run-knop.
      15. Open de data browser module, ga naar het menu Bestand en selecteer "open" en selecteer het bestand in het dialoogvenster. Controleer of het chromatogram is leegte van pieken van de vorige Hg: CGGC run.
    3. Start het 1: 1 kwik (II): CGGC verhouding oplossing.
      1. Plaats 250 pl van 1: 1 kwik (II): CGGC verhouding monster in de spuit.
      2. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven voor stap 7.2.2.2 tot 7.2.2.15.
    4. Start het 1: 2 kwik (II): CGGC verhouding oplossing
      1. Plaats 250 pl van 1: 2 kwik (II): CGGC concentratie monster in de spuit.
      2. Herhaal op dezelfde wijze als beschreven voor stap 7.2.2.2 tot 7.2.2.15.

8. Het analyseren van de reactiemengsels van Mercurius en LMOE Monsters door Orbitrap ESI massaspectrometrie

  1. Running LMOE samples op ESI massaspectrometer
    1. Herhaal analyseprocedure (Stappen 7,1-7,2) gebruikmakend LMOE monsters en reactiemengsels kwik (II) en LMOE in verschillende stoichiometrische verhoudingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een onderzoek werd uitgevoerd om de mogelijke kwik-peptidecomplex karakteriseren preparaat twee tetrapeptiden, CGGC en LMOE (figuur 1) van ESI massaspectrometrie. Complexen kwik (II) met CGGC of LMOE werden onderzocht door het laten reageren van het mengsel van kwik (II) en peptideoplossingen drie verschillende molaire verhoudingen: 1: 0,5, 1: 1 en 1: 2 (kwik (II): peptide) . De concentratie van kwik (II) was 7,5 x 10 -6 M en peptideconcentratie dienovereenkomstig gevarieerd.

Figuur 1
Figuur 1. Dicysteinyl peptide structuren. Chemische structuren van de dicysteinyl tetrapeptiden, CGGC en LMOE. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 2
Figuur 2. ESI MS kwik (II) en CGGC orbitrap electrospray ionisatie massaspectra uit een oplossing bevattende 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ in ammoniumformiaat, pH 7,5 met wisselende Hg 2+. CGGC stoichiometrische verhoudingen: (A ) 1: 0,5 verhouding (B) 1: 1 verhouding, en (C) 1: 2 verhouding. Inzetstukken tonen het kwik isotoop patronen van de aangegeven kwik-peptide complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. ESI MS kwik (II) en LMOE. Elektrosprayionisatie orbitrap massaspectra uiteen oplossing bevattende 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ in ammoniumformiaat, pH 7,5 met wisselende Hg 2+: LMOE stoichiometrische verhoudingen: (A) 1: 0,5 verhouding (B) 1: 1 verhouding, en (C) 1 : 2 verhouding. Inzetstukken tonen het kwik isotoop patronen van de aangegeven kwik-peptide complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Electrospray ionisatie orbitrap massachromatogrammen werden verzameld voor kwik (II) complexvormer met CGGC (figuur 2) en LMOE (figuur 3) bij diverse kwik (II) stoechiometrische verhoudingen peptide (1: 0,5, 1: 1 en 1: 2). De waargenomen kwik-peptidecomplex types tonen duidelijke kwik isotoop pieken (bijvoegsels), die worden gebruikt om het aantal kwik ionen in het complex en het aantal Depro bepalentonations. Bijvoorbeeld, Figuur 1b inzet toont het kwik isotoopsignatuur in de peptide-kwik adduct, dat overeenkomt met de zeven belangrijkste natuurlijk voorkomende isotopen kwik: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), met procent natuurlijke abondantie haakjes. De twee belangrijkste isotopen 200 en 202 Hg Hg tonen een duidelijke relatieve intensiteit verhouding van 2,3: 3. Bijgevolg de meest intense isotope piek van dit kwik isotoop cluster vormt de mono-isotopische massa van het adduct (m / z = 539). Dit correleert met een twee-coördinaat complex, dat wordt gevormd door deprotonering twee cysteinyl thiolen onder vorming [(CGGC-2H + Hg) + H] + adduct. Deze analyse is als volgt samengesteld:

m / z waarde voor [(CGGC-2H + Hg) + H] + is apAl naar (338 - 202 2 + 1) = 539.

Figuur 1A inzet toont het kwik isotoopsignatuur in de peptide-adduct kwik, hetgeen overeenkomt met twee kwik complex zoals berekend door de chemcal programma [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + (Figuur 4). De theoretische geprotoneerde mono-isotopische massa overeenkomt met een m / z waarde van 1077.061, die de negende isotopische piek in het berekende isotoop cluster. Figuur 1A inzet toont een isotopische piek overeenkomend met een m / z waarde 1077,1, die ook de negende piek in de waargenomen isotopische cluster. Daarom kan de oorsprong adduct van deze isotoop cluster worden toegewezen [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +.

Figuur 4
Figuur 4. Theoretische isotopische patronen voor [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + sup>. De theoretische patronen voor isotopische [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +, berekend met de chemcal programma. Pijl geeft monoisotoop piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. gekationiseerde adducten. Sommige gekationiseerd natrium en kalium adducten in verband met het kwik-peptide complexen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5 toont enkele gekationiseerd natrium en kalium adducten verband met het kwik-peptide complexen gevormd door CGGC. Sodiated adducten zijn 22 massa-eenheden groter than de overeenkomstige geprotoneerde kwik-CGGC complexen, terwijl de kalium adducten zijn 38 massa-eenheden groter. De dominante geprotoneerde CGGC dimeer (m / z = 677) vormt tevens gekationiseerde species met natrium (m / z = 699) en kalium ionen (m / z = 715). Dit bevestigt verder de vorming van dimeren CGGC zonder oxidatie van de thiolgroepen cysteinyl disulfiden te vormen, die zou hebben geresulteerd in een afname van twee massa-eenheden geprotoneerde of gekationiseerde adducten.

Figuur 6
Figuur 6. Overlappende 1 en 2 lading staten. Overlappende pieken in verband met kwik-peptide-ionen [(LMOE-4H + 2HG) + H] + in de 1 en de 2 lading staten. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

"Figuur Figuur 7. Theoretische isotopische patronen voor [(LMOE-4H + 2HG) + H] +. De theoretische patronen voor isotopische [(LMOE-4H + 2HG) + H] +, berekend met de chemcal programma. Pijl geeft monoisotoop piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6 toont overlappende pieken in verband met kwik-LMOE adducten in de 1 en de 2 lading. Het toont isotopische pieken die worden geassocieerd met kwik-peptide-ionen [(LMOE-4H + 2HG) + H] + in de leiding 1 en een m / z waarde van 883. Dit is in overeenstemming met twee kwik complex berekend voor [(LMOE-4H + 2HG) + H] + met de chemcal programma (figuur 7). De theoretische geprotoneerde mono-isotopischemassa overeenkomt met een m / z waarde van 883,032.

Bovenstaande waargenomen [(LMOE-4H + 2HG) + H] + adduct met een mono-isotopische piek van 883,03 overlapt een adduct met overeenkomstige pieken toont nog eens 0,5 massa-eenheden. De zeer hoge resolutie bereikt door orbitrap massaspectrometrie instrument kan worden gesteld dat deze overlappende pieken corresponderen met adducten met een lading van 2. Dienovereenkomstig, de mono-isotopische massa van het overlappende complex wordt geïoniseerd kan als volgt worden berekend. Figuur 8 toont dat de m / z verschil tussen de isotopische pieken en 0,5 massa verschil is 1 amu. Daarom is de laadtoestand is 2. Om de massa van het kwik-peptidecomplex te berekenen, is het m / z voor de mono-isotopische piek vermenigvuldigd met de laadtoestand, en afgetrokken van de massa van beide protonen, waarbij het complex positief geladen ion gemaakt.

De berekeningen voor de 2 adduct:

m / z tussen isotopische pieken 0,5

Massa verschil tussen isotopen pieken is 1 amu (1 neutron)

z = 1 gedeeld door 0,5 = 2

m / z voor geprotoneerde monoisotoop piek (883,53 x 2) - 2 = 1765,06

Het bovenstaande m / z voor het geprotoneerde mono-isotopische piek, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, is in overeenstemming met de theoretische waarde, berekend volgens de chemcal programma 1.765,056 (figuur 8).

Figuur 8
Figuur 8. Theoretischeisotopische patronen voor [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. De theoretische patronen voor isotopische [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, berekend met de chemcal programma. Pijl geeft monoisotoop piek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het voordeel van het analyseren van kwik-peptidecomplexen met ESI orbitrap massaspectrometer is dat de lading van elk ion gemakkelijk kan worden toegewezen zoals hierboven weergegeven. Peptiden die basis aminoterminus kan gemakkelijk stabiliseren positieve ladingen. Bij het gebruik van elektrospray ionisatie en een hoge resolutie massa-analysator zoals de orbitrap, de laadtoestand van peptide-ionen met meer dan 1 lading kan worden bepaald gemakkelijker in vergelijking met de lagere resolutie iontrap massa-analysator.

(figuur 3A en figuur 6), zoals hierboven beschreven, werden ook geanalyseerd met tandem MS. Zij had geen MS-MS fragmentatie, waaruit bleek dat de verkregen signalen tot de verwachte verbinding zoals hierboven beschreven, en worden niet gegroepeerd artefacten gevormd bij hogere concentraties kwik naar peptide verhoudingen vertonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hydrofobe dicysteinyl tetrapeptide CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2, MW = 338) (figuur 1) vormt complexen met kwik (II) zoals in figuur 2 en tabel 1 Daarnaast vormt het peptide dimeren en trimeren. stapsgewijs de hoeveelheid peptide toename in het reactiemengsel. Zoals blijkt uit de m / z-waarden van de bijbehorende dimeren [(2M + H) + = 677] en trimeren [(3M + H) + = 1015], de thiol groepen CGGC niet oxideren tot disulfiden onder dezelfde omstandigheden functioneren . De vorming van deze geassocieerde CGGC species kan worden veroorzaakt door de hydrofobiciteit van dit tetrapeptide. CGGC vormt twee complexen met kwik overeenkomend met 1: 1 kwik (II): peptide en 1: 2 kwik (II) :( peptide) 2 complexen zoals eerder gerapporteerd voor dicysteinyl tripeptiden 7. Echter, in aanwezigheid van overmaat of gelijkwaardige kwik (II), ook forms een 2: 2 [kwik (II)] 2: (peptide) 2 complex.

De gecarboxyleerde dicysteinyl tetrapeptide LMOE (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482) (figuur 1) complexen vormen met kwik (II) zoals getoond in figuur 3 en tabel 1 Het niet LMOE dimeren zo gemakkelijk als. dat in acht voor de meer hydrofobe CGGC. Vergelijkbaar met CGGC, vormt complexen met kwik overeenkomend met 1: 1 kwik (II): peptide en 1: 2 kwik (II) :( peptide) 2 complexen. Echter, met de hulp carboxylaatgroepen, vormt het 2: 2 [kwik (II)] 2: (peptide) 2 complex gemakkelijker. Bovendien boven kwik vormt het 2: 1 [kwik (II)] 2: peptidecomplex en het 4: 2 [kwik (II)] 4: (peptide) 2 peptidecomplex, die niet werden waargenomen voor CGGC.

De samenvatting van de waargenomen signalen voor de complexen fORMED als m / z-waarden worden in tabel 1.

tabel 1

Tabel 1. Samenvatting van kwik-peptidecomplexen signalen. Mercury-peptidecomplexen signalen in de LTQ / Orbitrap MS chromatogrammen in ammoniumformiaat, pH 7,5.

We hebben aangetoond dat de reactie van kwik (II) en twee dicysteinyl tetrapeptiden complexen vormen die afhankelijk van de initiële verhouding van kwik (II) zijn: peptide evenals de aanwezigheid van aanvullende bindende groepen in het dicysteinyl tetrapeptide. Bovendien kan nauwkeurige stoichiometrie van kwik en peptide in de complexen gevormd onder gespecificeerde elektrosprayionisatie voorwaarden worden bepaald door het gebruik van hoge resolutie ESI massaspectrometrie gebaseerd op verschillende isotopen kwik distributie patronen.

In omzetting cysteïnyl Peptides met kwik (II), moeten voorzorgsmaatregelen worden getroffen om de oxidatie van cysteïnyl thiolgroepen voorkomen disulfidebindingen. In het beschreven protocol werden de bufferoplossingen zorgvuldig ontgast en onder argon opgeslagen. Bovendien zijn alle reactiemonsters bereid onmiddellijk voor analyse met ESI massaspectrometrie.

Vanwege de verschillen in oplosbaarheid tussen de twee tetrapeptiden, LMOE en CGGC, werden verschillende concentraties gebruikt om de voorraad oplossingen voor te bereiden. De vriezer voorraad CGGC peptide werd bevochtigd met acetonitril en werd gemakkelijk opgeloste gevolgd door 5 mM ammoniumformiaat, pH 7,5 tot een 7,5 x 10 -4 M CGGC oplossing te produceren. De LMOE werd bereid bij een lagere concentratie, 7,5 x 10 -5 M, voordat het kwik (II): peptide reactiemengsel stappen vanwege de lagere oplosbaarheid. De optimale verdunning voor de analyse van het kwik (II) complexen werd geacht 10 -5 M vanwege de oplosbaarheid van het peptide en omvoor het verwijderen van residuen in de massaspectrometer. In opdracht aan de CGGC oplossingen, LMOE resten zich te houden aan de slang, die af en toe een slang vervanging noodzakelijk.

Het belang van het gebruik van ESI massaspectrometrie voor de analyse van kwik-peptidecomplexen ligt in de zachte ionisatie van analyten. Dit vergemakkelijkt de analyse van moleculaire ionen met verwaarloosbare fragmentatie. Zoals in dit werk, kan het worden gebruikt om de stoichiometrie kwik-peptidecomplexen op basis van de signatuur kwik isotopische verspreidingspatroon karakteriseren. Echter, een vluchtig buffersysteem voor analyse door ESI massaspectrometrie. Dit kan de praktische toepassing ervan te beperken voor het identificeren van analyten die minder vluchtige oplosmiddelen of buffering media voor ontbinding nodig.

Zoals we eerder hebben vermeld 7,8, ESI massaspectrometrie biedt een gevoelig analytisch instrument voor een nauwkeurige bepaling van de stoichiometrie van kwik en Peptide in het kwik-peptide complexen onder de aangegeven elektrosprayionisatie conditie. Het is echter noodzakelijk om extra werkwijzen (bijvoorbeeld, 1 H, 13 C, 199 Hg NMR spectroscopie, exafs of potentiometrie 17-18) een nauwkeurigere bepaling van het gehalte aan complexen bieden oplossing.

We hebben aangetoond dat ESI een orbitrap massa analysator kan worden gebruikt om kwik-peptidecomplexen te analyseren. We verwachten dat deze techniek kan worden toegepast in de richting van de analyse van andere metaalionen en hun complexen met diverse kleine verbindingen. Het is vooral nuttig voor het analyseren van complexen gevormd door andere metaalionen die kunnen bestaan ​​in verschillende isotopische vormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S erkent steun van de National Science Foundation, RUI verlenen CHE 1011859. De auteurs dankbaar erkennen de Triade Massaspectrometrie Facility aan de Universiteit van North Carolina in Greensboro voor het gebruik van de Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL massaspectrometer. De auteurs danken Daniel Todd, Vincent Sica en Brandie Erhmann aan de Universiteit van North Carolina in Greensboro voor nuttige suggesties en opmerkingen met betrekking tot dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

Chemie Mercury-peptide-complexen kwik isotoop pieken massaspectrometrie ESI MS cysteinyl peptiden
Een studie van de Complexatie van Mercury (II) met Dicysteinyl tetrapeptiden door electrospray ionisatie massaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter