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Chemistry

Une étude de la complexation du mercure (II) avec Dicysteinyl tétrapeptides par spectrométrie de masse électrospray

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Note: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (FS) avant utilisation. Chlorure de mercure est une substance chimique toxique. Équipement de protection individuelle (gants, lunettes de sécurité et une blouse de laboratoire) doivent être portés lors de la remise et toutes les solutions associées. Éliminer des solutions dans des bouteilles de déchets chimiques clairement étiquetés désignés pour les métaux lourds.

1. Préparation de 5 mM de formiate d'ammonium tampon dégazé, à pH 7,5

  1. Dissoudre 0,1576 g de tampon formiate d'ammonium dans 450 ml d'eau de qualité HPLC. Ajuster le pH de la solution ci-dessus avec de l'acide formique 1 M et 1 M d'hydroxyde d'ammonium à 7,5. Transférer cette solution dans une fiole jaugée de 500 ml et ajouter de l'eau par HPLC pour la courbe d'étalonnage pour obtenir une solution de formiate d'ammonium 5 mM.
  2. Dégazer le tampon formiate d'ammonium 5 mM dans un système sous vide pendant 10 min et purge avec de l'argon. Répéter deux fois et la solution de stockage sous atmosphère d'argon. Le jour de l'utilisation, un filtrage de la solution tampon à travers un filtre de 0,2 micron before utilisation.

2. Préparation de mercure (II) Solutions de chlorure

  1. Peser 0,2375 g de mercure (II) chlorure. Dissoudre dans 25 ml de tampon formiate d'ammonium 5 mM pour produire une (II) une solution de chlorure 0,035 M de mercure.
  2. Ajouter 0,214 ml de solution 0,035 M de mercure (II) de chlorure de 9,785 ml de 5 mM de tampon formiate d'ammonium pour créer une solution 7,5 M x 10 -4. Blanket la solution 7,5 x 10 -4 M de mercure (II) avec de l'argon gazeux.

3. Préparation de CGGC Stock Solution

  1. Dissoudre 2,0 mg du tétrapeptide dicysteinyl, CGGC, à 0,118 ml d'acétonitrile de qualité HPLC et ensuite ajouter 1,0647 ml de mM formate d'ammonium 5, tampon à pH 7,5 qui a été dégazé dans de l'argon pour donner un mM CGGC solution stock 5.
  2. Ajouter 225 pi de la solution stock mM CGGC 5 à 1.275 pi de 5 mm formation d'ammonium tampon à pH 7,5 pour donner une solution à 7,5 x 10 -4 M CGGC.

4. Préparationde divers mélanges de réaction de mercure (II) et CGGC

  1. Préparation de 1: 0,5 rapport de mercure (II): solution CGGC
    1. Placer 255 ul de formiate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de solution de mercure (II) chlorure de 7,5 x 10 -4 M dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec le tampon de formiate d'ammonium.
    2. Vortexer la solution pendant 10 s. Puis ajouter 15 ul de 7,5 x 10 -4 M solution CGGC dans la microcentrifugeuse de 1,5 ml. Vortexer la solution pendant 10 s. Laisser reposer la solution pendant 10 minutes avant l'injection dans le spectromètre de masse.
  2. Préparation du rapport 1: 1 de mercure (II): solution CGGC
    1. Placer 240 ul de formiate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de solution de mercure (II) chlorure de 7,5 x 10 -4 M dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec le tampon de formiate d'ammonium.
    2. Vortexer la solution pendant 10 s. Alorsajouter 30 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solution dans le tube de 1,5 ml. Répétez d'une manière similaire à celle décrite dans la section 4.1.
  3. Préparation de rapport 1: 2 de mercure (II): solution CGGC
    1. Placer 210 ul de formiate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de solution de mercure (II) chlorure de 7,5 x 10 -4 M dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec le tampon de formiate d'ammonium.
    2. Vortexer la solution pendant 10 s. Ensuite, ajouter 60 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solution dans le tube de 1,5 ml. Répétez d'une manière similaire à celle décrite dans la section 4.1.

5. Préparation des PECO Stock Solution

  1. Dissoudre 3,5 mg du tétrapeptide dicysteinyl, PECO, à 0,145 ml d'acétonitrile de qualité HPLC pour dissoudre le peptide. Puis ajouter 13,067 ml de formate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon qui a été dégazé dans de l'argon pour produire 0,5 mSolution M PECO.
  2. Vortex la solution jusqu'à ce que tout peptide est dissous. Ajouter 1,125 ml de solution 0,5 mM et 0,375 ml PECO de 5 mM de formiate d'ammonium, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml pour donner une solution 7,5 x 10 -5 M PECO. Vortex jusqu'à mélangé.

6. Préparation de différents mélanges réactionnels de mercure (II) et solution PECO

  1. Préparation de 1: 0,5 rapport de mercure (II): solution PECO
    1. Placer 255 ul de formiate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de solution de mercure (II) chlorure de 7,5 x 10 -4 M dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec le tampon de formiate d'ammonium.
    2. Vortexer la solution pendant 10 s. Puis ajouter 15 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solution dans le tube de 1,5 ml. Répétez d'une manière similaire à celle décrite dans la section 4.1.
  2. Préparation du rapport 1: 1 de mercure (II): solution PECO
    1. Placez 24081; l de formiate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de solution de mercure (II) chlorure de 7,5 x 10 -4 M dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec le tampon de formiate d'ammonium.
    2. Vortexer la solution pendant 10 s. Puis ajouter 30 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solution dans le tube de 1,5 ml. Répétez d'une manière similaire à celle décrite dans la section 4.1.
  3. Préparation de rapport 1: 2 de mercure (II): solution PECO
    1. Placer 210 ul de formiate d'ammonium 5 mM, pH 7,5 tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 30 ul de solution de mercure (II) chlorure de 7,5 x 10 -4 M dans le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec le tampon de formiate d'ammonium.
    2. Vortexer la solution pendant 10 s. Ensuite, ajouter 60 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solution dans le tube de 1,5 ml. Répétez d'une manière similaire à celle décrite dans la section 4.1.

7. Analyzing les mélanges de réaction de mercure (II) et des échantillons CGGC par spectrométrie de masse ESI Orbitrap

  1. Préparer le spectromètre de masse ESI 16
    1. Tracer 100 ul de standards d'étalonnage dans une seringue en verre de 500 ul.
    2. Placez la seringue dans le berceau de la seringue de la pompe de MS, fixez le tube et les injecter dans le spectrophotomètre de masse.
    3. Mettre en place le nom de fichier pour la course en sélectionnant l'icône du fichier et en tapant le nom du fichier.
    4. Sélectionnez le bouton de données d'acquérir dans le module d'acquisition de données et de recueillir 150 scans.
    5. Analyser le chromatogramme de vérifier les normes d'étalonnage en ouvrant module de traitement de données du logiciel. Ouvrez le module, allez dans le menu Fichier et sélectionnez "ouvrir", et sélectionnez le fichier dans la boîte de dialogue. Vérifiez que les pics dans le chromatogramme en corrélation avec la masse à la charge ratios des normes.
    6. Nettoyer la seringue en verre de 500 pi par 500 pi élaboration qualité HPLC du methanol, puis distribuer le méthanol dans un bécher.
    7. Dresser 500 pi de qualité HPLC méthanol dans la seringue de verre et rincer le système comme à l'étape 7.1.2.
    8. Sélectionnez le module de configuration de la méthode du logiciel pour définir les paramètres. Choisissez le menu de mode de balayage et identifier l'analyseur comme FTMS, puis cliquez sur "OK". Ensuite, en cliquant sur les différentes icônes sur la page vue spectre en temps réel, définissez les paramètres suivants: débit de gaz gaine: 10, température de la source: 0, la tension capillaire: 37 V, lentille de tube: 95 V, la tension de pulvérisation: 4,20 kV , débit 10,00 pi / min, Analyzer: FTMS, Nombre de balayages: 150.
  2. Courir échantillons CGGC sur ESI spectromètre de masse
    1. Exécutez le formate d'ammonium pH 7,5 tampon de 5 mM.
      1. Placez 500 pi de tampon formiate d'ammonium 5 mM dans la seringue en verre de 500 pi, le placer dans le berceau de la seringue de la pompe de MS, et fixer le tube.
      2. Tampon courir à travers le tube pendant 1-2 min.
      3. Mettre en place le nom de fichier pour la courseen sélectionnant l'icône du fichier et en tapant le nom du fichier.
      4. Sélectionnez le bouton de données d'acquérir dans le module et de recueillir 150 scans.
      5. Cliquez sur le bouton Exécuter pour arrêter la collecte après 150 scans sont collectées.
      6. Ouvrez le module d'exploration de données, puis allez dans le menu Fichier et sélectionnez "ouvrir", et sélectionnez le fichier dans la boîte de dialogue. Vérifiez qu'aucune des pics à 483, 683, 1 163 et 1 363 m / z sont présents qui ressemblent le peptide ou le mercure (II) complexes -peptide.
    2. Exécuter le 1: 0,5 mercure (II): solution à rapport CGGC.
      1. Placer 250 ul de 1: 0,5 mercure (II): rapport CGGC de l'échantillon dans la seringue.
      2. Placez la seringue dans le berceau de la seringue de la pompe de MS, fixez le tube, et le premier de l'appareil.
      3. Sélectionnez un nom de fichier pour la course en sélectionnant l'icône du fichier et en tapant le nom du fichier.
      4. Appuyez sur le bouton de données d'acquérir dans le module d'acquisition de données et de recueillir 150 scans et cliquez sur le bouton Exécuter pour arrêter la collection.
      5. Ouvrez le module, allez dans le menu Fichier et sélectionnez "ouvrir", et sélectionnez le fichier dans la boîte de dialogue. Vérifiez que le chromatogramme contient pics y compris celui pour le peptide CGGC seul.
      6. Laver la seringue par aspiration avec un tampon de formiate d'ammonium 500 pi puis distribuer le tampon formiate d'ammonium dans un bécher.
      7. Sélectionnez le bouton de déchets sur le MS et rincer la tubulure à trois reprises avec 500 tampon formiate d'ammonium ul.
      8. Laver la seringue en aspirant avec 500 ul méthanol, puis la distribution du méthanol dans un bécher.
      9. Rincer le tube une fois avec 500 ul de méthanol.
      10. Sélectionnez le bouton de détecteur de charge sur les MS.
      11. Ajouter 500 ul de tampon formiate d'ammonium à la seringue.
      12. Placez la seringue dans le berceau de la seringue de la pompe de MS, fixez le tube, et le premier de l'appareil.
      13. Sélectionnez un nom de fichier pour le tampon de fonctionner en sélectionnant l'icône du fichier et en tapant le nom du fichier.
      14. Appuyezle bouton de données d'acquérir et de recueillir 150 scans puis cliquez sur le bouton d'arrêt de l'exécution.
      15. Ouvrez le module d'exploration de données, allez dans le menu Fichier et sélectionnez "ouvrir", et sélectionnez le fichier dans la boîte de dialogue. Vérifiez que le chromatogramme est vide de sommets de la précédente Hg: terme CGGC.
    3. Exécuter le rapport 1: 1 de mercure (II): solution à rapport CGGC.
      1. Placer 250 ul de 1: 1 de mercure (II): rapport CGGC échantillon dans la seringue.
      2. Répéter d'une manière similaire à celle décrite pour les étapes 7.2.2.2 à 7.2.2.15.
    4. Exécuter le complexe 1: 2 de mercure (II): solution à rapport CGGC
      1. Placer 250 ul de 1: 2 de mercure (II): CGGC échantillon de concentration dans la seringue.
      2. Répéter d'une manière similaire à celle décrite pour les étapes 7.2.2.2 à 7.2.2.15.

8. Analyser les mélanges de réaction du mercure et des échantillons des PECO par spectrométrie de masse ESI Orbitrap

  1. Courir échantillons PECO sur ESI spectromètre de masse
    1. Répéter la procédure d'analyse (étapes 7.1 à 7.2) en utilisant des échantillons PECO et les mélanges de réaction de mercure (II) et PECO à différents rapports stoechiométriques.

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Representative Results

Une étude a été effectuée pour caractériser le mercure peptide composition complexe possible pour deux tétrapeptides CGGC et PECO (Figure 1) par spectrométrie de masse ESI. Complexes de mercure (II) avec CGGC ou PECO ont été étudiées en faisant réagir les mélanges de mercure (II) et des solutions de peptides à trois rapports différents molaire: 1: 0,5, 1: 1 et 1: 2 (mercure (II): peptide) . La concentration de mercure (II) est de 7,5 x 10 -6 M et la concentration du peptide modifié en conséquence.

Figure 1
Figure 1. Dicysteinyl structures peptidiques. Les structures chimiques des tétrapeptides de dicysteinyl, CGGC et des PECO. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 2
Figure 2. ESI MS de mercure (II) et l'ionisation par électrospray CGGC Orbitrap spectres de masse à partir d'une solution contenant 7,5 x 10 -6 M en Hg 2+ tampon de formiate d'ammonium, pH 7,5, contenant du Hg 2+ ou moins:. CGGC rapports stoechiométriques: (A ) 1: 0,5 rapport, (B) 1: 1, et (C) 1: 2 de rapport. Encarts montrent les modèles de mercure isotopiques des complexes de mercure peptide indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. ESI MS de mercure (II) et des PECO. Spectres de masse à ionisation par électropulvérisation de partirune solution contenant 7,5 x 10 -6 M en Hg 2+ tampon de formiate d'ammonium, pH 7,5, contenant du Hg 2+ variable: rapports stoechiométriques PECO: (A) 1: rapport 0,5, (B) 1: 1, et (C) 1 : rapport 2. Encarts montrent les modèles de mercure isotopiques des complexes de mercure peptide indiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Ionisation par électronébulisation Orbitrap chromatogrammes de masse ont été collectés pour le mercure (II) se complexer avec CGGC (figure 2) et PECO (figure 3) aux différents mercure (II) au peptide rapports stoechiométriques (1: 0,5, 1: 1, et 1: 2). Les types complexes de mercure-peptide observés montrent distinctes pics de mercure isotopiques (des encarts), qui sont utilisés pour déterminer le nombre d'ions de mercure dans le complexe ainsi que le nombre de Deprotonations. Par exemple, la figure 1b encart montre la signature mercure isotopique dans le produit d'addition peptidique de mercure, ce qui correspond aux sept principaux isotopes naturels de mercure: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), le pourcentage abondances naturelles indiquées entre parenthèses. Les deux principaux isotopes 200 et 202 Hg Hg montrent un ratio d'intensité par rapport distinct de 2,3: 3. En conséquence le pic isotopique la plus intense de cette grappe d'isotopes d'un mercure constitue la masse monoisotopique pour le produit d'addition (m / z = 539). Il est en corrélation avec un complexe à deux coordonnées, qui est formée par la déprotonation de deux thiols cystéinyl pour former le [(CGGC-2H + Hg) + H] + produit d'addition. Cette analyse est réalisée comme suit:

m / z valeur de [(CGGC-2H + Hg) + H] + est équal de (338 - 202 2 + 1) = 539.

La figure 1A montre l'encart signature isotopique mercure dans le produit d'addition peptidique de mercure, ce qui correspond à un complexe de deux mercure, tel que calculé en utilisant le programme de chemcal [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (Figure 4). La masse monoisotopique protonée théorique correspond à une valeur m / z de 1,077,061, qui est le neuvième sommet isotopique dans l'amas isotopique calculé. Figure 1A encart montre un pic isotopique correspondant à une valeur m / z de 1077,1, qui est aussi le neuvième sommet dans l'amas isotopique observée. Par conséquent, le produit d'addition provenant de ce groupe isotopique peut être attribué pour [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] +.

Figure 4
Figure 4. modèles isotopiques théoriques pour [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + sup>. Les modèles isotopiques théoriques pour [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + tel que calculé en utilisant le programme chemcal. La flèche indique la crête monoisotopique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. adduits cationisés. Certains des produits d'addition de sodium et de potassium cationisés associés avec les complexes de mercure-peptide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 5 montre certains produits d'addition de sodium et de potassium cationisé associés avec les complexes de mercure formées par CGGC peptide. Adduits Sodiated ya 22 unités de masse plus grande than l'complexes mercure CGGC protonés correspondants, tandis que les produits d'addition de potassium sont 38 grandes unités de masse. Le dimère CGGC protonée dominante (m / z = 677) forme également des espèces sodium avec cationisées (m / z = 699) et des ions de potassium (m / z = 715). Cela confirme en outre la formation de dimères CGGC sans l'oxydation des groupes thiol cystéinyl pour former des disulfures, ce qui aurait entraîné une diminution de deux unités de masse pour les adduits protonés ou cationisées.

Figure 6
Figure 6. chevauchement +1 et +2. Facturer aux États de pics qui se chevauchent associés à ions de mercure-peptide [(PECO-4H + 2HG) + H] + dans les Etats +1 et +2 frais. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

"Figure Figure 7. motifs isotopiques théoriques pour [(PECO-4H + 2Hg) + H] +. Les modèles isotopiques théoriques pour [(PECO-4H + 2Hg) + H] + comme calculées en utilisant le programme chemcal. La flèche indique la crête monoisotopique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La figure 6 montre se chevauchent pics associés à des produits d'addition de mercure PECO à la charge +1 et +2. Il montre des pics isotopiques qui sont associés avec des ions de mercure-peptide [(PECO-4H + 2HG) + H] + dans la charge +1 et une valeur m / z de 883. Ceci est en accord avec un complexe de deux mercure calculée pour [(PECO-4H + 2Hg) + H] + en utilisant le programme chemcal (figure 7). Le monoisotopique protonée théoriquemasse correspond à une valeur m / z de 883,032.

Le ci-dessus observé [(PECO-4H + 2Hg) + H] + produit d'addition avec un pic de 883,03 monoisotopique chevauche un autre produit d'addition contenant des pics correspondants montrant une masse de 0,5 unités supplémentaires. Avec la très haute résolution obtenue par l'instrument de spectrométrie de masse Orbitrap, on peut supposer que ces pics qui se chevauchent correspondent à des adduits avec une charge de +2. En conséquence, la masse mono-isotopique de la superposition complexe étant ionisé peut être calculée comme suit. La figure 8 montre que la différence m / z entre les pics isotopiques est de 0,5 et la différence de masse entre les deux est une amu. Par conséquent, l'état de charge est de +2. Pour calculer la masse du complexe de mercure-peptide, le m / z pour le pic monoisotopique est multiplié par l'état de charge, et soustraite de la masse de deux protons, qui a fait l'ion complexe chargé positivement.

Les calculs pour le produit d'addition 2:

m / z différence entre les pics isotopiques est de 0,5

Différence de masse entre les pics isotopiques est 1 uma (1 neutron)

z = 1 diviser par 0,5 = 2

m / z pour monoisotopique protonée de pic est (883,53 x 2) - 2 = 1765,06

La valeur m / z au-dessus du pic monoisotopique protonée, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, est en accord avec la valeur théorique calculée par le programme comme chemcal 1,765,056 (Figure 8).

Figure 8
Figure 8. Théoriquemodèles isotopiques pour [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. Les modèles isotopiques théoriques pour [(2CEEC-8H + 4HG) + H] + tel que calculé en utilisant le programme chemcal. La flèche indique la crête monoisotopique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L'avantage de l'analyse des complexes de mercure-peptide avec un spectromètre de masse ESI est de ce que la charge de chaque ion peut être facilement affectée comme indiqué ci-dessus. Peptides contenant des groupes amino-terminale de base peuvent facilement stabiliser charges positives. Lors de l'utilisation ionisation par électronébulisation et un analyseur de masse à haute résolution tels que le Orbitrap, l'état de charge des ions peptidiques avec plus de charge +1 peut être déterminée plus facilement par rapport à la résolution inférieure iontrap analyseur de masse.

(figure 3A et figure 6), tel que décrit ci-dessus, ont également été analysés par SM en tandem. Il n'a pas montré de fragmentation MS-MS, ce qui indique que les signaux obtenus appartiennent au composé attendu comme discuté ci-dessus, et ne sont pas regroupés objets formés à des concentrations plus élevées de mercure-à-peptide ratios.

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Discussion

Le dicysteinyl tétrapeptide hydrophobe CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; PM = 338) (figure 1), forme des complexes avec le mercure (II) tel que représenté sur la figure 2 et le tableau 1 De plus, il forme des dimères peptidiques et trimères. de façon incrémentielle lorsque la quantité de peptide augmentations du mélange réactionnel. Comme le montrent les valeurs m / z des dimères associés [(2M + H) + = 677] et des trimères [(3M + H) + = 1,015], les groupes thiol des CGGC ne pas oxyder pour former des disulfures dans les conditions expérimentales . La formation de ces espèces CGGC associés pourrait être dû à l'hydrophobie de ce tétrapeptide. CGGC forme deux types de complexes avec le mercure correspondant à 1: 1 de mercure (II): peptide et 1: 2 de mercure (II) :( peptide) 2 complexes comme indiqué précédemment pour tripeptides dicysteinyl 7. Cependant, en présence d'un excès de mercure ou équivalent (II), il a également forms un 2: 2 [mercure (II)] 2: (peptide) 2 complexe.

Le dicysteinyl tétrapeptide carboxylé PECO (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482) (figure 1) forment des complexes avec le mercure (II) comme le montre la figure 3 et le tableau 1 Il n'a pas former des dimères PECO aussi facilement. qui observent pour la CGGC plus hydrophobe. Comparable à CGGC, il forme des complexes avec le mercure correspondant à 1: 1 de mercure (II): et le peptide 1: 2 de mercure (II) :( peptide) 2 complexes. Cependant, avec les groupes carboxylate auxiliaires, il forme le 2: 2 [mercure (II)] 2: (peptide) deux complexes plus facilement. En outre, au-delà du mercure, il forme le 2: 1 [mercure (II)] 2: peptide complexe et le 4: 2 [mercure (II)] 4: (peptide) 2 complexe de peptide, qui ne sont pas observée pour CGGC.

Le résumé des signaux observés pour les complexes fORMED comme valeurs m / z sont indiquées au tableau 1.

Table 1

Tableau 1. Résumé des signaux des complexes peptide-mercure. Le mercure complexes peptidiques signaux dans les chromatogrammes LTQ / MS Orbitrap dans du tampon formiate d'ammonium, pH 7,5.

Nous avons démontré que la réaction de mercure (II) et deux tétrapeptides dicysteinyl de former des complexes qui sont fonction des proportions initiales de mercure (II): peptide ainsi que la présence de groupes de liaison auxiliaires dans le tétrapeptide de dicysteinyl. En outre, stoechiométrie précise de mercure et de peptide dans les complexes formés dans des conditions d'ionisation électrospray spécifié peut être déterminée en utilisant haute résolution ESI spectrométrie de masse sur la base de modèles de distribution isotopique de mercure distincte.

En réaction cystéinyl Peptides avec le mercure (II), des précautions doivent être prises pour empêcher l'oxydation des groupes cystéinyl thiols pour former des liaisons disulfures. Dans le protocole décrit, les solutions tampons ont été soigneusement dégazés et stockés sous atmosphère d'argon. En outre, tous les échantillons de réaction sont préparés immédiatement avant l'analyse par spectrométrie de masse ESI.

En raison de différences de solubilité entre les deux tétrapeptides, PECO et CGGC, différentes concentrations ont été utilisés pour préparer les solutions d'achat d'actions. Le congélateur stock d'CGGC peptide a été mouillée avec de l'acétonitrile et a été dissout facilement suivie par 5 mM de tampon formiate d'ammonium, pH 7,5 pour produire une solution de 7,5 x 10 -4 M CGGC. Le CEEC a été préparée à une concentration plus faible, de 7,5 x 10 -5 M, avant le mercure (II): peptidiques étapes de mélange de réaction en raison de sa plus faible solubilité. La dilution optimale pour l'analyse du mercure complexes (II) a été considérée comme 10 -5 M à cause de la solubilité du peptide et pour permettrepour l'élimination des résidus dans le spectromètre de masse. Dans contrat pour les solutions CGGC, résidus PECO adhèrent à la tubulure, ce qui nécessite le remplacement de tubes occasionnelle.

L'importance de l'utilisation de la spectrométrie de masse ESI pour l'analyse de complexes de peptide-mercure réside dans son ionisation douce d'analytes. Cela facilite l'analyse des ions moléculaires par fragmentation négligeable. Comme montré dans ce travail, il peut être utilisé pour caractériser les stoechiométries des complexes de mercure peptide sur la base des modèles de distribution de signature isotopique de mercure. Toutefois, un système de tampon volatil est nécessaire pour l'analyse par spectrométrie de masse ESI. Cela peut limiter son utilisation pratique pour identifier les analytes qui nécessitent des solvants moins volatils ou supports de tampons pour la dissolution.

Comme nous l'avons mentionné précédemment 7,8, spectrométrie de masse ESI fournit un outil d'analyse sensible pour une détermination précise de la stoechiométrie de mercure et PeptIDE dans les complexes de mercure peptide sous la condition d'ionisation électrospray spécifié. Cependant, il est nécessaire d'utiliser d'autres méthodes (par exemple, 1 H, 13 C, la spectroscopie RMN 199 Hg, X-ray absorption fine structure étendue, ou potentiométrie 17-18) pour fournir une détermination plus précise de la teneur en complexes de Solution.

Nous avons montré que ESI avec un analyseur de masse Orbitrap peut être utilisé pour analyser des complexes de peptide-mercure. Nous nous attendons à ce que cette technique peut être appliquée vers l'analyse d'autres ions métalliques et leurs complexes avec divers petits composés. Il sera particulièrement utile pour l'analyse de complexes formés par d'autres ions métalliques qui peuvent exister sous différentes formes isotopiques.

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Acknowledgments

MN-S reconnaît le soutien de la National Science Foundation, RUI accorder CHE 1011859. Les auteurs remercient le Fonds Triade spectrométrie de masse à l'Université de Caroline du Nord à Greensboro pour l'utilisation du spectromètre de masse Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Les auteurs remercient Daniel Todd, Vincent Sica, et Brandie Erhmann à l'Université de Caroline du Nord à Greensboro suggestions et commentaires utiles concernant ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

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Chimie numéro 107 complexes Mercury-peptidiques pics de mercure isotopiques spectrométrie de masse ESI MS peptides cystéinées
Une étude de la complexation du mercure (II) avec Dicysteinyl tétrapeptides par spectrométrie de masse électrospray
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Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

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