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Chemistry

Eine Studie der Komplexierung von Quecksilber (II) mit Dicysteinyl Tetrapeptide durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Hinweis: Bitte beachten Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Quecksilberchlorid ist eine giftige Chemikalie. Persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Schutzbrille und Labormantel) muss bei der Abgabe ist es und alle damit verbundenen Lösungen getragen werden. Entsorgen Sie die Lösungen in klar beschriftet für Schwermetalle bezeichnet chemische Abfallflaschen.

1. Herstellung von 5 mM Entgastes Ammoniumformiat-Puffer, pH 7,5

  1. Aufzulösen 0,1576 g Ammoniumformiat-Puffer in 450 ml Wasser mit HPLC. Einstellen des pH der obigen Lösung mit 1 M Ameisensäure und 1 M Ammoniumhydroxid auf 7,5. Diese Lösung in einen 500-ml-Messkolben und fügen HPLC-Wasser bis zur Marke, um eine 5 mM Ammoniumformiat-Lösung zu machen.
  2. Entgasen das 5 mM Ammoniumformiat-Puffer bei einem Vakuum-System für 10 Minuten und Spülung mit Argon. Zweimal wiederholen und Filiallösung unter Argon. Am Tag der Anwendung filtern die Pufferlösung durch einen 0,2 Mikron-Filter vor deme Gebrauch.

2. Herstellung von Quecksilber (II) -chlorid-Lösungen

  1. Abwiegen 0,2375 g Quecksilber (II) -chlorid. Löst ihn in 25 ml von 5 mM Ammoniumformiat-Puffer, um eine 0,035 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung zu erzeugen.
  2. Hinzufügen 0,214 ml von 0,035 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung bis 9.785 ml 5 mM Ammoniumformiat-Puffer, um einen 7,5 x 10 -4 M-Lösung. Decke die 7,5 x 10 -4 M Quecksilber (II) Lösung mit Argongas.

3. Herstellung von CGGC Stammlösung

  1. Aufzulösen 2,0 mg des dicysteinyl Tetra CGGC, in 0.118 ml Acetonitril von HPLC-Qualität und fügen 1,0647 ml 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5 Puffer, der in Argon entgast wurde, um eine 5 mM Stammlösung zu ergeben CGGC.
  2. Fügen Sie 225 ul der 5 mM CGGC Stammlösung zu 1275 ul 5 mM Ammoniumbildung pH 7,5-Puffer, um eine 7,5 x 10 -4 M CGGC Lösung.

4. Vorbereitungverschiedener Reaktions Mischungen von Quecksilber (II) und CGGC

  1. Herstellung 1: 0,5-Verhältnis von Quecksilber (II): CGGC Lösung
    1. Platzieren 255 ul 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werden 30 & mgr; l von 7,5 x10 -4 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Ammoniumformiat-Puffer.
    2. Vortex die Lösung für 10 Sek. Dann fügen Sie 15 ul 7,5 x 10 -4 M CGGC Lösung in den 1,5-ml-Mikro. Vortex die Lösung für 10 Sek. Lassen Sie die Lösung stehen für 10 Minuten vor der Injektion in das Massenspektrometer.
  2. Herstellung von 1: 1-Verhältnis von Quecksilber (II): CGGC Lösung
    1. Platzieren 240 ul 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werden 30 & mgr; l von 7,5 x10 -4 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Ammoniumformiat-Puffer.
    2. Vortex die Lösung für 10 Sek. DannAdd 30 ul 7,5 x 10 -4 M CGGC Lösung in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie in einer ähnlichen Weise, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.
  3. Herstellung von 1: 2-Verhältnis von Quecksilber (II): CGGC Lösung
    1. Platzieren 210 ul 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werden 30 & mgr; l von 7,5 x10 -4 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Ammoniumformiat-Puffer.
    2. Vortex die Lösung für 10 Sek. Dann fügen Sie 60 ul von 7,5 x 10 -4 M CGGC Lösung in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie in einer ähnlichen Weise, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.

5. Vorbereitung der MOEL-Stammlösung

  1. Man löst 3,5 mg des dicysteinyl Tetrapeptid, MOEL, in 0.145 ml Acetonitril von HPLC-Qualität, um das Peptid zu lösen. Fügen 13,067 ml 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5 Puffer, der in Argon entgast wurde, um 0,5 m zu erzeugenM MOEL-Lösung.
  2. Vortex die Lösung, bis alle Peptid wird aufgelöst. Hinzufügen von 1,125 ml 0,5 mM MOE-Lösung und 0,375 ml von 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, eine 7,5 x 10 -5 M MOE Lösung zu ergeben. Vortex, bis gemischt.

6. Herstellung von verschiedenen Reaktions Mischungen von Quecksilber (II) und den MOEL-Lösung

  1. Herstellung 1: 0,5-Verhältnis von Quecksilber (II): MOE Lösung
    1. Platzieren 255 ul 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werden 30 & mgr; l von 7,5 x10 -4 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Ammoniumformiat-Puffer.
    2. Vortex die Lösung für 10 Sek. Dann fügen Sie 15 ul 7,5 x 10 -4 M MOEL-Lösung in die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie in einer ähnlichen Weise, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.
  2. Herstellung von 1: 1-Verhältnis von Quecksilber (II): MOE Lösung
    1. Zeigen 24081; l von 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werden 30 & mgr; l von 7,5 x10 -4 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Ammoniumformiat-Puffer.
    2. Vortex die Lösung für 10 Sek. Dann fügen Sie 30 ul 7,5 x 10 -4 M MOEL-Lösung in die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie in einer ähnlichen Weise, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.
  3. Herstellung von 1: 2-Verhältnis von Quecksilber (II): MOE Lösung
    1. Platzieren 210 ul 5 mM Ammoniumformiat, pH 7,5-Puffer in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Werden 30 & mgr; l von 7,5 x10 -4 M Quecksilber (II) -chlorid-Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Ammoniumformiat-Puffer.
    2. Vortex die Lösung für 10 Sek. Dann fügen Sie 60 ul von 7,5 x 10 -4 M MOEL-Lösung in die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie in einer ähnlichen Weise, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.

7. Analyzing Die Reaktionsgemische von Quecksilber (II) und CGGC Proben von Orbitrap ESI-Massenspektrometrie

  1. Vorbereiten des ESI-Massenspektrometer 16
    1. Zeichnen Sie 100 ul Eichstandards in einen 500 & mgr; l-Glasspritze.
    2. Legen Sie die Spritze in der Spritzen Wiege der MS Pumpe, befestigen Sie den Schlauch, und injizieren in die Masse Spektralphotometer.
    3. Richten Sie den Dateinamen für den Lauf, indem Sie auf das Dateisymbol und geben Sie den Dateinamen.
    4. Wählen Sie erwerben Daten Schaltfläche in der Datenerfassungsmodul und sammeln Sie 150 Scans.
    5. Analyse des Chromatogramms, um die Kalibrierungsstandards durch Öffnen Datenverarbeitungsmodul der Software zu überprüfen. Öffnen Sie das Modul, gehen Sie im Menü Datei und wählen Sie "Öffnen", und wählen Sie die Datei im Dialogfeld. Sicherzustellen, dass die Peaks im Chromatogramm korrelieren mit der Masse, um Verhältnisse der Standards zu berechnen.
    6. Reinigen Sie den 500 ul Glasspritze durch die Erstellung von 500 ul HPLC-Qualität Methanol, dann verzichten die mEthanol in einem Becherglas.
    7. Auszuarbeiten 500 ul HPLC-Qualität Methanol in das Glas Spritze und spülen Sie das System gemäß Schritt 7.1.2.
    8. Wählen Sie die Methode Setup-Modul der Software, um die Parameter einzustellen. Wählen Sie den Scan-Modus-Menü und Identifizierung der Analysator FTMS, und klicken Sie auf "OK". Dann, indem Sie auf die verschiedenen Symbole auf der Echtzeit-Ansicht Spektrum Seite, die folgenden Parameter: Mantel Gasdurchsatz: 10, Quelle Temperatur: 0, Kapillare Spannung: 37 V, U-Objektiv: 95 V, Spray Spannung: 4,20 kV , Durchflussmenge 10,00 & mgr; l / min, Analyzer: FTMS, Anzahl der Scans: 150.
  2. Laufende CGGC Proben auf ESI-Massenspektrometer
    1. Führen Sie das 5 mM Ammoniumformiat pH 7,5 Puffer.
      1. Zeigen 500 ul 5 mM Ammoniumformiat-Puffer in die 500 & mgr; l-Glasspritze, legen Sie sie in die Spritze Wiege der MS-Pumpe, und befestigen Sie den Schlauch.
      2. Pufferlauf durch die Rohrleitung für 1-2 min.
      3. Richten Sie den Dateinamen für den Laufindem Sie auf das Dateisymbol und geben Sie den Dateinamen.
      4. Wählen Sie erwerben Schaltfläche Daten in das Modul und sammeln Sie 150 Scans.
      5. Klicken Sie auf den Schalter zum Sammlung zu stoppen, nachdem 150 Scans gesammelt werden.
      6. Öffnen Sie den Daten-Browser-Modul, dann gehen Sie im Menü Datei und wählen Sie "Öffnen", und wählen Sie die Datei im Dialogfeld. Stellen Sie sicher, dass keine Peaks bei 483, 683, 1163 und 1363 m / z vorhanden sind, die das Peptid oder Quecksilber (II) -Peptid-Komplexe ähnlich sind.
    2. Führen Sie das 1: 0,5 Quecksilber (II): CGGC Verhältnis Lösung.
      1. Platzieren 250 ul 1: 0,5 Quecksilber (II): CGGC Verhältnis der Probe in die Spritze.
      2. Legen Sie die Spritze in die Spritzen Wiege der MS Pumpe, befestigen Sie den Schlauch und die Vorrichtung vorzubereiten.
      3. Wählen Sie einen Dateinamen für die Sicht, indem Sie auf das Dateisymbol und geben Sie den Dateinamen.
      4. Drücken Sie die acquire Daten Schaltfläche in der Datenerfassungsmodul und sammeln Sie 150 Scans und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Sammlung zu stoppen.
      5. Öffnen Sie das Modul, gehen Sie im Menü Datei und wählen Sie "Öffnen", und wählen Sie die Datei im Dialogfeld. Stellen Sie sicher, dass das Chromatogramm enthält Peaks, einschließlich der für den CGGC Peptid allein.
      6. Durch Absaugen mit 500 ul Ammoniumformiat-Puffer, und dann Abgeben der Ammoniumformiat-Puffer in ein Becherglas zu waschen die Spritze.
      7. Wählen Sie das Abfall Taste auf der MS und spülen Sie den Schlauch dreimal mit 500 & mgr; l Ammoniumformiat-Puffer.
      8. Durch Absaugen mit 500 ul Methanol und dann Abgeben der Methanol in ein Becherglas zu waschen die Spritze.
      9. Spülen Sie die Schläuche einmal mit 500 ul Methanol.
      10. Wählen Lastdetektor Taste auf die MS.
      11. Gib 500 ul der Ammoniumformiat-Puffer, um die Spritze.
      12. Legen Sie die Spritze in die Spritzen Wiege der MS Pumpe, befestigen Sie den Schlauch und die Vorrichtung vorzubereiten.
      13. Wählen Sie einen Dateinamen für den Puffer, indem Sie auf das Dateisymbol und geben Sie den Dateinamen ausführen.
      14. Drücken Siedie acquire Datentaste und sammeln Sie 150 Scans und klicken Sie auf die Stopp-Taste RUN.
      15. Öffnen Sie den Daten-Browser-Modul, gehen Sie im Menü Datei und wählen Sie "Öffnen", und wählen Sie die Datei im Dialogfeld. Stellen Sie sicher, dass das Chromatogramm ist nichtig von Gipfeln aus dem vorherigen Hg: CGGC Lauf.
    3. Führen Sie den 1: 1-Quecksilber (II): CGGC Verhältnis Lösung.
      1. Platzieren 250 ul 1: 1 Quecksilber (II): CGGC Verhältnis Probe in die Spritze.
      2. Wiederholt in einer ähnlichen Weise wie für die Schritte 7.2.2.2 bis 7.2.2.15 beschrieben.
    4. Führen Sie den 1: 2 Quecksilber (II): CGGC Verhältnis Lösung
      1. Platzieren 250 ul 1: 2 Quecksilber (II): CGGC Konzentration Probe in die Spritze.
      2. Wiederholt in einer ähnlichen Weise wie für die Schritte 7.2.2.2 bis 7.2.2.15 beschrieben.

8. Die Analyse der Reaktionsgemische von Merkur und MOEL Proben von Orbitrap ESI-Massenspektrometrie

  1. Laufende MOEL Proben auf ESI-Massenspektrometer
    1. Wiederholen Sie die Analyseverfahren (Schritte von 7,1 bis 7,2) mit MOEL Proben und Reaktionsgemische von Quecksilber (II) und den MOEL an verschiedenen stöchiometrischen Verhältnissen.

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Representative Results

Eine Studie wurde durchgeführt, um die mögliche Quecksilber-Peptid-Komplex-Zusammensetzung für zwei Tetrapeptiden, CGGC und den MOEL (Abbildung 1) durch ESI-Massenspektrometrie zu charakterisieren. Komplexe von Quecksilber (II) mit CGGC oder MOE wurden durch Umsetzung der Mischungen aus Quecksilber untersucht (II) und Peptidlösungen in drei verschiedenen Molverhältnissen: 1: 0,5, 1: 1 und 1: 2 (Quecksilber (II): Peptid) . Die Konzentration von Quecksilber (II) betrug 7,5 x 10 -6 M und die Peptidkonzentration entsprechend variiert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Dicysteinyl Peptidstrukturen. Chemische Strukturen der dicysteinyl Tetrapeptide, CGGC und den MOEL. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Abbildung 2 ESI MS von Quecksilber (II) und CGGC Elektrosprayionisation Orbitrap-Massenspektren von einer Lösung, die 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ in Ammoniumformiat-Puffer, pH 7,5, enthaltend variierende Hg 2+. CGGC stöchiometrischen Verhältnissen: (A ) 1: 0,5 Verhältnis, (B) 1: 1-Verhältnis, und (C) 1: 2-Verhältnis. Einschübe zeigen die Quecksilber-Isotopenmuster der angegebenen Quecksilber-Peptid-Komplexe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. ESI MS von Quecksilber (II) und den MOEL. Elektrospray-Ionisation Orbitrap-Massenspektren voneine Lösung, die 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ in Ammoniumformiat-Puffer, pH 7,5, enthaltend variierende Hg 2+: MOE stöchiometrischen Verhältnissen: (A) 1: 0,5 Verhältnis, (B) 1: 1-Verhältnis, und (C) 1 : 2-Verhältnis. Einschübe zeigen die Quecksilber-Isotopenmuster der angegebenen Quecksilber-Peptid-Komplexe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Elektrospray-Ionisation Orbitrap Massenchromatogrammen wurden für Quecksilber (II) Komplexbildung mit CGGC (Abbildung 2) und den MOEL (Abbildung 3) an verschiedenen Quecksilber (II) zur stöchiometrischen Verhältnissen Peptid gesammelt (1: 0,5, 1: 1 und 1: 2). Die beobachteten Quecksilber-Peptid-Komplex-Typen zeigen deutliche Quecksilberisotopenpeaks (Einlagen), die verwendet werden, um die Anzahl der Quecksilberionen in der Anlage als auch die Anzahl der Depro bestimmentonations. Zum Beispiel 1b Einschub zeigt das Quecksilber isotopische Signatur in der Peptid-Quecksilber-Addukts, die auf die sieben Haupt natürlich vorkommenden Isotope von Quecksilber entspricht: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), wobei Prozent natürlichen Häufigkeiten in Klammern angegeben. Die beiden wichtigsten Isotope 200 Hg und 202 Hg zeigen eine deutliche relative Intensitätsverhältnis von 2,3: 3. Entsprechend der intensivste Isotopen Spitze dieses eintQuecksilberIsotop Cluster bildet die monoisotopische Masse für das Addukt (m / z = 539). Er korreliert mit einem Zwei-Koordinations-Komplex, der durch die Deprotonierung von zwei Cysteinyl Thiolen gebildet wird, um die Bildung von [(CGGC-2H + Hg) + H] + Addukt. Diese Analyse wird wie folgt hergestellt:

m / z-Wert für [(CGGC-2H + Hg) + H] + ist equal bis (338-2 + 202 + 1) = 539.

1A Einschub zeigt die Quecksilber isotopische Signatur in der Peptid-Quecksilber-Addukt, was einer zwei Quecksilberphenylalkinyl entspricht, wie unter Verwendung des chemcal Programm [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (4) berechnet. Die theoretische protonierten monoisotopische Masse entspricht einem m / z-Wert von 1077.061, der neunten Isotopen Peak im berechneten Isotopencluster. 1A Einschub zeigt Isotopen Peak entsprechend einem m / z-Wert von 1077,1, was auch die neunte Spitzen im betrachteten Isotopencluster. Daher kann der Ursprung für dieses Addukt Isotopencluster für [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + zugeordnet werden.

Figur 4
Abbildung 4. Theoretische Isotopenmuster für [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + sup>. Die theoretischen Isotopenmuster für [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + B. mithilfe des chemcal Programm berechnet. Pfeil zeigt monoisotopischen Peaks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Kationisierte Addukte. Einige kationisierte Natrium- und Kalium-Addukte mit dem Quecksilber-Peptid-Komplexe verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5 zeigt einige kationisierten Natrium- und Kalium-Addukte mit dem Quecksilber-Peptid-Komplexe durch CGGC gebildet verbunden. Sodiated Addukte sind 22 Masseneinheiten größer than die entsprechenden protonierten quecksilber CGGC Komplexe, während die Kalium-Addukte sind 38 Masseneinheiten größer. Die dominante protonierten CGGC Dimer (m / z = 677) bildet auch kationisierte Spezies mit Natrium (m / z = 699) und Kaliumionen (m / z = 715). Dies bestätigt die Bildung von Dimeren CGGC ohne die Oxidation der Cysteinyl Thiolgruppen zu Disulfiden bilden, was zu einer Abnahme von zwei Masseneinheiten für protonierter oder kationisierten Addukte ergeben hätte.

Figur 6
Abbildung 6. Overlapping +1 und +2 Ladungszustände. Overlapping Spitzen mit Quecksilber-Peptidionen [(MOEL-4H + 2Hg) + H] + in den +1 und +2 Ladungszuständen verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen dieser Figur.

"7" Abbildung 7. Theoretische Isotopenmuster für [(MOEL-4H + 2Hg) + H] +. Die theoretischen Isotopenmuster für [(MOEL-4H + 2Hg) + H] + als mit Hilfe der chemcal Programm berechnet. Pfeil zeigt monoisotopischen Peaks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6 zeigt überlappenden Peaks mit Quecksilber-MOEL-Addukte in der +1 und +2 Gebühr verbunden. Es zeigt Isotopenspitzen, die mit Quecksilber-Peptidionen [(MOEL-4H + 2Hg) + H] + in der ein Laden und ein m / z-Wert von 883. Damit verbunden sind in Übereinstimmung mit einem Zwei-Quecksilberkomplex wie berechnet [(MOEL-4H + 2Hg) + H] + mit Hilfe der chemcal Programm (Abbildung 7). Die theoretische protonierten monoisotopischenMasse entspricht einem m / z-Wert von 883,032.

Die oben beobachtet [(MOE-4H + 2Hg) + H] + Addukt mit einem monoisotopischen Peak von 883,03 überlappt mit einem anderen Addukt enthaltenden entsprechenden Peaks, die zusätzlich 0,5 Masseneinheiten. Mit der von der Orbitrap Massenspektrometrie Instrument erzielt extrem hohe Auflösung, es kann postuliert werden, dass diese sich überlappenden Peaks entsprechen Addukte mit einer Ladung von +2. Dementsprechend ist die monoisotopische Masse des überlappenden komplexen ionisiert kann wie folgt berechnet werden. 8 zeigt, dass die m / z-Differenz zwischen den Isotopen-Peaks bei 0,5 und die Massendifferenz zwischen ihnen ist 1 amu. Daher ist der Ladezustand +2. Zur Berechnung der Masse des Quecksilber-Peptid-Komplex ist der m / z für das monoisotopische Peak durch den Ladezustand multipliziert und von der Masse der beiden Protonen, die die komplexe Ionen positiv geladen gemacht subtrahiert.

Die Berechnungen für die 2-Addukt:

m / z Unterschied zwischen Isotopen-Peaks 0,5

Massendifferenz zwischen den Isotopen-Peaks 1 amu (1 Neutron)

z = 1 Division durch 0,5 = 2

m / z für protonierte monoisotopischen Peaks ist (883,53 x 2) - 2 = 1.765,06

Die obige m / z-Wert für das protonierte monoisotopischen Peaks [(2CEEC 8H + 4HG) + H] +, steht im Einklang mit dem theoretischen Wert, wie durch die chemcal Programm als 1765,056 (Figur 8) berechnet.

Abbildung 8
Abbildung 8. TheoretischeIsotopenmuster für [(2CEEC 8H + 4HG) + H] +. Die theoretischen Isotopenmuster für [(2CEEC 8H + 4HG) + H] + B. mithilfe des chemcal Programm berechnet. Pfeil zeigt monoisotopischen Peaks. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Der Vorteil des Analysierens Quecksilber-Peptid-Komplexe mit einer ESI Orbitrap-Massenspektrometer ist, dass die Ladung von jedem Ionen können leicht, wie oben gezeigt, zugewiesen werden. Peptide, die Grund Aminoterminus leicht stabilisieren positive Ladungen. Bei der Verwendung von Elektrospray-Ionisation und eine hohe Auflösung Massenanalysator wie die Orbitrap, den Ladezustand der Peptidionen mit mehr als 1 Ladung bestimmt leichter verglichen werden, um die niedrigere Auflösung iontrap Massenanalysator.

(3A und 6) verbunden sind, wie oben beschrieben, wurden auch durch Tandem-MS untersucht. Es fanden keine MS-MS-Fragmentierung, was zeigte, daß die erhaltenen Signale gehören zu der erwarteten Verbindung wie oben diskutiert, und werden nicht gruppiert Artefakte bei höheren Konzentrationen von Quecksilber-zu-Peptid-Verhältnissen gebildet zeigen.

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Discussion

Das hydrophobe dicysteinyl Tetra CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; Mw = 338) (Figur 1) bildet Komplexe mit Quecksilber (II), wie in Abbildung 2 dargestellt und in Tabelle 1 Zusätzlich Peptid-Dimere und Trimere bildet. inkrementell als die Menge des Peptids erhöht sich in der Reaktionsmischung. Wie durch die m / z-Werte der zugehörigen Dimere [(2M + H) + = 677] und Trimere gezeigt [(3M + H) + = 1015], die Thiolgruppen CGGC nicht oxidieren zu Disulfiden unter den Versuchsbedingungen zu bilden . Die Bildung dieser Spezies assoziiert CGGC konnte aufgrund der Hydrophobie dieses Tetrapeptid sein. CGGC bildet zwei Arten von Komplexen mit Quecksilber entsprechend 1: 1 Quecksilber (II): Peptid-und 1: 2 Quecksilber (II) :( Peptid) 2-Komplexe, wie zuvor für dicysteinyl Tripeptide 7 gemeldet. Jedoch in Gegenwart eines Überschusses oder einer gleichwertigen Quecksilber (II), sondern auch forms ein 2: 2 [Quecksilber (II)] 2: (Peptid) 2 -Komplexes.

Der carboxylierte dicysteinyl Tetra MOE (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; Mw = 482) (Figur 1) bilden Komplexe mit Quecksilber (II), wie in Abbildung 3 und Tabelle 1 gezeigt Es hat MOE Dimere so leicht wie bildet. dass zu beobachten für die hydrophoberen CGGC. Vergleichbar CGGC bildet sie Komplexe mit Quecksilber entsprechend 1: 1 Quecksilber (II): Peptid-und 1: 2 Quecksilber (II) :( Peptid) 2 -Komplexen. Jedoch mit den Hilfs Carboxylatgruppen, bildet er die 2: 2 [Quecksilber (II)] 2: (Peptid) 2-Komplex leichter. Außerdem übersteigt Quecksilber, bildet er das 2: 1 [Quecksilber (II)] 2: Peptid-Komplex und das 4: 2 [Quecksilber (II)] 4: (Peptid) 2-Peptid-Komplex, der nicht zu CGGC beobachtet.

Die Zusammenfassung der beobachteten Signale für die Komplexe fORMED als m / z-Werte sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Tabelle 1. Zusammenfassung der Quecksilber-Peptid-Komplexe Signalen. Mercury-Peptid-Komplexe Signale in den LTQ / Orbitrap MS-Chromatogramme Ammoniumformiat-Puffer, pH 7,5.

Wir haben gezeigt, dass die Reaktion von Quecksilber (II) und zwei Tetrapeptiden dicysteinyl Komplexe bilden, die abhängig von den anfänglichen Verhältnissen von Quecksilber (II) sind: Peptid sowie das Vorhandensein von Hilfsbindegruppen in der dicysteinyl Tetrapeptid. Darüber hinaus können genaue Stöchiometrie von Quecksilber und Peptid in der unter festgelegten Bedingungen Elektrospray-Ionisation gebildeten Komplexe unter Verwendung hochauflösende ESI-Massenspektrometrie basierend auf unterschiedlichen Quecksilberisotopenverteilungsmuster bestimmt werden.

Bei der Umsetzung cysteinyl Peptides mit Quecksilber (II), müssen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um die Oxidation der Thiolgruppen zu vermeiden cysteinyl Disulfidbindungen bilden. In dem beschriebenen Protokoll wurden die Pufferlösungen sorgfältig entgast und unter Argon gelagert. Darüber hinaus werden alle Reaktionsproben unmittelbar vor der Analyse durch ESI-Massenspektrometrie vorbereitet.

Aufgrund von Unterschieden in der Löslichkeit zwischen den beiden Tetrapeptide, MOEL und CGGC, wurden unterschiedliche Konzentrationen verwendet, um die Stammlösungen vorzubereiten. Das Gefrier Bestand CGGC Peptid wurde mit Acetonitril befeuchtet und wurde leicht aufgelöst nach 5 mM Ammoniumformiat-Puffer, pH 7,5 bis 7,5 x 10 -4 M CGGC Lösung zu erzeugen, gefolgt. Das MOE wurde bei einer geringeren Konzentration hergestellt, 7,5 × 10 -5 M, vor der Quecksilber (II): Peptid-Reaktionsgemisch Schritte aufgrund seiner geringeren Löslichkeit. Die optimale Verdünnung für die Analyse von Quecksilber (II) -Komplexen wurde erachtet werden, weil die Löslichkeit des Peptids und es zu erlauben, 10 -5 M seinzur Entfernung von Rückständen in das Massenspektrometer. Im Gegensatz zur CGGC Lösungen MOEL Reste haften an der Rohrleitung, die gelegentlichen Schlauch Ersatz erforderlich macht.

Die Bedeutung der Verwendung von ESI-Massenspektrometrie für die Analyse von Quecksilber-Peptid-Komplexe liegt in ihrer Weich Ionisation von Analyten. Dies erleichtert die Analyse von Molekülionen mit vernachlässigbarer Fragmentierung. Wie in dieser Arbeit gezeigt, kann es verwendet werden, um die Stöchiometrie von Quecksilber-Peptid-Komplexe auf der Basis der Signatur Quecksilber Isotopenverteilungsmuster zu charakterisieren. Jedoch ist ein flüchtiges Puffersystem für die Analyse mittels ESI-Massenspektrometrie erforderlich. Dies kann seine praktische Anwendung zur Identifizierung von Analyten, die weniger flüchtige Lösemittel oder Puffermittel zur Auflösung benötigen begrenzen.

Wie wir bereits erwähnt 7,8 liefert ESI Massenspektrometrie eine empfindliche Analysewerkzeug für eine genaue Bestimmung der Stöchiometrie von Quecksilber und Peptide in den Quecksilber-Peptid-Komplexe unter dem angegebenen Elektrospray-Ionisation Zustand. Allerdings ist es notwendig, zusätzliche Methoden verwenden (zum Beispiel, 1 H, 13 C, 199 Hg-NMR-Spektroskopie, erweiterte Röntgenabsorptionsfeinstruktur oder Potentiometrie 17-18), um eine genauere Bestimmung des Gehaltes von Komplexen in bereitzustellen Lösung.

Wir haben gezeigt, dass mit einer ESI Orbitrap Massenanalysator verwendet werden, um Quecksilber-Peptid-Komplexe zu analysieren. Wir erwarten, dass diese Technik in Richtung auf die Analyse von anderen Metallionen und ihre Komplexe mit verschiedenen kleinen Verbindungen, aufgebracht werden. Es wird besonders nützlich für die Analyse von Komplexen durch andere Metallionen, die in verschiedenen isotopischen Formen vorliegen, gebildet werden.

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Acknowledgments

MN-S erkennt an Unterstützung von der National Science Foundation, RUI gewähren CHE 1011859. Die Autoren danken der Triad-Massenspektrometrie der Einrichtung an der Universität von North Carolina in Greensboro für die Verwendung des Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL-Massenspektrometer. Die Autoren danken Daniel Todd, Vincent Sica und Brandie Erhmann an der Universität von North Carolina in Greensboro für Anregungen und Kommentare zu dieser Arbeit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

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Chemie Heft 107 Mercury-Peptid-Komplexe Quecksilber Isotopenspitzen Massenspektrometrie ESI MS cysteinyl Peptide
Eine Studie der Komplexierung von Quecksilber (II) mit Dicysteinyl Tetrapeptide durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie
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Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

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