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Chemistry

전자 분무 이온화 질량 분석에 의해 Dicysteinyl Tetrapeptides와 수은 (II)의 복합체 형성에 관한 연구

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하시기 바랍니다. 염화 수은은 독성 화학 물질이다. IT와 관련된 모든 솔루션을 전달하는 경우 개인 보호 장비 (장갑, 보안경 및 실험실 코트)를 착용해야합니다. 중금속 지정된 명확하게 표시 화학 폐기물 병에 솔루션을 폐기하십시오.

1. 준비 5 mM의 탈기 암모늄 편대 버퍼, pH가 7.5

  1. HPLC 등급의 물 450 ㎖에 포름산 암모늄 완충액 0.1576 g을 녹인다. 1 M 포름산 7.5에 1 M 수산화 암모늄으로 상기 용액의 pH를 조정한다. 500㎖의 메스 플라스크에이 용액을 전송 및 5mM의 포름산 암모늄 용액을 만들기 위해 검량선을 HPLC 물을 추가한다.
  2. 아르곤으로 10 분, 퍼지 용 진공 하에서 5mM의 포름산 암모늄 버퍼를 탈기. 두 번 반복 아르곤하에 저장 솔루션입니다. 사용 당일에, 0.2 마이크론 필터 befor를 통해 완충액을 필터E 사용.

수은 (II) 염화물 솔루션 2. 준비

  1. 0.2375 g의 수은 (II) 클로라이드를 달다. 0.035 M 수은 (II) 클로라이드 용액을 제조 5 mM의 포름산 암모늄 완충액 25 ㎖에 용해.
  2. 7.5 X 10-4 M 용액을 만들 9.785 ㎖의 5 mM로 포름산 암모늄 버퍼에 0.214 ㎖의 0.035 M 수은 (II) 클로라이드 용액을 첨가한다. 아르곤 가스로 7.5 X 10-4 M 수은 (II) 용액 담요.

CGGC 원액 3. 준비

  1. HPLC 등급 아세토 니트릴 0.118 ㎖ 중의 dicysteinyl의 테트라, CGGC 2.0 밀리그램을 용해하고 1.0647 ​​㎖의 5 mM의 암모늄 포르 메이트, pH를 5 mM의 CGGC 스톡 용액을 수득 아르곤으로 탈기 한 7.5 완충액 추가.
  2. 5 mM의 암모늄 형성의 pH 1,275 μL에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션을 제공하는 7.5 버퍼를 5 밀리미터 CGGC 주식 솔루션의 225 μl를 추가합니다.

4. 준비수은 (II) 및 CGGC 다양한 반응 혼합물

  1. (1)의 제조 : 0.5 비율의 수은 (II) 용액 CGGC
    1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 255 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다.
    2. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 마이크로 원심에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션의 15 μl를 추가합니다. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 용액은 질량 분석기로 주입 전에 10 분 동안 방치하자.
  2. 수은의 비율이 1 (II) : 1의 제조 CGGC 용액
    1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 240 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다.
    2. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그때1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션의 30 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다.
  3. 수은의 비율이 2 (II) : 1의 제조 CGGC 용액
    1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 210 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다.
    2. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션의 60 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다.

CEEC 원액 5. 준비

  1. 펩티드를 용해 HPLC 등급 아세토 니트릴 0.145 ㎖ 중의 dicysteinyl의 테트라, CEEC 3.5 밀리그램을 용해. 이어서 13.067 ㎖의 5 mM의 암모늄 포르 메이트의 추가, pH는 아르곤으로 탈기 된 완충액 7.5 0.5 m를 제조M CEEC 솔루션입니다.
  2. 모든 펩타이드가 용해 될 때까지 용액을 소용돌이. 7.5 × 10 -5 M CEEC 솔루션을 제공하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에, pH가 7.5 버퍼를 CEEC 솔루션 1.125 ml의 0.5 mm의 추가 0.375 ml의 5 ㎜의 포름산 암모늄. 소용돌이 혼합 때까지.

수은 (II) 및 CEEC 솔루션의 다양한 반응 혼합물의 제조 6

  1. (1)의 제조 : 수은 (II)의 비율이 0.5 : CEEC 용액
    1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 255 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다.
    2. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CEEC 솔루션의 15 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다.
  2. 수은 (II)의 1의 비율 : 1의 제조 CEEC 솔루션
    1. (240)를 배치81; 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 5 mM의 암모늄 포르 메이트, pH가 7.5 완충액 L. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다.
    2. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CEEC 솔루션의 30 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다.
  3. 수은 (II)의 비율이 2 : 1의 제조 CEEC 용액
    1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 210 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다.
    2. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CEEC 솔루션의 60 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다.

7. AnalyOrbitrap ESI 질량 분광기 수은 (II) 및 CGGC 샘플의 반응 혼합물 쌩쌩

  1. ESI 질량 분석기 (16)을 준비
    1. 500 μL 유리 주사기로 교정 표준 100 μL를 그린다.
    2. , MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓고 튜브를 부착하고, 질량 분광 광도계에 주입.
    3. 파일 아이콘을 선택하고, 파일 이름을 입력하여 실행을 위해 파일 이름을 설정한다.
    4. 데이터 수집 모듈에서 획득 데이터 버튼을 선택하고 150 스캔을 수집합니다.
    5. 소프트웨어의 데이터 처리 모듈을 열어 교정 기준을 확인하기 위해 크로마토 그램을 분석한다. 모듈을 열고 메뉴를 파일로 이동하여 "열기"를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 크로마토 그램의 피크가 표준 비율을 충전 질량에 상관 관계가 있는지 확인합니다.
    6. 500 μL를 HPLC 등급 메탄올을 그려 500 μL 유리 주사기를 청소하고 다음 m를 분배비이커에 에탄올.
    7. 유리 주사기에 HPLC 등급 메탄올 500 μL를 그려 단계 7.1.2에 따라 시스템을 세척하십시오.
    8. 매개 변수를 설정하기위한 방법의 소프트웨어 설정 모듈을 선택한다. 스캔 모드 메뉴를 선택하고 FTMS와 분석기를 식별 한 후 "확인"을 클릭합니다. 시스 가스 유량 : 10, 소스 온도 : 0, 모세관 전압 : 37 V 튜브 렌즈 : 95 V, 분무 전압 : 4.20 kV로 다음 실시간보기 스펙트럼 페이지에 다양한 아이콘을 클릭하면, 다음과 같은 파라미터를 설정할 , 흐름은 10.00 μL / 분, 분석 평가 : FTMS, 검색 수 : 150.
  2. ESI 질량 분석기에 CGGC 샘플 러닝
    1. 5 mM의 포름산 암모늄의 pH 7.5 버퍼를 실행합니다.
      1. , 500 μL 유리 주사기에 5 mM의 포름산 암모늄 버퍼의 500 μl를 놓고 MS 펌프의 주사기 크래들에 배치하고, 튜브를 연결합니다.
      2. 1 ~ 2 분 동안 튜브를 통해 버퍼를 실행합니다.
      3. 실행의 파일 이름을 설정파일 아이콘을 선택하고, 파일 이름을 입력하여.
      4. 모듈에서 획득 데이터 버튼을 선택하고 150 스캔을 수집합니다.
      5. 150 스캔이 수집 한 후 수집을 중지하려면 실행 버튼을 클릭합니다.
      6. 데이터 브라우저 모듈을 연 다음 파일 (File) 메뉴로 이동하여 "열기"를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 483, 683, 1163 및 1,363m / Z에서 더 피크가 펩타이드 또는 수은 (II) -peptide 단지를 닮은 그 존재하지 않는 것을 확인합니다.
    2. 0.5 수은 (II) : CGGC 비율 솔루션 (1)을 실행합니다.
      1. 0.5 수은 (II) : 주사기로 시료의 CGGC 비율 1의 250 μl를 놓습니다.
      2. 튜브 및 주요 장치를 부착, MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓습니다.
      3. 파일 아이콘을 선택하고 파일 이름을 입력하여 실행 파일 이름을 선택합니다.
      4. 데이터 수집 모듈에서 획득 데이터 버튼을 눌러 150 스캔을 수집하고 수집을 중지하려면 실행 버튼을 클릭합니다.
      5. 모듈을 열고 메뉴를 파일로 이동하여 "열기"를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 크로마토 그램 혼자 CGGC 펩타이드에 대한 것을 포함하여 피크가 포함되어 있는지 확인합니다.
      6. 500 μL 포름산 암모늄 완충액으로 흡인하고 비이커에 포름산 암모늄 버퍼를 분배하여 주사기 씻는다.
      7. MS의 폐기물 버튼을 선택하고 튜브 500 μL 포름산 암모늄 버퍼로 3 회 세척하십시오.
      8. 비이커에 메탄올을 분배 한 후 500 ㎕를 메탄올로 흡입에 의해 주사기를 씻으십시오.
      9. 500 μL 메탄올 튜브를 한 번 플래시합니다.
      10. MS에로드를 선택 검출기 버튼을 누릅니다.
      11. 주사기에 포름산 암모늄 버퍼의 500 μl를 추가합니다.
      12. 튜브 및 주요 장치를 부착, MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓습니다.
      13. 파일 아이콘을 선택하고, 파일 이름을 입력하여 실행하는 상기 버퍼의 파일 이름을 선택한다.
      14. 프레스취득 데이터 버튼을 누르고 150 스캔을 수집 한 다음 정지 실행 버튼을 클릭합니다.
      15. 데이터 브라우저 모듈을 열고 메뉴를 파일로 이동하여 "열기"를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. CGGC 실행 : 크로마토 그램 이전 수은에서 피크의 무효 확인합니다.
    3. 1 수은 (II) : CGGC 비율 솔루션 (1)을 실행합니다.
      1. 주사기에 CGGC 비율 샘플 : 1 수은 (II) : 1 250 μl를 놓습니다.
      2. 7.2.2.15 스텝 7.2.2.2에 기재 한 것과 유사한 방식으로 반복한다.
    4. 2 수은 (II) : 1을 실행 CGGC 비율 솔루션
      1. 주사기에 CGGC 농도 샘플 : 2 수은 (II) : 1 250 μl를 놓습니다.
      2. 7.2.2.15 스텝 7.2.2.2에 기재 한 것과 유사한 방식으로 반복한다.

8. Orbitrap ESI 질량 분석에 의해 반응 혼합물 및 수성 CEEC 샘플 분석

  1. ESI 질량 분석기에 시료를 실행 CEEC
    1. 반복 분석 절차 (단계 7.1-7.2) CEEC 샘플 및 다양한 화학 양론 비로 수은 (II) 및 CEEC의 반응 혼합물을 사용.

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Representative Results

연구는 ESI 질량 분석에 의해 두 tetrapeptides, CGGC 및 CEEC (그림 1)에 사용할 수있는 수은 펩타이드 복합 성분의 특성을 실시 하였다. CGGC 또는 CEEC 수은 (II) 착물은 수은의 혼합물의 반응에 의해 조사 하였다 (II) 및 세 개의 다른 몰비에서 펩티드 용액 : 1 : 0.5, 1 : 1 및 1 : 2 ((II) 수은 : 펩티드) . 수은의 농도 (II)는 7.5 × 10 -6 M이고 펩티드 농도는 그에 따라 변할.

그림 1
그림 1. Dicysteinyl 펩타이드 구조. dicysteinyl의 tetrapeptides, CGGC 및 CEEC의 화학 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "천만에 그림 2
수은도 2 ESI MS (II)와, 포름산 암모늄 완충액 2+ 수은 변화 함유 pH를 7.5 7.5 X 10-6 M 수은 2+ 함유 용액으로부터 CGGC 전자 분무 이온화 orbitrap 질량 스펙트럼 : CGGC 화학량 론적 비율 :. (A ) 1 : 0.5 비율, (B) 1 : 1의 비율, 및 (C) 1 : 2의 비율. 세트가 지정된 수은 펩타이드 복합체의 수은 동위 원소 패턴을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. ESI 수은의 MS (II) 및 CEEC. 에서 전기 분무 이온화 orbitrap 질량 스펙트럼포름산 암모늄 버퍼 pH가 2+ 수은 가변 함유 7.5 7.5 X 10-6 M 수은 2+ 함유 용액 : CEEC 화학량 론적 비율 : (A) 1 : 0.5 비율, (B) 1 : 1의 비율, 및 (C) (1) : 2 비율. 세트가 지정된 수은 펩타이드 복합체의 수은 동위 원소 패턴을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전기 분무 이온화 orbitrap 질량 크로마토 그램 (II) 화학 양론 비 펩티드 다양한 머큐리 CGGC (도 2)과 CEEC 수은 (II) 착물 (도 3)를 위해 수집 하였다 (1 : 0.5, 1 : 1 및 1 : 2). 관찰 수은 펩티드 복잡한 유형은 복잡한 수은 이온의 개수뿐만 아니라 depro의 수를 결정하는데 사용되는 별개의 동위 원소 수은 피크 (세트)를 보여tonations. 예를 들어, 그림 1b 인세는 수은의 일곱 주요 자연적으로 발생하는 동위 원소에 해당하는 펩타이드 수은 부가 물에 수은 동위 원소의 서명을 보여줍니다 196 수은 (0.146 %), 198 수은 (10.02 %), 199 수은을 (16.84 %) , 괄호 안의 %의 자연 존재비 200 수은 (23.13 %), (201) 수은 (13.22 %), (202) 수은 (29.80 %), (204) 수은 (6.85 %). 두 가지 동위 원소 200 수은, 202 수은은 2.3 별개의 상대 강도 비율을 보여 3. 따라서 이와 수은 동위체 클러스터의 가장 강한 피크가 동위 부가 (m / z = 539)를위한 모노 이소 ​​토픽 질량을 구성한다. 그것은 두 개의 좌표 형성하는 두 시스 테닐 티올의 탈 양성자 화에 의해 형성되는 착체 [(CGGC-2H +에 Hg) + H] + 부가 물과 상관. 이는 다음과 같이 해석된다 :

[(CGGC-2H + 수은) + H] +에 대한 M / Z 값은 EQU입니다(- 2 + 202 + 1 338) = 539에 알.

도 1a의 인셋은 [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (도 4)에 대한 ChemCal 프로그램을 사용하여 계산 된 두 수은 착체에 해당 펩티드 - 수은 부가 물에 수은 동위 원소 기호를 나타낸다. 이론적 양성자 화 된 모노 이소 토픽 질량이 계산 동위 클러스터 아홉째 동위 피크는 1077.061의 m / z 값에 대응한다.도 1a 인세는 아홉 번째 피크 1077.1의 m / z 값에 대응하는 동위 원소의 피크를 나타낸다 관찰 된 동위 원소 클러스터. 따라서,이 동위 원소 클러스터에 대한 발신 부가 물 [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] +에 대해 할당 될 수있다.

그림 4
[(2CGGC-4H + 2Hg) + H] 그림 4. 이론 동위 원소 패턴 + SUP>. (2CGGC-4H + 2Hg) + H] +에 대한 이론적 인 동위 원소 패턴 ChemCal 프로그램을 사용하여 계산. 화살표는 모노 이소 토픽 피크를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 양이온 부가 물. 수은 펩타이드 복합체와 관련된 일부 양이온 나트륨과 칼륨 부가 물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5는 CGGC 형성 수은 - 펩타이드 복합체와 관련된 일부 양이온 화 나트륨 및 칼륨 부가 물을 나타낸다. Sodiated 부가 물 22 질량 단위 큰 T입니다한강은 칼륨 부가 물 38 질량 단위가 큰 반면, 양성자 수은 CGGC 단지 해당. 지배적 인 양성자 CGGC 이량 체 (M / Z = 677)도 양이온 나트륨과 종 (M / Z = 699)과 칼륨 이온을 형성한다 (M / Z = 715). 이것은 상기 양성자 화 또는 양이온 화 된 부가 물을위한 두 질량 단위 감소 이어질 것이다 이황화물을 형성 시스 테닐 티올 기의 산화없이 CGGC 이합체의 형성을 확인한다.

그림 6
그림 6. 중복 +1이 충전 상태. 수은 펩타이드 이온 [(CEEC-4H + 2Hg) + H]와 + 1 및 2 충전 상태에 관련된 중복 봉우리. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.

"그림 [(CEEC-4H + 2Hg) + H] +. [(CEEC-4H + 2Hg) + H]에 대한 이론적 인 동위 원소 패턴을도 7 이론적 동위 원소 패턴 + ChemCal 프로그램을 사용하여 계산. 화살표는 모노 이소 토픽 피크를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1과 2 담당 수은 CEEC 부가 물과 관련된 피크를 겹쳐 6은 그림. 그것은 계산으로 두 수은 복잡와 일치한다 수은 펩타이드 이온 [(CEEC-4H + 2Hg) + H]와 + 1 충전 및 883이의 M / Z 값에 연관되어 동위 원소 피크를 보여줍니다 [(CEEC-4H + 2Hg) + H] ChemCal 프로그램 (도 7)를 사용하여 +. 이론적 양성자 모노 이소 ​​토픽질량은 883.032의 M / Z 값에 해당합니다.

883.03의 모노 아이소 토픽 피크와 상기 관찰 [(CEEC-4H + 2Hg) + H] + 부가 물 0.5 질량 부가 단위를 나타내는 대응하는 피크를 포함하는 다른 부가 물과 중첩. orbitrap 질량 분석 기기에 의해 달성되는 매우 높은 해상도로, 이들 겹치는 피크 +2의 전하로 부가 물에 대응한다고 가정 할 수있다. 따라서, 모노 이소 토픽 질량의 복잡한 중첩 다음과 같이 계산 될 수있다 이온화된다. 8 동위 피크 사이의 m / z 차는 0.5이고, 그들 사이의 질량의 차이는 1 AMU임을 보여준다. 그러므로, 충전 상태가 +2이다. 수은 - 펩타이드 복합체의 질량을 계산하는, 모노 아이소 토픽 피크에 대한 m / z는 충전 상태를 곱한 값, 및 양전하를 띤 이온 착물을 만든 두 양성자의 질량으로부터 감산된다.

"1">이 부가 물에 대한 계산 :

동위 원소 피크 사이의 M / Z의 차이는 0.5

동위 피크 사이의 질량 차이 인 1 AMU (1 중성자)

0.5 = 2에 의해 Z는 = 1 분할

양성자 모노 이소 토픽 피크에 대한 M / Z는 (883.53 × 2)입니다 - 2 = 1765.06

양성자 화 된 모노 이소 토픽 피크 [(2CEEC-8H 4Hg +) + H] +에 대한 상기 m / z 값은 1765.056 (도 8)로 ChemCal 프로그램에 의해 계산 된 이론 값과 일치한다.

그림 8
그림 8. 이론적ChemCal 프로그램을 사용하여 계산 된 [(2CEEC-8H 4Hg +) + H] +. [(2CEEC-8H 4Hg +) + H]에 대한 이론적 인 동위 원소 패턴 +에 대한 동위 원소 패턴. 화살표는 모노 이소 토픽 피크를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

ESI 질량 분광계 orbitrap 수은 - 펩타이드 복합체를 분석의 장점은 전술 한 바와 같이 각 이온의 전하가 용이하게 할당 될 수 있다는 것이다. 기본 아미노 - 말단을 포함하는 펩타이드 쉽게 양전하를 안정화 할 수 있습니다. 이러한 orbitrap 이상, +1 전하를 가진 펩타이드 이온의 전하 상태로 전기 분무 이온화, 고분해능 질량 분석기를 사용하여 측정하면 더욱 용이 질량 분석기 iontrap 낮은 해상도에 비교 될 수있다.

(도 3a 및도 6)과 연관된 중복 피크는 탠덤 MS로 분석 하였다. 이 얻어진 신호는 상술 한 바와 같이 기대 화합물에 속하는, 수은 대 비율보다 높은 펩티드 농도에서 형성된 생성물 클러스터되지 않은 것으로 표시된 임의의 MS-MS 단편화를 나타내지 않았다.

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Discussion

소수성 dicysteinyl의 테트라 CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW는 = 338) (도 1), 수은과 복합체를 형성한다 (II)도 2에 도시되고 표 1 또한, 펩티드 이량 체 및 삼량 체를 형성하고있다.이 점진적 반응 혼합물 중의 펩티드의 양이 증가 등. m / z에 연결된 이량 체의 값 [(2M + H) + = 677] 및 삼량 체에 의해 도시 된 바와 같이 [(3M + H)은 + = 1,015] CGGC의 티올 그룹은 실험 조건 하에서 다이 설파이드를 형성하도록 산화 않았다 . 이러한 관련 CGGC 종의 형성은이 테트라의 소수성으로 인해이 될 수 있습니다. 1 수은 (II) : 펩티드 및 1 : (II) :( 펩티드 2 수은) 이전 dicysteinyl의 트리 펩티드 7보고 2 착물 CGGC 1에 대응하는 수은 단지 두 가지 유형을 형성한다. 그러나, 초과 또는 동등 수은 (II)의 존재 하에서, 또한, FORMS 2 : 2 수은 (II)] 2 : (펩티드) 2 착물.

카르 dicysteinyl의 테트라 CEEC (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2, MW = 482) 수은 (그림 1) 양식 단지 (II) 그림 3과 표 1 그것은으로 쉽게으로 CEEC 이량 체를 형성하지 않았다있다. 즉, 소수성 CGGC에 대한 관찰. 1 수은 (II) : 펩티드 및 1 : 2 수은 (II) :( 펩티드) 2 착물 CGGC 필적, 그것은 수은 1로 대응하는 복합체를 형성한다. 2 수은 (II)] 2 : (펩티드) 2 착체보다 용이하지만, 보조 카복실 기와, 상기 2를 형성한다. 1 수은 (II)] 2 : 펩티드 복합체와 4 : 또한, 과량의 수은, 그것은 2 형성 2 수은 (II)] 4 : CGGC 관찰되지 않았다 (펩티드) 2 펩티드 복합체.

단지 F에 대한 관찰 된 신호의 요약ORMED m / z 값은 표 1에 도시 된 바와 같다.

표 1

표 수은 펩타이드 복합체 신호 1. 개요. 포름산 암모늄 버퍼, 산도 7.5의 LTQ / Orbitrap MS 크로마토 그램의 수은 펩타이드 복합체 신호.

펩티드뿐만 아니라 dicysteinyl의 테트라 보조 결합 기의 존재 : 우리는 수은 (II)과의 두 dicysteinyl tetrapeptides의 반응은 수은 (II)의 비율이 초기에 종속 된 복합체를 형성하는 것을 보여 주었다. 또한, 특정 전기 분사 이온화 조건 하에서 형성된 복합체 수은 및 펩티드의 정확한 화학량 별개 수은 동위 원소 분포 패턴에 따라 고분해능 ESI 질량 분석법을 사용하여 결정될 수있다.

시스 테닐 pept 반응에서수은 (II)와 IDE는, 예방 조치는 이황화 결합을 형성하는 시스 테닐 티올 기의 산화를 방지하기 위해주의해야한다. 설명 프로토콜 내 완충액 신중 탈기시키고 아르곤하에 저장된다. 또한, 모든 샘플은 반응 즉시 ESI 질량 분광기 분석 전에 제조된다.

두 tetrapeptides, CEEC CGGC 및 용해도 사이의 차이에 의해, 다른 농도의 스톡 용액을 제조 하였다. CGGC 펩타이드 냉동실 스톡 아세토 니트릴 습윤시키고 쉽게 5mM의 포름산 암모늄 완충액, 7.5 X 10-4 M CGGC 용액을 제조하여 pH 7.5 다음에 용해시켰다. CEEC는 낮은 농도로 제조 한 7.5 × 10 -5 M, 이전에 수은 (II) 때문에 낮은 용해성 펩티드 반응 혼합물 단계. 수은 분석을위한 최적의 희석 (II) 단지 때문에 펩티드의 허용에 대한 용해도 10 -5 M 것으로 간주되었다질량 분석기에서 잔류 물을 제거합니다. CGGC 솔루션 계약에서 CEEC 잔류 물은 가끔 튜브 교체를 필요로 튜브, 준수합니다.

수은 - 펩타이드 복합체의 분석 ESI 질량 분광법을 이용한 분석의 중요성은 부드러운 이온화에있다. 이것은 무시할 조각화 분자 이온의 분석을 용이하게한다. 이 연구에서 나타난 바와 같이, 이것은 서명 수은 동위 원소 분포 패턴에 따라 수은 - 펩타이드 복합체의 화학 양론을 특성화하는데 사용될 수있다. 그러나, 휘발성 버퍼 시스템은 ESI 질량 분광법에 의한 분석을 위해 필요하다. 이 용해 적은 휘발성 용매 또는 버퍼링 매체를 필요로 분석을 식별하기위한 실용적인 사용을 제한 할 수 있습니다.

우리는 이전에 언급 된 바와 같이 7,8, ESI 질량 분광법은 수은 pept의 화학량 론의 정확한 측정을위한 민감성 분석 도구를 제공한다특정 전기 분사 이온화 조건 하에서 수은 - 펩타이드 복합체의 IDE. 그러나, 추가의 방법을 사용할 필요가있다 (예를 들면, 1 H, 13 C는 199 수은 NMR 스펙트럼 확장, X 선 흡수 미세 구조, 또는 전위차 17-18) 착물의 함유량의 더욱 정확한 결정을 제공하는 해결책.

우리 orbitrap ESI 질량 분석기가 수은 - 펩타이드 복합체를 분석하는데 사용될 수 있다는 것을 보여 주었다. 우리는이 기술은 다른 금속 이온과 다양한 작은 화합물과의 착체의 분석을 향해인가 될 수 있음을 예상한다. 이것은 다른 동위 원소 형태로 존재할 수있는 다른 금속 이온에 의해 형성된 복합체를 분석에 특히 유용 할 것이다.

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Acknowledgments

MN-S는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원을 인정, 루이 저자는 감사 써모 피셔 과학 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기의 사용을 위해 그린 즈 버러 노스 캐롤라이나 대학의 인조 질량 분석 시설을 인정 CHE 1011859.을 부여합니다. 저자는이 작품에 대한 유용한 제안과 의견을 그린 즈 버러 노스 캐롤라이나 대학의 다니엘 토드, 빈센트 시카 및 Brandie Erhmann 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

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화학 문제 (107) 수은 펩타이드 복합체 수은 동위 원소 피크 질량 분석 ESI MS 시스 테닐 펩티드
전자 분무 이온화 질량 분석에 의해 Dicysteinyl Tetrapeptides와 수은 (II)의 복합체 형성에 관한 연구
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Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

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