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Chemistry

Electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा Dicysteinyl Tetrapeptides साथ पारा (द्वितीय) की Complexation का एक अध्ययन

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

नोट: उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) से परामर्श करें। पारा क्लोराइड एक जहरीले रसायन है। यह और सभी संबद्ध समाधान सौंपने जब व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, सुरक्षा चश्मे, और प्रयोगशाला कोट) पहना जाना चाहिए। भारी धातुओं के लिए नामित स्पष्ट रूप से लेबल रासायनिक कचरे की बोतलों में समाधान के निपटान के।

1. तैयारी 5 मिमी degassed अमोनियम के Formate बफर, पीएच 7.5

  1. एचपीएलसी ग्रेड पानी की 450 मिलीलीटर में अमोनियम formate बफर के 0.1576 ग्राम भंग। 1 एम फार्मिक एसिड और 7.5 के लिए 1 एम अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ ऊपर समाधान के पीएच को समायोजित करें। एक 500 मिलीलीटर फ्लास्क को यह समाधान स्थानांतरण और एक 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप समाधान बनाने के लिए अंशांकन लाइन के लिए एचपीएलसी पानी जोड़ें।
  2. आर्गन के साथ 10 मिनट और शुद्ध के लिए एक निर्वात प्रणाली के तहत 5 मिमी अमोनियम formate बफर देगास। दो बार दोहराएँ और आर्गन के तहत दुकान समाधान। उपयोग के दिन, एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर befor के माध्यम से बफर समाधान फ़िल्टरई का उपयोग करें।

पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान की 2. तैयारी

  1. 0.2375 ग्राम पारा (द्वितीय) क्लोराइड वजन। एक 0.035 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान का उत्पादन करने के लिए 5 मिमी अमोनियम formate बफर के 25 एमएल में भंग।
  2. एक 7.5 x 10 -4 एम समाधान बनाने के लिए 9.785 मिलीग्राम 5 मिमी अमोनियम formate बफर करने के लिए 0.214 मिलीग्राम 0.035 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान की जोड़ें। आर्गन गैस के साथ 7.5 x 10 -4 एम पारा (द्वितीय) समाधान कंबल।

CGGC स्टॉक समाधान के 3. तैयारी

  1. HPLC ग्रेड acetonitrile की 0.118 मिलीग्राम में dicysteinyl tetrapeptide, CGGC के 2.0 मिलीग्राम, भंग और फिर 1.0647 मिलीग्राम 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच एक 5 मिमी CGGC शेयर समाधान उपज के लिए आर्गन में degassed किया गया है कि 7.5 बफर के जोड़ें।
  2. 5 मिमी अमोनियम गठन पीएच की 1,275 μl करने के लिए एक 7.5 x 10 -4 एम CGGC समाधान देने के लिए 7.5 बफर 5 मिमी CGGC शेयर समाधान के 225 μl जोड़ें।

4. तैयारीपारा (द्वितीय) और CGGC के विभिन्न प्रतिक्रिया मिश्रण की

  1. 1 की तैयारी: पारा 0.5 अनुपात (द्वितीय): CGGC समाधान
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच 7.5 बफर के 255 μl रखें। अमोनियम formate बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 X10 -4 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान के 30 μl जोड़ें।
    2. 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। फिर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge में 7.5 x 10 -4 एम CGGC समाधान के 15 μl जोड़ें। 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। समाधान मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्शन के लिए पहले 10 मिनट के लिए खड़े हैं।
  2. पारा के 1 के अनुपात (द्वितीय): 1 की तैयारी CGGC समाधान
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच 7.5 बफर के 240 μl रखें। अमोनियम formate बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 X10 -4 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान के 30 μl जोड़ें।
    2. 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। फिर1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 x 10 -4 एम CGGC समाधान के 30 μl जोड़ें। धारा 4.1 में वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।
  3. पारा के 2 अनुपात (द्वितीय): 1 की तैयारी CGGC समाधान
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच 7.5 बफर के 210 μl रखें। अमोनियम formate बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 X10 -4 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान के 30 μl जोड़ें।
    2. 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। फिर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 x 10 -4 एम CGGC समाधान के 60 μl जोड़ें। धारा 4.1 में वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।

CEEC स्टॉक समाधान के 5. तैयारी

  1. पेप्टाइड भंग करने के लिए एचपीएलसी ग्रेड acetonitrile की 0.145 मिलीग्राम में dicysteinyl tetrapeptide, CEEC की 3.5 मिलीग्राम, भंग। तब 13.067 एमएल 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप के जोड़ने, पीएच आर्गन में degassed किया गया है कि 7.5 बफर 0.5 मीटर का उत्पादन करने के लिएएम CEEC समाधान।
  2. सभी पेप्टाइड भंग कर रहा है जब तक समाधान भंवर। एक 7.5 x 10 -5 एम CEEC समाधान देने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, पीएच 7.5 बफर CEEC समाधान 1.125 मिलीग्राम 0.5 मिमी जोड़ें और 0.375 मिलीग्राम मिमी 5 की अमोनियम वह स्वरूप। भंवर मिश्रित जब तक।

पारा (द्वितीय) और CEEC समाधान के विभिन्न प्रतिक्रिया मिश्रण 6. तैयारी

  1. 1 की तैयारी: पारा (द्वितीय) के 0.5 अनुपात: CEEC समाधान
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच 7.5 बफर के 255 μl रखें। अमोनियम formate बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 X10 -4 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान के 30 μl जोड़ें।
    2. 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। फिर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 x 10 -4 एम CEEC समाधान के 15 μl जोड़ें। धारा 4.1 में वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।
  2. पारा (द्वितीय) का अनुपात 1: 1 की तैयारी CEEC समाधान
    1. 240 की जगह81, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच 7.5 बफर के एल। अमोनियम formate बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 X10 -4 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान के 30 μl जोड़ें।
    2. 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। फिर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 x 10 -4 एम CEEC समाधान के 30 μl जोड़ें। धारा 4.1 में वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।
  3. पारा (द्वितीय) के 2 अनुपात: 1 की तैयारी CEEC समाधान
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप, पीएच 7.5 बफर के 210 μl रखें। अमोनियम formate बफर के साथ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 X10 -4 एम पारा (द्वितीय) क्लोराइड समाधान के 30 μl जोड़ें।
    2. 10 सेकंड के लिए समाधान भंवर। फिर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7.5 x 10 -4 एम CEEC समाधान के 60 μl जोड़ें। धारा 4.1 में वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।

7. ANALYOrbitrap ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पारा (द्वितीय) और CGGC नमूने की प्रतिक्रिया मिश्रण zing

  1. ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमीटर 16 तैयारी
    1. एक 500 μl कांच सिरिंज में अंशांकन मानकों के 100 μl ड्रा।
    2. , एमएस पंप की सिरिंज पालने में सिरिंज रखें ट्यूबिंग देते हैं, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में इंजेक्षन।
    3. फ़ाइल आइकन का चयन और फ़ाइल नाम टाइप करके रन के लिए फ़ाइल नाम सेट करें।
    4. डाटा अधिग्रहण मॉड्यूल में प्राप्त डेटा बटन का चयन करें और 150 स्कैन इकट्ठा।
    5. सॉफ्टवेयर की डाटा प्रोसेसिंग मॉड्यूल खोलने के द्वारा अंशांकन मानकों की पुष्टि करने के वर्णलेख का विश्लेषण करें। मॉड्यूल को खोलें, मेनू दायर करने के लिए जाने के लिए और "खुला" का चयन करें, और संवाद बॉक्स में फ़ाइल का चयन करें। वर्णलेख में चोटियों मानकों के अनुपात को चार्ज करने के लिए बड़े पैमाने पर करने के लिए सहसंबंधी की जाँच करें।
    6. 500 μl एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल ड्राइंग द्वारा 500 μl कांच सिरिंज साफ और फिर मीटर बांटनाएक बीकर में इथेनॉल।
    7. कांच सिरिंज में HPLC ग्रेड मेथनॉल के 500 μl ड्रा और कदम 7.1.2 के अनुसार सिस्टम फ्लश।
    8. मानकों को स्थापित करने के लिए सॉफ्टवेयर की विधि सेटअप मॉड्यूल का चयन करें। स्कैन मोड मेनू का चयन और FTMS के रूप में विश्लेषक पहचान है, और फिर "ठीक" पर क्लिक करें। म्यान गैस प्रवाह की दर: 10, स्रोत तापमान: 0, केशिका वोल्टेज: 37 वी, ट्यूब लेंस: 95 वी, स्प्रे वोल्टेज: 4.20 केवी तब वास्तविक समय देखने स्पेक्ट्रम पेज पर विभिन्न माउस पर क्लिक करके, निम्नलिखित मानकों सेट , प्रवाह 10.00 μl / मिनट, विश्लेषक दर: FTMS, स्कैन की संख्या: 150।
  2. ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमीटर पर CGGC नमूने रनिंग
    1. 5 मिमी अमोनियम वह स्वरूप पीएच 7.5 बफर चलाएँ।
      1. , 500 μl कांच सिरिंज में 5 मिमी अमोनियम formate बफर के 500 μl जगह एमएस पंप की सिरिंज पालने में यह जगह है, और ट्यूबिंग देते हैं।
      2. 1-2 मिनट के लिए ट्यूबिंग के माध्यम से बफर चलाएँ।
      3. रन के लिए फ़ाइल नाम सेटफ़ाइल आइकन का चयन और फ़ाइल नाम टाइप करके।
      4. मॉड्यूल में प्राप्त डेटा बटन का चयन करें और 150 स्कैन इकट्ठा।
      5. 150 स्कैन एकत्र कर रहे हैं के बाद संग्रह को रोकने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
      6. डेटा ब्राउज़र मॉड्यूल को खोलें, फिर मेनू दायर करने के लिए जाने के लिए और "खुला" का चयन करें, और संवाद बॉक्स में फ़ाइल का चयन करें। 483, 683, 1,163 और 1,363 मी / z में कोई चोटियों पेप्टाइड या पारा (द्वितीय) -peptide परिसरों के समान है कि मौजूद हैं कि सत्यापित करें।
    2. 0.5 पारा (द्वितीय): CGGC अनुपात समाधान 1 चलाएँ।
      1. 0.5 पारा (द्वितीय): सिरिंज में नमूने के CGGC अनुपात 1 के 250 μl रखें।
      2. ट्यूबिंग, और प्रधानमंत्री तंत्र देते हैं, एमएस पंप की सिरिंज पालने में सिरिंज रखें।
      3. फ़ाइल आइकन का चयन और फ़ाइल नाम टाइप करके चलाने के लिए एक फ़ाइल नाम का चयन करें।
      4. डाटा अधिग्रहण मॉड्यूल में प्राप्त डेटा बटन दबाएं और 150 स्कैन इकट्ठा करने और संग्रह को रोकने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
      5. मॉड्यूल को खोलें, मेनू दायर करने के लिए जाने के लिए और "खुला" का चयन करें, और संवाद बॉक्स में फ़ाइल का चयन करें। वर्णलेख अकेले CGGC पेप्टाइड के लिए एक सहित चोटियों सत्यापित करें कि।
      6. 500 μl अमोनियम formate बफर के साथ aspirating और फिर एक बीकर में अमोनियम formate बफर वितरण से सिरिंज धो लें।
      7. एमएस पर कचरे बटन का चयन करें और ट्यूबिंग 500 μl अमोनियम formate बफर के साथ तीन बार फ्लश।
      8. एक बीकर में मेथनॉल वितरण तो 500 μl मेथनॉल के साथ aspirating और से सिरिंज धो लें।
      9. 500 μl मेथनॉल के साथ ट्यूबिंग एक बार फ्लश।
      10. एमएस पर चयन लोड डिटेक्टर बटन।
      11. सिरिंज के लिए अमोनियम formate बफर के 500 μl जोड़ें।
      12. ट्यूबिंग, और प्रधानमंत्री तंत्र देते हैं, एमएस पंप की सिरिंज पालने में सिरिंज रखें।
      13. फ़ाइल आइकन का चयन और फ़ाइल नाम टाइप करके चलाने के बफर के लिए एक फ़ाइल नाम का चयन करें।
      14. दबाएँअधिग्रहण डेटा बटन और 150 स्कैन इकट्ठा करने और फिर स्टॉप रन बटन पर क्लिक करें।
      15. डेटा ब्राउज़र मॉड्यूल को खोलें, मेनू दायर करने के लिए जाने के लिए और "खुला" का चयन करें, और संवाद बॉक्स में फ़ाइल का चयन करें। CGGC रन: वर्णलेख पिछले पारा से चोटियों के शून्य है की जाँच करें।
    3. 1 पारा (द्वितीय): CGGC अनुपात समाधान 1 चलाएँ।
      1. सिरिंज में CGGC अनुपात नमूना: 1 पारा (द्वितीय): 1 के 250 μl रखें।
      2. 7.2.2.15 करने के लिए कदम 7.2.2.2 के लिए वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।
    4. 2 पारा (द्वितीय): 1 भागो CGGC अनुपात समाधान
      1. सिरिंज में CGGC एकाग्रता नमूना: 2 पारा (द्वितीय): 1 के 250 μl रखें।
      2. 7.2.2.15 करने के लिए कदम 7.2.2.2 के लिए वर्णित के रूप में एक समान तरीके से दोहराएँ।

8. Orbitrap ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रतिक्रिया बुध के मिश्रण और CEEC नमूनों का विश्लेषण

  1. ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमीटर पर CEEC नमूने रनिंग
    1. दोहराएँ विश्लेषण प्रक्रिया (कदम 7.1-7.2) CEEC नमूने और विभिन्न stoichiometric अनुपात में पारा (द्वितीय) और CEEC की प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग कर।

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Representative Results

एक अध्ययन में ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा दो tetrapeptides, CGGC और CEEC (चित्रा 1) के लिए संभव पारा पेप्टाइड जटिल संरचना को चिह्नित करने के लिए प्रदर्शन किया था। CGGC या CEEC साथ पारा (द्वितीय) के परिसर में पारा का मिश्रण प्रतिक्रिया द्वारा जांच की गई (द्वितीय) और तीन अलग अलग दाढ़ अनुपात में पेप्टाइड समाधान: 1: 0.5, 1: 1, और 1: 2 ((द्वितीय) पारा: पेप्टाइड) । पारा की एकाग्रता (द्वितीय) 7.5 x 10 -6 मीटर था और पेप्टाइड एकाग्रता के हिसाब से अलग किया।

आकृति 1
चित्रा 1. Dicysteinyl पेप्टाइड संरचनाओं। Dicysteinyl tetrapeptides, CGGC और CEEC की रासायनिक संरचना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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पारा के चित्रा 2. ईएसआई एमएस (द्वितीय) और एक, अमोनियम formate बफर में 2 + पारा बदलती युक्त पीएच 7.5 7.5 x 10 -6 एम पारा 2 + युक्त समाधान से CGGC electrospray आयनीकरण Orbitrap जन स्पेक्ट्रा: CGGC stoichiometric अनुपात:। (ए ) 1: 0.5 अनुपात, (बी) 1: 1 के अनुपात, और (सी) 1: 2 के अनुपात। Insets संकेत पारा पेप्टाइड परिसरों का पारा समस्थानिक पैटर्न दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ईएसआई पारा के एमएस (द्वितीय) और CEEC। से electrospray आयनीकरण Orbitrap जन स्पेक्ट्राअमोनियम formate बफर में पीएच 2 + पारा बदलती युक्त 7.5 7.5 x 10 -6 एम पारा 2 + युक्त समाधान: CEEC stoichiometric अनुपात: (ए) 1: 0.5 अनुपात, (बी) 1: 1 के अनुपात, और (सी) 1 : 2 के अनुपात। Insets संकेत पारा पेप्टाइड परिसरों का पारा समस्थानिक पैटर्न दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Electrospray आयनीकरण Orbitrap बड़े पैमाने पर chromatograms (द्वितीय) stoichiometric अनुपात पेप्टाइड विभिन्न पारा पर CGGC (चित्रा 2) और CEEC साथ पारा (द्वितीय) मिश्रता (चित्रा 3) के लिए एकत्र किए गए थे (1: 0.5, 1: 1, और 1: 2)। मनाया पारा पेप्टाइड जटिल प्रकार परिसर में पारा आयनों की संख्या के साथ ही depro की संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है जो अलग पारा समस्थानिक चोटियों (insets), दिखानेtonations। उदाहरण के लिए, चित्रा 1 बी इनसेट पारा के सात मुख्य स्वाभाविक रूप से होती आइसोटोप से मेल खाती है जो पेप्टाइड पारा अभिवर्तन में पारा समस्थानिक हस्ताक्षर, पता चलता है: 196 पारा (0.146%), 198 पारा (10.02%), 199 पारा (16.84%) , कोष्ठक में दिए प्रतिशत प्राकृतिक abundances के साथ 200 पारा (23.13%), 201 पारा (13.22%), 202 पारा (29.80%), 204 पारा (6.85%),। दो प्रमुख आइसोटोप 200 पारा और 202 पारा 2.3 की एक अलग रिश्तेदार तीव्रता अनुपात दिखाने: 3। तदनुसार इस एक पारा आइसोटोप क्लस्टर की सबसे तीव्र समस्थानिक शिखर अभिवर्तन (मी / z = 539) के लिए monoisotopic द्रव्यमान का गठन किया। यह एक दो समन्वय के लिए फार्म का दो cysteinyl thiols की deprotonation द्वारा बनाई है, जो जटिल, [(CGGC-2H + पारा) + एच] + अभिवर्तन के साथ संबद्ध है। इस प्रकार इस विश्लेषण किया जाता है:

[(CGGC-2H + पारा) + एच] के लिए + मी / z मूल्य equ है(- 2 + 202 1 338) = 539 के लिए अल।

चित्रा 1 ए इनसेट [(2CGGC-4H + 2HG) + एच] + (चित्रा 4) के लिए Chemcal कार्यक्रम का उपयोग करके गणना के रूप में एक दो पारा जटिल से मेल खाती है जो पेप्टाइड पारा अभिवर्तन में पारा समस्थानिक हस्ताक्षर से पता चलता है। सैद्धांतिक protonated monoisotopic द्रव्यमान की गणना समस्थानिक क्लस्टर में नौवें समस्थानिक चोटी है जो 1077.061 की एक मी / z मूल्य से मेल खाती है। चित्रा 1 ए इनसेट भी नौवें शिखर है जो 1,077.1 की एक मी / z मूल्य, को इसी एक समस्थानिक शिखर से पता चलता है मनाया समस्थानिक क्लस्टर में। इसलिए, इस समस्थानिक क्लस्टर के लिए प्रारंभिक अभिवर्तन [(2CGGC-4H + 2HG) + एच] + के लिए सौंपा जा सकता है।

चित्रा 4
[(2CGGC-4H + 2HG) + एच] के लिए चित्रा 4. सैद्धांतिक समस्थानिक पैटर्न + समर्थन>। [(2CGGC-4H + 2HG) + एच] + के लिए सैद्धांतिक समस्थानिक पैटर्न Chemcal कार्यक्रम का उपयोग करके गणना के रूप में। तीर monoisotopic शिखर इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. Cationized adducts। पारा पेप्टाइड परिसरों के साथ जुड़े कुछ cationized सोडियम और पोटेशियम adducts। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 CGGC द्वारा गठित पारा पेप्टाइड परिसरों के साथ जुड़े कुछ cationized सोडियम और पोटेशियम adducts से पता चलता है। Sodiated adducts 22 जन इकाइयों बड़ा टी रहे हैंहान पोटेशियम adducts 38 जन इकाइयों में बड़े होते हैं, जबकि protonated पारा CGGC परिसरों इसी। प्रमुख protonated CGGC डिमर (मी / z = 677) भी cationized सोडियम के साथ प्रजातियों (मी / z = 699) और पोटेशियम आयनों रूपों (मी / z = 715)। यह आगे protonated या cationized adducts के लिए दो जन इकाइयों की कमी के परिणामस्वरूप होता है जो disulfides के लिए फार्म का cysteinyl thiol समूहों के ऑक्सीकरण, बिना CGGC dimers के गठन की पुष्टि करता है।

चित्रा 6
चित्रा 6 ओवरलैपिंग एक और दो ​​के प्रभारी राज्यों। पारा पेप्टाइड आयनों [(CEEC-4H + 2HG) + एच] के साथ + 1 और 2 के प्रभारी राज्यों में जुड़े ओवरलैपिंग चोटियों। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।

[(CEEC-4H + 2HG) + एच] +। [(CEEC-4H + 2HG) + एच] के लिए सैद्धांतिक समस्थानिक पैटर्न के लिए 7 चित्रा सैद्धांतिक समस्थानिक पैटर्न + Chemcal कार्यक्रम का उपयोग करके गणना के रूप में। तीर monoisotopic शिखर इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक और दो ​​आरोप में पारा CEEC adducts के साथ जुड़े चोटियों ओवरलैपिंग 6 से पता चलता है। इसके लिए गणना के रूप में एक दो पारा परिसर के साथ समझौते में है पारा पेप्टाइड आयनों [(CEEC-4H + 2HG) + एच] के साथ + 1 के प्रभारी और 883 इस का एक मी / z मूल्य में जुड़े रहे हैं कि समस्थानिक चोटियों से पता चलता है [(CEEC-4H + 2HG) + एच] Chemcal कार्यक्रम (चित्रा 7) का उपयोग करके +। सैद्धांतिक protonated monoisotopicबड़े पैमाने पर 883.032 की एक मी / z मूल्य से मेल खाती है।

883.03 के एक monoisotopic चोटी के साथ ऊपर मनाया [(CEEC-4H + 2HG) + एच] + अभिवर्तन एक अतिरिक्त 0.5 जन इकाइयों दिखा इसी चोटियों से युक्त एक और अभिवर्तन के साथ ओवरलैप। Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमेट्री साधन के द्वारा प्राप्त अत्यंत उच्च संकल्प के साथ, यह इन ओवरलैपिंग चोटियों 2 के आरोप के साथ adducts के अनुरूप हैं कि माने जा सकते हैं। तदनुसार, के monoisotopic बड़े पैमाने पर ओवरलैपिंग जटिल प्रकार के रूप में गणना की जा सकती आयनित जा रहा है। 8 समस्थानिक चोटियों के बीच मी / z अंतर 0.5 है और उन दोनों के बीच बड़े पैमाने पर अंतर 1 एएमयू है कि पता चलता है। इसलिए, प्रभारी राज्य 2 है। पारा पेप्टाइड परिसर के द्रव्यमान की गणना करने के लिए, monoisotopic शिखर के लिए मी / z प्रभारी राज्य से गुणा, और सकारात्मक आरोप लगाया जटिल आयन बनाया है, जो दो प्रोटॉन के द्रव्यमान से घटाया जाता है।

2 अभिवर्तन के लिए गणना:

समस्थानिक चोटियों के बीच मी / z अंतर 0.5 है

समस्थानिक चोटियों के बीच मास का अंतर है 1 एएमयू (1 न्यूट्रॉन)

0.5 = 2 से जेड = 1 डिवाइड

protonated monoisotopic शिखर के लिए मी / z (883.53 एक्स 2) - 2 = 1,765.06

protonated monoisotopic शिखर, [(2CEEC-8H + 4Hg) + एच] +, के लिए ऊपर मी / z मूल्य 1765.056 (चित्रा 8) के रूप में Chemcal कार्यक्रम द्वारा गणना के रूप में सैद्धांतिक मूल्य के अनुरूप है।

आंकड़ा 8
8 चित्रा। सैद्धांतिकChemcal कार्यक्रम का उपयोग करके गणना के रूप में [(2CEEC-8H + 4Hg) + एच] +। [(2CEEC-8H + 4Hg) + एच] के लिए सैद्धांतिक समस्थानिक पैटर्न + के लिए समस्थानिक पैटर्न। तीर monoisotopic शिखर इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक ईएसआई Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ पारा पेप्टाइड परिसरों का विश्लेषण करने का लाभ ऊपर दिखाए गए के रूप में हर आयन के आरोप आसानी से आवंटित किया जा सकता है। बुनियादी अमीनो टर्मिनस युक्त पेप्टाइड्स आसानी से सकारात्मक आरोप स्थिर कर सकते हैं। ऐसे Orbitrap, अधिक से अधिक एक प्रभारी के साथ पेप्टाइड आयनों के प्रभारी राज्य के रूप में electrospray आयनीकरण और एक उच्च संकल्प जन विश्लेषक का उपयोग करते समय चुना गया और अधिक आसानी से जन विश्लेषक iontrap कम संकल्प की तुलना की जा सकती है।

(चित्रा 3 ए और चित्रा 6) के साथ जुड़े अतिव्यापी चोटियों भी मिलकर एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया। इसे प्राप्त संकेतों के रूप में ऊपर चर्चा की उम्मीद है और परिसर के हैं, और पारा-से-पेप्टाइड अनुपात की उच्च सांद्रता में गठित कलाकृतियों क्लस्टर नहीं कर रहे हैं जो संकेत दिया कि किसी भी एमएस एमएस विखंडन, नहीं दिखा था।

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Discussion

हाइड्रोफोबिक dicysteinyl tetrapeptide CGGC (सी 10 एच 18 एन 4 हे 5 एस 2; मेगावाट = 338) (चित्रा 1), पारा साथ परिसरों रूपों (द्वितीय) चित्रा 2 में दिखाया गया है और तालिका 1 इसके अतिरिक्त, यह पेप्टाइड dimers और trimers रूपों के रूप में। संवर्द्धित प्रतिक्रिया मिश्रण में पेप्टाइड बढ़ जाती है की राशि के रूप में। मी / z जुड़े dimers के मूल्यों [(2 एम + एच) + = 677] और trimers द्वारा दिखाया गया है [(3M + एच) + = 1015], CGGC की thiol समूहों प्रयोगात्मक शर्तों के तहत disulfides फार्म के लिए oxidize नहीं था । इन जुड़े CGGC प्रजातियों के गठन इस tetrapeptide की hydrophobicity के कारण हो सकता है। 1 पारा (द्वितीय): पेप्टाइड और 1: (द्वितीय) :( पेप्टाइड 2 पारा) पहले dicysteinyl tripeptides 7 के लिए सूचना के रूप में 2 परिसरों CGGC 1 के लिए इसी पारा साथ परिसरों के दो प्रकार के रूपों। हालांकि, अतिरिक्त या समकक्ष पारा (द्वितीय) की उपस्थिति में, यह भी foआरएमएस एक 2: 2 [पारा (द्वितीय)] 2: (पेप्टाइड) 2 जटिल।

Carboxylated dicysteinyl tetrapeptide CEEC (सी 16 एच 26 एन 4 हे 9 एस 2; मेगावाट = 482) पारा के साथ (चित्रा 1) फॉर्म परिसरों (द्वितीय) में 3 चित्र में दिखाया गया है और तालिका 1 यह रूप में आसानी के रूप CEEC dimers फार्म नहीं था के रूप में। कि अधिक हाइड्रोफोबिक CGGC के लिए निरीक्षण करते हैं। 1 पारा (द्वितीय): पेप्टाइड और 1: 2 पारा (द्वितीय) :( पेप्टाइड) 2 परिसरों CGGC करने के लिए तुलनीय है, यह पारा 1 के लिए इसी के साथ परिसरों का निर्माण करती है। 2 [पारा (द्वितीय)] 2: (पेप्टाइड) और अधिक आसानी से 2 जटिल हालांकि, सहायक कार्बोक्सिलेट समूहों के साथ, यह दो रूपों। 1 [पारा (द्वितीय)] 2: जटिल पेप्टाइड और 4: इसके अलावा, अतिरिक्त पारा में, यह 2 रूपों 2 [पारा (द्वितीय)] 4: CGGC के लिए मनाया नहीं गया है, जो (पेप्टाइड) 2 पेप्टाइड जटिल,।

परिसरों च के लिए मनाया संकेतों के सारांशORMED मी / z मूल्यों तालिका 1 में दिखाया जाता है के रूप में।

तालिका एक

टेबल पारा पेप्टाइड परिसरों संकेतों के 1. सारांश। अमोनियम formate बफर, 7.5 पीएच में LTQ / Orbitrap एमएस chromatograms में बुध-पेप्टाइड परिसरों का संकेत है।

पेप्टाइड के साथ ही dicysteinyl tetrapeptide में सहायक बाध्यकारी समूहों की उपस्थिति: हम पारा (द्वितीय) और दो dicysteinyl tetrapeptides की प्रतिक्रिया पारा (द्वितीय) की प्रारंभिक अनुपात पर निर्भर कर रहे हैं कि परिसरों कि फार्म का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, निर्दिष्ट electrospray आयनीकरण की शर्तों के तहत गठित परिसरों में पारा और पेप्टाइड का सटीक stoichiometry अलग पारा समस्थानिक वितरण पैटर्न के आधार पर उच्च संकल्प ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।

Cysteinyl pept प्रतिक्रिया मेंपारा (द्वितीय) के साथ इडस, सावधानियों डाइसल्फ़ाइड बांड फार्म cysteinyl thiol समूहों के ऑक्सीकरण रोकने के लिए लिया जाना चाहिए। वर्णित प्रोटोकॉल के भीतर, बफर समाधान ध्यान से degassed थे और आर्गन के तहत संग्रहीत। इसके अलावा, सभी प्रतिक्रिया नमूने तुरंत ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण से पहले तैयार कर रहे हैं।

दो tetrapeptides, CEEC और CGGC के बीच घुलनशीलता में मतभेद के कारण, विभिन्न सांद्रता स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया। CGGC पेप्टाइड के फ्रीजर शेयर acetonitrile से गीला हो गया था और आसानी से 5 मिमी अमोनियम formate बफर, एक 7.5 x 10 -4 एम CGGC समाधान का उत्पादन करने के लिए पीएच 7.5 से पीछा भंग कर दिया गया। CEEC, एक कम एकाग्रता में तैयार किया गया था 7.5 x 10 -5 एम, पारा करने से पहले (द्वितीय): क्योंकि इसकी कम घुलनशीलता की पेप्टाइड प्रतिक्रिया मिश्रण कदम। पारा विश्लेषण करने के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने (द्वितीय) परिसरों क्योंकि पेप्टाइड की और अनुमति देने के लिए घुलनशीलता के 10 -5 एम होना माना गया थामास स्पेक्ट्रोमीटर में अवशेषों को हटाने के लिए। CGGC समाधान के लिए अनुबंध में, CEEC अवशेषों कभार ट्यूबिंग प्रतिस्थापन जरूरी है जो ट्यूबिंग, का पालन करें।

पारा पेप्टाइड परिसरों के विश्लेषण के लिए ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने का महत्व analytes की अपने नरम आयनीकरण में निहित है। यह नगण्य विखंडन के साथ आणविक आयनों के विश्लेषण की सुविधा। इस काम में दिखाया गया है, यह हस्ताक्षर पारा समस्थानिक वितरण पैटर्न के आधार पर पारा पेप्टाइड परिसरों के stoichiometries चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एक अस्थिर बफर सिस्टम ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए आवश्यक है। इस विघटन के लिए कम अस्थिर सॉल्वैंट्स या बफरिंग मीडिया की आवश्यकता है कि analytes की पहचान करने के लिए अपने व्यावहारिक उपयोग को सीमित कर सकता है।

हम पहले 7.8 उल्लेख किया है, ईएसआई मास स्पेक्ट्रोमेट्री पारा और pept के stoichiometry का सही निर्धारण के लिए एक संवेदनशील विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करता हैनिर्दिष्ट electrospray आयनीकरण शर्त के तहत पारा पेप्टाइड परिसरों में आईडीई। हालांकि, यह अतिरिक्त तरीकों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है (उदाहरण के लिए, 1 एच, 13 सी, 199 पारा एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, बढ़ाया एक्स-रे अवशोषण ठीक संरचना, या potentiometry 17-18) परिसरों की सामग्री में से एक अधिक सटीक दृढ़ संकल्प प्रदान करने के लिए समाधान।

हम एक Orbitrap जन विश्लेषक के साथ ईएसआई पारा पेप्टाइड परिसरों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पता चला है। हम इस तकनीक को अन्य धातु आयनों और विभिन्न छोटे यौगिकों के साथ उनके परिसरों के विश्लेषण की ओर लागू किया जा सकता है कि उम्मीद है। यह अलग समस्थानिक रूपों में मौजूद कर सकते हैं कि अन्य धातु आयनों द्वारा गठित परिसरों का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा।

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Acknowledgments

एम.एन.-एस के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से समर्थन मानता है, रुई लेखकों कृतज्ञता थर्मो फिशर साइंटिफिक LTQ Orbitrap एक्स्ट्रा लार्ज मास स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग के लिए ग्रीन्सबोरो में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में तीनों मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा स्वीकार करते हैं चे 1011859. अनुदान। लेखकों के लिए इस काम के बारे में उपयोगी सुझावों और टिप्पणियों के लिए ग्रीन्सबोरो में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय में डैनियल टोड, विन्सेन्ट सिका, और Brandie Erhmann धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

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रसायन विज्ञान अंक 107 बुध-पेप्टाइड परिसरों पारा समस्थानिक चोटियों मास स्पेक्ट्रोमेट्री ईएसआई एमएस cysteinyl पेप्टाइड्स
Electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा Dicysteinyl Tetrapeptides साथ पारा (द्वितीय) की Complexation का एक अध्ययन
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Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

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