Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En Undersøgelse af Kompleksdannelse af kviksølv (II) med Dicysteinyl Tetrapeptider af Elektrospraymassespektrometri ionisationsmassespektrometri

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Bemærk: Kontakt venligst alle relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Kviksølvchlorid er et giftigt kemikalie. Personlige værnemidler (handsker, sikkerhedsbriller og kittel) skal bæres, når du afleverer den, og alle tilhørende løsninger. Bortskaf løsninger i tydeligt mærket kemiske affald flasker, der er udpeget for tungmetaller.

1. Fremstilling af 5 mM Afgasset ammoniumformiatpuffer, pH 7,5

  1. 0,1576 g ammoniumformiat buffer opløses i 450 ml HPLC-kvalitet vand. Indstil pH af ovennævnte opløsning med 1 M myresyre og 1 M ammoniumhydroxid til 7,5. Opløsningen overføres til en 500 ml målekolbe, og der tilsættes HPLC vand til mærket for at gøre en 5 mM ammoniumformat løsning.
  2. Afgasses 5 mM ammoniumformiatpuffer under et vakuumsystem til 10 minutter og udrensning med argon. Gentag to gange og butiksløsning under argon. På dagen for anvendelse, filtrere bufferopløsningen gennem et 0,2 mikron filter before brug.

2. Fremstilling af Kviksølv (II) chlorid Solutions

  1. Afvejes 0,2375 g kviksølv (II) chlorid. Opløse den i 25 ml 5 mM ammoniumformiatpuffer at frembringe en 0,035 M kviksølv (II) chlorid-opløsning.
  2. Tilføj 0,214 ml 0,035 M kviksølv (II) chlorid løsning på 9,785 ml 5 mM ammoniumformiatpuffer at skabe en 7,5 x 10 -4 M opløsning. Tæppe 7,5 x 10 -4 M kviksølv (II) opløsningen med argongas.

3. Udarbejdelse af CGGC Stock Solution

  1. Opløs 2,0 mg af dicysteinyl tetrapeptid, CGGC, i 0,118 ml HPLC-kvalitet acetonitril og derefter tilføje 1,0647 ml 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer, som er blevet afgasset i argon til opnåelse af en 5 mM stamopløsning CGGC.
  2. Tilføj 225 pi af 5 mM CGGC stamopløsning til 1.275 pi 5 mM ammonium formation pH 7,5 puffer til opnåelse af en 7,5 x 10 -4 M CGGC opløsning.

4. Fremstillingaf forskellige reaktionsblandinger af kviksølv (II) og CGGC

  1. Fremstilling af 1: 0,5 forhold af kviksølv (II): CGGC opløsning
    1. Placer 255 pi 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 30 pi 7,5 x10 -4 M kviksølv (II) chlorid-opløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør med ammoniumformiatbuffer.
    2. Vortexes opløsningen i 10 sek. Derefter tilsættes 15 ul 7,5 x 10 -4 M CGGC opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifuge. Vortexes opløsningen i 10 sek. Lad opløsningen stå i 10 minutter før injektion i massespektrometret.
  2. Fremstilling af 1: 1-forhold af kviksølv (II): CGGC opløsning
    1. Placer 240 pi 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 30 pi 7,5 x10 -4 M kviksølv (II) chlorid-opløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør med ammoniumformiatbuffer.
    2. Vortexes opløsningen i 10 sek. Såtilsættes 30 pi 7,5 x 10 -4 M CGGC opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag på en lignende måde som beskrevet i afsnit 4.1.
  3. Fremstilling af 1: 2-forhold af kviksølv (II): CGGC opløsning
    1. Placer 210 pi 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 30 pi 7,5 x10 -4 M kviksølv (II) chlorid-opløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør med ammoniumformiatbuffer.
    2. Vortexes opløsningen i 10 sek. Derefter tilsættes 60 pi 7,5 x 10 -4 M CGGC opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag på en lignende måde som beskrevet i afsnit 4.1.

5. Udarbejdelse af CØEL Stock Solution

  1. Opløs 3,5 mg af dicysteinyl tetrapeptid, CØEL, i 0,145 ml HPLC-kvalitet acetonitril for at opløse peptidet. Derefter tilsættes 13,067 ml 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer, som er blevet afgasset i argon til frembringelse af 0,5 mM CØEL løsning.
  2. Vortexes opløsningen indtil alt peptidet er opløst. Tilføj 1,125 ml 0,5 mM CØEL-opløsning og 0,375 ml 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer til et 1,5 ml mikrocentrifugerør til opnåelse af en 7,5 x 10 -5 M CØEL opløsning. Vortex indtil blandet.

6. Fremstilling af forskellige reaktionsblandinger af kviksølv (II) og CØEL Solution

  1. Fremstilling af 1: 0,5 forhold af kviksølv (II): CØEL opløsning
    1. Placer 255 pi 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 30 pi 7,5 x10 -4 M kviksølv (II) chlorid-opløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør med ammoniumformiatbuffer.
    2. Vortexes opløsningen i 10 sek. Derefter tilsættes 15 ul 7,5 x 10 -4 M CØEL opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag på en lignende måde som beskrevet i afsnit 4.1.
  2. Fremstilling af 1: 1-forhold af kviksølv (II): CØEL opløsning
    1. Placer 24081 l af 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 30 pi 7,5 x10 -4 M kviksølv (II) chlorid-opløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør med ammoniumformiatbuffer.
    2. Vortexes opløsningen i 10 sek. Derefter tilsættes 30 pi 7,5 x 10 -4 M CØEL opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag på en lignende måde som beskrevet i afsnit 4.1.
  3. Fremstilling af 1: 2-forhold af kviksølv (II): CØEL opløsning
    1. Placer 210 pi 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 puffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 30 pi 7,5 x10 -4 M kviksølv (II) chlorid-opløsning i 1,5 ml mikrocentrifugerør med ammoniumformiatbuffer.
    2. Vortexes opløsningen i 10 sek. Derefter tilsættes 60 pi 7,5 x 10 -4 M CØEL opløsningen i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Gentag på en lignende måde som beskrevet i afsnit 4.1.

7. Analyzing reaktionsblandingerne kviksølv (II) og CGGC Prøver af Orbitrap ESI-massespektrometri

  1. Klargøring af ESI massespektrometer 16
    1. Tegn 100 ul kalibreringsstandarder i et glas sprøjte 500 pi.
    2. Placer sprøjten i sprøjten vugge MS pumpe, fastgøre slanger og tilføre massen spektrofotometer.
    3. Opsætning filnavnet for kørslen ved at vælge ikonet filen og skrive filnavnet.
    4. Vælg erhverve knap data i datafangst modulet og indsamle 150 scanninger.
    5. Analyser kromatogrammet at kontrollere kalibreringsstandarderne ved at åbne databehandling modul af softwaren. Åbn modulet, skal du gå til menuen Filer og vælg "åben", og vælg den fil i dialogboksen. Kontrollere, at toppene i kromatogrammet korrelerer til mellem masse og ladning af standarderne.
    6. Rengør glassprøjten 500 pi ved at udarbejde 500 pi HPLC-kvalitet methanol og derefter dispensere methanol i et bægerglas.
    7. Udarbejd 500 pi HPLC-kvalitet methanol i sprøjten glasset og skylle systemet som pr trin 7.1.2.
    8. Vælg den metode, opsætning modul af software til at indstille parametrene. Vælg den scanning menuen og identificere analysatoren som FTMS, og klik derefter på "OK". Så ved at klikke på de forskellige ikoner på realtid visning spektrum side, skal du indstille følgende parametre: Kappe gasstrømmen: 10, Kilde temperatur: 0, Kapillær spænding: 37 V, Tube linse: 95 V, Spray spænding: 4,20 kV , strømningshastighed 10.00 ul / min, Analyzer: FTMS, Antal scanninger: 150.
  2. Kører CGGC prøver på ESI massespektrometer
    1. Kør 5 mM ammoniumformiat pH 7,5 puffer.
      1. Placer 500 pi 5 mM ammoniumformiatpuffer i glas sprøjten i 500 pi, placere den i sprøjten vugge MS pumpe, og fastgør slangen.
      2. Kør puffer gennem slangen for 1-2 min.
      3. Opsætning filnavnet for kørslenved at vælge ikonet filen og skrive filnavnet.
      4. Vælg knappen Hent data i modulet og indsamle 150 scanninger.
      5. Klik på knappen Kør for at stoppe indsamlingen efter 150 scanninger indsamles.
      6. Åbn dataene browser-modulet, så gå til fil-menuen og vælg "åben", og vælg den fil i dialogboksen. Kontroller, at der ikke toppe ved 483, 683, 1.163 og 1.363 m / z er til stede, at ligne peptid eller kviksølv (II) -peptid komplekser.
    2. Kør 1: 0,5 kviksølv (II): CGGC forholdet løsning.
      1. Placer 250 pi af 1: 0,5 kviksølv (II): CGGC forhold af prøven ind i sprøjten.
      2. Placer sprøjten ind i sprøjten vugge MS pumpe, fastgøre slangen, og prime apparatet.
      3. Vælg et filnavn for kørslen ved at vælge ikonet filen og skrive filnavnet.
      4. Tryk på knappen erhverve data i datafangst modulet og indsamle 150 scanninger og klik på knappen Kør for at stoppe samlingen.
      5. Åbn modulet, skal du gå til menuen Filer og vælg "åben", og vælg den fil i dialogboksen. Kontroller, at kromatogrammet indeholder toppe, herunder en for CGGC peptid alene.
      6. Vask sprøjten ved sugning med 500 pi ammoniumformiat buffer og derefter afgivelse af ammoniumformiatpuffer i et bægerglas.
      7. Vælg knappen affald på MS og skyl slangen tre gange med 500 pi ammoniumformiatpuffer.
      8. Vask sprøjten ved sugning med 500 pi methanol og derefter afgivelse af methanol i et bægerglas.
      9. Skyl slangen en gang med 500 pi methanol.
      10. Vælg belastning detektor knappen på MS.
      11. Der tilsættes 500 pi ammoniumformiatpuffer til sprøjten.
      12. Placer sprøjten ind i sprøjten vugge MS pumpe, fastgøre slangen, og prime apparatet.
      13. Vælg et filnavn til bufferen køre ved at vælge ikonet filen og skrive filnavnet.
      14. Trykkedata-knappen erhverve og indsamle 150 scanninger, og klik derefter på knappen stop-løb.
      15. Åbn dataene browser-modulet, skal du gå til menuen Filer og vælg "åben", og vælg den fil i dialogboksen. Kontroller, at kromatogrammet er ugyldig af toppe fra den foregående Hg: CGGC køre.
    3. Kør 1: 1 kviksølv (II): CGGC forholdet løsning.
      1. Placer 250 pi af 1: 1 kviksølv (II): CGGC forholdet prøve ind i sprøjten.
      2. Gentag på samme måde som beskrevet for trin 7.2.2.2 til 7.2.2.15.
    4. Kør 1: 2 kviksølv (II): CGGC forholdet opløsning
      1. Placer 250 pi af 1: 2 kviksølv (II): CGGC prøvekoncentration ind i sprøjten.
      2. Gentag på samme måde som beskrevet for trin 7.2.2.2 til 7.2.2.15.

8. Analyse reaktionsblandingerne af kviksølv og CØEL prøver ved Orbitrap ESI-massespektrometri

  1. Løb CØEL prøver på ESI massespektrometer
    1. Gentag analyse procedure (trin 7,1-7,2) ved hjælp af CØEL prøver og reaktionsblandinger kviksølv (II) og central- og østeuropæiske lande på forskellige støkiometriske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En undersøgelse blev udført for at karakterisere muligt kviksølv-peptid kompleks sammensætning til to tetrapeptider, CGGC og CØEL (figur 1) ved hjælp af ESI-massespektrometri. Komplekser af kviksølv (II) med CGGC eller CØEL blev undersøgt ved at omsætte blandinger af kviksølv (II) og peptid løsninger på tre forskellige molforhold: 1: 0,5, 1: 1 og 1: 2 (kviksølv (II): peptid) . Koncentrationen af kviksølv (II) var 7,5 x 10 -6 M og peptidkoncentrationen varierede i overensstemmelse hermed.

Figur 1
Figur 1. Dicysteinyl peptidstrukturer. Kemiske strukturer af dicysteinyl tetrapeptider, CGGC og central- og østeuropæiske lande. Klik her for at se en større version af dette tal.

ent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2. ESI MS kviksølv (II) og CGGC elektrosprayionisering orbitrap massespektre fra en opløsning indeholdende 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ i ammoniumformiat, pH 7,5, indeholdende varierende Hg 2+:. CGGC støkiometriske forhold: (A ) 1: 0,5 forhold, (B) 1: 1-forhold, og (C) 1: 2-forhold. Insets viser kviksølv isotopiske mønstre af de angivne kviksølv-peptid-komplekser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. ESI MS kviksølv (II) og CØEL. Elektrosprayionisering orbitrap massespektre fraen opløsning indeholdende 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ i ammoniumformiat, pH 7,5, indeholdende varierende Hg 2+: CØEL støkiometriske forhold: (A) 1: 0,5 forhold, (B) 1: 1-forhold, og (C) 1 : 2-forhold. Insets viser kviksølv isotopiske mønstre af de angivne kviksølv-peptid-komplekser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Elektrosprayionisering orbitrap masse chromatogrammer blev opsamlet for kviksølv (II) kompleksdannelse med CGGC (figur 2) og CØEL (figur 3) ved forskellige kviksølv (II) til peptid støkiometriske forhold (1: 0,5, 1: 1 og 1: 2). De observerede kviksølv-peptid kompleks typer viser tydelige kviksølv isotopiske toppe (inlays), som anvendes til at bestemme antallet af kviksølv-ioner i komplekset samt antal Deprotonations. For eksempel, figur 1b indsatte viser kviksølv isotopisk signatur i peptid-kviksølv addukt, som svarer til de syv vigtigste naturligt forekommende isotoper af kviksølv: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), med procent naturlige forekomster er angivet i parentes. De to store isotoper 200 Hg og 202 Hg viser en tydelig relativ intensitet forholdet 2,3: 3. Følgelig den mest intense isotopiske top af denne ene-kviksølv isotop klynge udgør monoisotopisk masse for adduktet (m / z = 539). Det korrelerer med to-koordineret kompleks, som dannes ved deprotonering af to cysteinyl thioler til dannelse af [(CGGC-2H + Hg) + H] + addukt. Denne analyse er lavet på følgende måde:

m / z-værdi for [(CGGC-2H + Hg) + H] + er equal til (338 - 2 + 202 + 1) = 539.

Figur 1A indsatte viser kviksølv isotopiske signatur i peptid-kviksølv addukt, som svarer til en to-kviksølv-kompleks som beregnet ved hjælp af programmet for ChemCal [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + (figur 4). Den teoretiske protoneret monoisotopisk masse svarer til en m / z-værdi på 1077.061, som er det niende isotopisk top i den beregnede isotopisk klynge. Figur 1A indsatte viser en isotopisk top svarende til en m / z-værdi på 1077,1, hvilket også er den niende peak i den observerede isotopiske klynge. Derfor kan adduktet oprindelse for denne isotop klynge tildeles til [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +.

Figur 4
Figur 4. Teoretiske isotopiske mønstre for [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + sup>. De teoretiske isotopiske mønstre for [(2CGGC-4H + 2HG) + H] som beregnet ved hjælp af ChemCal programmet. Pil angiver monoisotopisk top. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. kationiseret addukter. Nogle kationiserede natrium og kalium addukter forbundet med de kviksølv-peptid-komplekser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 viser nogle kationiseret natrium og kalium addukter forbundet med kviksølv-peptidkomplekser dannet af CGGC. Sodiated addukter er 22 masseenheder større tHan den protoniserede kviksølv-CGGC komplekser, mens kalium addukter er 38 masseenheder større. Den dominerende protoneret CGGC dimer (m / z = 677) danner også kationiserede arter med natrium (m / z = 699) og kaliumioner (m / z = 715). Dette bekræfter yderligere dannelsen af ​​CGGC dimerer uden oxidation af cysteinyl thiolgrupperne at danne disulfider, hvilket ville have resulteret i et fald på to masseenheder for protonerede eller kationiserede addukter.

Figur 6
Figur 6. Overlappende +1 og +2 charge stater. Overlappende toppe er forbundet med kviksølv-peptid ioner [(CØEL-4H + 2HG) + H] + i +1 og +2 charge stater. Klik her for at se en større version af dette tal.

"Figur Figur 7. Teoretiske isotopiske mønstre for [(CØEL-4H + 2HG) + H] +. De teoretiske isotopiske mønstre for [(CØEL-4H + 2HG) + H] som beregnet ved hjælp af ChemCal programmet. Pil angiver monoisotopisk top. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 viser overlappende toppe er forbundet med kviksølv-central- og østeuropæiske lande addukter i en og to opladning. Det viser isotopiske toppe, der er forbundet med kviksølv-peptid ioner [(CØEL-4H + 2HG) + H] + i en ladning og en m / z-værdi på 883. Dette er i overensstemmelse med en to kviksølv kompleks som beregnet for [(CØEL-4H + 2HG) + H] + ved hjælp af ChemCal programmet (figur 7). Den teoretiske protonerede monoisotopiskmasse svarer til en m / z-værdi på 883,032.

Ovenstående observeret [(CØEL-4H + 2HG) + H] + addukt med en monoisotopisk højdepunkt på 883,03 overlapper et andet additionsprodukt indeholdende tilsvarende toppe viser yderligere 0,5 masseenheder. Med ekstremt høj opløsning opnås ved orbitrap massespektrometri instrument, kan det postuleres, at disse overlappende toppe svarer til addukter med en ladning på +2. Følgelig monoisotopisk masse af overlappende komplekset ioniseret kan beregnes som følger. Figur 8 viser, at m / z forskellen mellem isotop toppe er 0.5 og massen forskel mellem dem er 1 amu. Derfor er afgiften tilstand er 2. For at beregne massen af ​​kviksølv-peptid-kompleks, er m / z for monoisotopisk top ganget med opladningstilstand, og trækkes fra massen af ​​to protoner, hvilket gjorde den komplekse ion positivt ladet.

Beregninger for to addukt:

m / z forskellen mellem isotopiske toppe er 0,5

Masseforskellen mellem isotopiske toppe er 1 amu (1 neutron)

z = 1 dividere med 0,5 = 2

m / z for protoneret monoisotopisk top er (883,53 x 2) - 2 = 1765,06

Ovenstående m / z-værdi for den protonerede monoisotopisk peak, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, er i overensstemmelse med den teoretiske værdi som beregnet ved ChemCal programmet som 1765,056 (figur 8).

Figur 8
Figur 8. Teoretiskisotopiske mønstre for [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. De teoretiske isotopiske mønstre for [(2CEEC-8H + 4HG) + H], som beregnes ved hjælp af ChemCal programmet. Pil angiver monoisotopisk top. Klik her for at se en større version af dette tal.

Fordelen ved at analysere kviksølv-peptidkomplekser med en ESI orbitrap massespektrometer er, at ladningen af ​​hver ion kan let tildeles som vist ovenfor. Peptider indeholdende basisk aminoterminal kan let stabilisere positive ladninger. Ved brug af elektrospray ionisering og en høj opløsning masseanalysator såsom orbitrap, afgiften tilstand peptidioner med mere end en afgift kan bestemmes lettere sammenlignet med den lavere opløsning iontrap masseanalysator.

(figur 3A og figur 6), som beskrevet ovenfor, blev også analyseret ved tandem MS. Det viste ikke nogen MS-MS fragmentering, som viste, at de opnåede signaler tilhører den forventede forbindelse som beskrevet ovenfor, og er ikke grupperet artefakter dannet ved højere koncentrationer af kviksølv-til-peptid-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den hydrofobe dicysteinyl tetrapeptid CGGC (C10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW = 338) (figur 1), danner komplekser med kviksølv (II) som vist i figur 2 og tabel 1 Derudover er det danner peptiddimerer og trimerer. trinvist som mængden af ​​peptid stigninger i reaktionsblandingen. Som vist ved m / z-værdier af de tilknyttede dimerer [(2M + H) + = 677] og trimerer [(3M + H) + = 1015], thiolgrupperne af CGGC ikke oxidere til dannelse af disulfider under forsøgsbetingelserne . Dannelsen af ​​disse tilknyttede CGGC arter kunne skyldes hydrofobiciteten af ​​denne tetrapeptid. CGGC danner to typer af komplekser med kviksølv svarende til 1: 1 kviksølv (II): peptid og 1: 2 kviksølv (II) :( peptid) 2 komplekser som tidligere er rapporteret for dicysteinyl tripeptider 7. Men i nærværelse af overskydende eller tilsvarende kviksølv (II), men også foRMS en 2: 2 [kviksølv (II)] 2: (peptid) 2-komplekset.

Den carboxylerede dicysteinyl tetrapeptid CØEL (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2 MW = 482) (Figur 1) danner komplekser med kviksølv (II) som vist i figur 3 og tabel 1 Det gjorde ikke danne CØEL dimerer så let som. at observere for de mere hydrofobe CGGC. Sammenlignes med CGGC, danner komplekser med kviksølv svarende til 1: 1 kviksølv (II): peptid og 1: 2 kviksølv (II) :( peptid) 2 komplekser. Men med de ekstra carboxylatgrupper, danner den 2: 2 [kviksølv (II)] 2: (peptid) 2-komplekset lettere. Desuden overstiger kviksølv, danner den 2: 1 [kviksølv (II)] 2: peptid-komplekset og 4: 2 [kviksølv (II)] 4: (peptid) 2-peptid kompleks, som ikke blev observeret for CGGC.

Sammenfatningen af ​​de observerede signaler til komplekserne formed som m / z-værdier er vist i tabel 1.

Tabel 1

Tabel 1. Oversigt over kviksølv-peptid komplekser signaler. Kviksølv-peptid komplekser signaler i de LTQ / Orbitrap MS kromatogrammer i ammoniumformat, pH 7,5.

Vi har vist, at omsætningen af ​​kviksølv (II) og to dicysteinyl tetrapeptider danne komplekser, der er afhængige af de oprindelige forhold af kviksølv (II): peptid samt tilstedeværelsen af ​​hjælpestoffer bindende grupper i dicysteinyl tetrapeptid. Desuden kan nøjagtig støkiometri af kviksølv og peptid i komplekserne dannet under specificerede elektrosprayionisering betingelser bestemmes ved hjælp af høj opløsning ESI massespektrometri baseret på særskilte kviksølv isotop fordelingsmønster.

Reagere cysteinyl PeptIDES med kviksølv (II), skal der træffes forholdsregler for at forhindre oxidation af cysteinyl thiolgrupperne at danne disulfidbindinger. Inden for beskrevne protokol blev bufferopløsninger omhyggeligt afgasset og opbevaret under argon. Desuden er alle reaktionskomponenter prøver fremstillet umiddelbart før analyse ved ESI-massespektrometri.

På grund af forskelle i opløselighed mellem de to tetrapeptider, CØEL og CGGC, blev forskellige koncentrationer anvendt til at fremstille de stamopløsninger. Stock Fryseren af CGGC peptid blev fugtet med acetonitril og blev let opløses efterfulgt af 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5, til fremstilling af en 7,5 x 10 -4 M CGGC opløsning. CØEL blev fremstillet ved en lavere koncentration, 7,5 x 10 -5 M forud for kviksølv (II): peptid reaktionsblandingen trin på grund af dens lavere opløselighed. Den optimale fortynding til analyse af kviksølv (II) komplekser blev anset for at være 10 -5 M på grund af opløseligheden af peptidet og at tilladetil fjernelse af rester i massespektrometeret. I kontrakt til CGGC løsninger, CØEL rester holde sig til slanger, som nødvendiggør lejlighedsvis slange udskiftning.

Betydningen af ​​at anvende ESI massespektrometri til analyse af kviksølv-peptidkomplekser ligger i dens bløde ionisering af analysander. Dette letter analyse af molekylære ioner med ubetydelig fragmentering. Som vist i dette arbejde, kan det bruges til at karakterisere støkiometrier af kviksølv-peptid komplekser baseret på signatur kviksølv isotopiske distributionsmønstre. Imidlertid er nødvendig til analyse ved ESI-massespektrometri en flygtig buffer system. Dette kan begrænse dens praktiske anvendelse for at identificere analytter, der kræver mindre flygtige opløsningsmidler eller buffer medier til opløsning.

Som vi tidligere har nævnt 7,8, ESI massespektrometri giver en følsom analytisk redskab for en nøjagtig bestemmelse af støkiometrien af kviksølv og Peptide i kviksølv-peptid komplekser under den angivne elektrosprayionisering tilstand. Det er imidlertid nødvendigt at anvende yderligere fremgangsmåder (for eksempel 1 H, 13 C, 199 Hg NMR-spektroskopi, udvidet X-ray absorption fine struktur eller potentiometri 17-18) for at tilvejebringe en mere nøjagtig bestemmelse af indholdet af komplekser i løsning.

Vi har vist, at ESI med en orbitrap masseanalysator kan anvendes til at analysere kviksølv-peptid-komplekser. Vi forventer, at denne teknik kan anvendes mod analyse af andre metalioner og deres komplekser med forskellige små forbindelser. Det vil især være nyttigt for at analysere komplekser dannet af andre metalioner, der kan eksistere i forskellige isotopformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S anerkender støtte fra National Science Foundation, RUI give CHE 1011859. Forfatterne takker Triad-massespektrometri Facility på University of North Carolina i Greensboro for brug af Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL massespektrometer. Forfatterne takker Daniel Todd, Vincent Sica, og Brandie Erhmann ved University of North Carolina i Greensboro til nyttige forslag og kommentarer til dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

Kemi Mercury-peptid komplekser kviksølv isotopiske toppe massespektrometri ESI MS cysteinyl peptider
En Undersøgelse af Kompleksdannelse af kviksølv (II) med Dicysteinyl Tetrapeptider af Elektrospraymassespektrometri ionisationsmassespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter