Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En studie av kompleks av Mercury (II) med Dicysteinyl tetrapeptidene av elektrosprayionisering massespektrometri

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Merk: Ta kontakt med alle relevante HMS-datablad (MSDS) før bruk. Kvikksølv klorid er et giftig kjemikalie. Personlig verneutstyr (hansker, vernebriller og frakk) må brukes når du leverer den, og alle tilhørende løsninger. Avhende løsninger i tydelig merkede kjemiske avfallsflasker beregnet for tungmetaller.

1. Utarbeidelse av 5 mM Avgasset ammoniumformat Buffer, pH 7,5

  1. Oppløs 0,1576 g ammoniumformiat-buffer i 450 ml HPLC-kvalitet vann. Juster pH på den ovennevnte løsning med en M maursyre og 1 M ammoniumhydroksyd til 7,5. Overfør løsningen til en 500 ml volumetrisk kolbe og tilsett HPLC-vann til kalibreringslinje for å lage en 5 mM ammoniumformiat løsning.
  2. Avgasse 5 mM ammoniumformiat-buffer under et vakuum system i 10 minutter og spyling med argon. Gjenta to ganger og butikkløsning under argon. På dagen for bruk filtrere bufferoppløsningen gjennom et 0,2 mikron filter before bruk.

2. Utarbeidelse av kvikksølv (II) klorid Solutions

  1. Vei ut 0,2375 g kvikksølv (II) klorid. Oppløse den i 25 ml av 5 mM ammoniumformiat-buffer for å gi en 0,035 M kvikksølv (II) klorid-oppløsning.
  2. Legg 0,214 ml 0,035 M kvikksølv (II) klorid-løsning til 9,785 ml av 5 mM ammoniumformiat-buffer for å lage en 7,5 x 10 -4 M oppløsning. Teppe på 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) løsning med argongass.

3. Utarbeidelse av CGGC lagerløsning

  1. Oppløs 2,0 mg av dicysteinyl tetrapeptidet, CGGC, i 0,118 ml av HPLC-kvalitet acetonitril og deretter legge til 1,0647 ml av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer som er blitt avgasset i argon for å gi en 5 mM stamløsning CGGC.
  2. Legg 225 mL av 5 mM CGGC stamløsning til 1,275 ul 5 mM ammonium dannelse pH 7,5 buffer til å gi en 7,5 x 10 -4 M CGGC oppløsning.

4. Forberedelseav forskjellige reaksjons Blandinger av kvikksølv (II) og CGGC

  1. Fremstilling av 1: 0,5 forhold av kvikksølv (II): CGGC oppløsning
    1. Plassere 255 pl 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) klorid oppløsning inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør med ammoniumformiat-buffer.
    2. Vortex-løsning i 10 sek. Deretter legger 15 pl av 7,5 x 10 -4 M CGGC løsning i 1,5 ml mikrosentrifuge. Vortex-løsning i 10 sek. La løsningen stå i 10 minutter før injeksjon i massespektrometret.
  2. Fremstilling av 1: 1 forhold av kvikksølv (II): CGGC oppløsning
    1. Plassere 240 pl 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) klorid oppløsning inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør med ammoniumformiat-buffer.
    2. Vortex-løsning i 10 sek. Dalegge til 30 pl av 7,5 x 10 -4 M CGGC løsning i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta på en lignende måte som beskrevet i kapittel 4.1.
  3. Fremstilling av 1: 2-forhold av kvikksølv (II): CGGC oppløsning
    1. Plassere 210 pl 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) klorid oppløsning inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør med ammoniumformiat-buffer.
    2. Vortex-løsning i 10 sek. Deretter legger 60 mL av 7,5 x 10 -4 M CGGC løsning i 1,5 ml mikro tube. Gjenta på en lignende måte som beskrevet i kapittel 4.1.

5. Utarbeidelse av CEEC lagerløsning

  1. Oppløs 3,5 mg av dicysteinyl tetrapeptidet, CEEC, i 0,145 ml av HPLC-kvalitet acetonitril for å oppløse peptidet. Deretter legger 13,067 ml av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer som er blitt avgasset i argon for å fremstille 0,5 mM CEEC løsning.
  2. Vortex løsningen inntil alt peptidet er oppløst. Legg 1,125 ml av 0,5 mM CEEC-oppløsning og 0,375 ml av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør for å gi en 7,5 x 10 -5 M CEEC oppløsning. Vortex inntil blandet.

6. Fremstilling av forskjellige reaksjons Blandinger av kvikksølv (II) og CEEC Solution

  1. Fremstilling av 1: 0,5 forhold av kvikksølv (II): CEEC oppløsning
    1. Plassere 255 pl 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) klorid oppløsning inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør med ammoniumformiat-buffer.
    2. Vortex-løsning i 10 sek. Deretter legger 15 pl av 7,5 x 10 -4 M CEEC løsning i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta på en lignende måte som beskrevet i kapittel 4.1.
  2. Fremstilling av 1: 1 forhold av kvikksølv (II): CEEC oppløsning
    1. Plassere 24081; l av 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) klorid oppløsning inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør med ammoniumformiat-buffer.
    2. Vortex-løsning i 10 sek. Deretter legger 30 pl av 7,5 x 10 -4 M CEEC løsning i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta på en lignende måte som beskrevet i kapittel 4.1.
  3. Fremstilling av 1: 2-forhold av kvikksølv (II): CEEC oppløsning
    1. Plassere 210 pl 5 mM ammoniumformiat, pH 7,5 buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 30 pl av 7,5 x 10 -4 M kvikksølv (II) klorid oppløsning inn i 1,5 ml mikrosentrifugerør med ammoniumformiat-buffer.
    2. Vortex-løsning i 10 sek. Deretter legger 60 mL av 7,5 x 10 -4 M CEEC løsning i 1,5 ml mikro tube. Gjenta på en lignende måte som beskrevet i kapittel 4.1.

7. Analyzing reaksjonsblandingene av kvikksølv (II) og CGGC Prøver av Orbitrap ESI massespektrometri

  1. Klar ESI massespektrometer 16
    1. Tegn 100 pl kalibreringsstandarder i en 500 mL glassprøyte.
    2. Plasser sprøyten i sprøyten vugge MS pumpe, fester slangen, og injisere inn i massen spektrofotometer.
    3. Sett opp filnavnet for kjøringen ved å velge filen ikonet og skrive inn filnavnet.
    4. Velg skaffe data-knappen i datamodulen og samle 150 skanninger.
    5. Analyser kromatogram for å kontrollere kalibreringsstandardene ved å åpne databehandlingsmodul av programvaren. Åpne modulen, gå til fil-menyen og velg "åpne", og velg filen i dialogboksen. Kontroller at toppene i kromatogrammet relateres til massen for å lade forhold av standardene.
    6. Rengjør 500 mL glassprøyte ved å tegne opp 500 mL HPLC-kvalitet metanol og deretter dispensere metanol i et begerglass.
    7. Utarbeide 500 mL av HPLC-kvalitet metanol i glasset sprøyte og skylle systemet som per trinn 7.1.2.
    8. Velg metoden setup modul av programvaren til å stille inn parametere. Velg skannemodusmenyen og identifisere analysatoren som FTMS, og klikk deretter på "OK". Så ved å klikke på de forskjellige ikonene på real-time visning spektrum siden, satt følgende parametre: Kappe gasstrømningshastighet: 10 Kilde temperatur: 0, Capillary spenning: 37 V, Tube linse: 95 V, Spray spenning: 4.20 kV , Flow rangere 10,00 mL / min, Analyzer: FTMS, Antall skanninger: 150.
  2. Kjører CGGC prøver på ESI massespektrometer
    1. Kjør 5 mM ammoniumformiat pH 7,5 buffer.
      1. Plasser 500 mL av 5 mM ammoniumformat buffer inn i 500 mL glassprøyte, legg den inn i sprøyten vugge MS pumpe, og fest slangen.
      2. Kjør buffer gjennom røret i 1-2 min.
      3. Sett opp filnavnet for kjøringenved å velge filen ikonet og skrive inn filnavnet.
      4. Velg skaffe data knappen i modulen og samle 150 skanninger.
      5. Klikk rømmen knappen for å stoppe innsamling etter 150 skanninger er samlet.
      6. Åpne data leseren modul, så gå til fil-menyen og velg "åpne", og velg filen i dialogboksen. Kontroller at ingen topper ved 483, 683, 1163 og 1363 m / z er til stede som ligner peptidet eller kvikksølv (II) -peptid komplekser.
    2. Kjør 1: 0,5 kvikksølv (II): CGGC ratio løsning.
      1. Plasser 250 ul av 1: 0,5 kvikksølv (II): CGGC forholdet av prøven i sprøyten.
      2. Plasser sprøyten inn i sprøyten vugge MS pumpe, fester slangen, og prime apparatet.
      3. Velg et filnavn for kjøringen ved å velge filen ikonet og skrive inn filnavnet.
      4. Trykker erverve data-knappen i datainnsamlingsmodul og samle 150 skanner og klikk rømmen knappen for å stoppe innsamling.
      5. Åpne modulen, gå til fil-menyen og velg "åpne", og velg filen i dialogboksen. Kontroller at kromatogrammet inneholder toppene inkludert en for CGGC peptid alene.
      6. Vask sprøyte ved å aspirere med 500 ul ammoniumformiat-buffer, og deretter utlevering av den ammoniumformiat-buffer i et begerglass.
      7. Velg avfallet knappen på MS og skylle slangen tre ganger med 500 mL ammoniumformat buffer.
      8. Vask sprøyte ved å aspirere med 500 ul metanol, og deretter utlevering av metanolen i et begerglass.
      9. Skyll røret en gang med 500 mL metanol.
      10. Velg belastning detektor knappen på MS.
      11. Legg 500 mL av ammoniumformiat-buffer til sprøyten.
      12. Plasser sprøyten inn i sprøyten vugge MS pumpe, fester slangen, og prime apparatet.
      13. Velg et filnavn for buffer drevet ved å velge filen ikonet og skrive inn filnavnet.
      14. Pressenerverve data knappen og samle 150 skanner og klikk deretter på stopp run knappen.
      15. Åpne data leseren modul, gå til fil-menyen og velg "åpne", og velg filen i dialogboksen. Kontroller at kromatogrammet er blottet for topper fra forrige Hg: CGGC løp.
    3. Kjør 1: 1 kvikksølv (II): CGGC ratio løsning.
      1. Plasser 250 ul av 1: 1 kvikksølv (II): CGGC forholdet prøven i sprøyten.
      2. Gjenta på en lignende måte som beskrevet for trinn 7.2.2.2 til 7.2.2.15.
    4. Kjør 1: 2 kvikksølv (II): CGGC forholdet løsning
      1. Plasser 250 mL av 1: 2-kvikksølv (II): CGGC konsentrasjon prøven i sprøyten.
      2. Gjenta på en lignende måte som beskrevet for trinn 7.2.2.2 til 7.2.2.15.

8. Analysere Reaksjonsblandingene av Mercury og CEEC prøver ved Orbitrap ESI massespektrometri

  1. Kjører CEEC prøver på ESI massespektrometer
    1. Gjenta analyseprosedyre (trinn 7.1 til 7.2) ved hjelp av CEEC prøver og reaksjonsblandinger av kvikksølv (II) og CEEC på ulike støkiometriske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En studie ble utført for å karakterisere mulige kvikksølv-peptid kompleks sammensetning for to tetrapeptider, CGGC og CEEC (figur 1) ved å ESI massespektrometri. Komplekser av kvikksølv (II) med CGGC eller CEEC ble undersøkt ved omsetning av blandinger av kvikksølv (II) og peptid-oppløsninger ved tre forskjellige molare forhold: 1: 0,5, 1: 1 og 1: 2 (kvikksølv (II): peptid) . Konsentrasjonen av kvikksølv (II) var 7,5 x 10 -6 M og peptidet konsentrasjonen varieres tilsvarende.

Figur 1
Figur 1. Dicysteinyl peptid strukturer. Kjemiske strukturer av dicysteinyl tetrapeptidene, CGGC og CEEC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
Figur 2. ESI MS av kvikksølv (II) og CGGC elektrospray ionisering orbitrap massespektra fra en oppløsning inneholdende 7,5 x 10 -6 M 2+ Hg i ammoniumformiat-buffer, pH 7,5 inneholdende varierende 2+ Hg. CGGC støkiometriske forhold: (A ) 1: 0,5-forhold, (B) 1: 1-forhold, og (C) 1: 2 forhold. Innfellinger viser kvikksølv isotoper mønstre av de angitte kvikksølv-peptid komplekser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. ESI MS av kvikksølv (II) og CEEC. Elektrosprayionisering orbitrap massespektra fraen oppløsning inneholdende 7,5 x 10 -6 M 2+ Hg i ammoniumformiat-buffer, pH 7,5 inneholdende varierende Hg 2+: CEEC støkiometriske forhold: (A) på 1: 0,5-forhold, (B) 1: 1-forhold, og (C) en : 2 forhold. Innfellinger viser kvikksølv isotoper mønstre av de angitte kvikksølv-peptid komplekser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Elektrospray ionisering orbitrap massekromatogrammer ble samlet for kvikksølv (II) kompleksdannelse med CGGC (figur 2) og CEEC (figur 3) ved en rekke kvikksølv (II) til peptid støkiometriske forhold (1: 0,5, 1: 1 og 1: 2). De observerte kvikksølv-peptid komplekse typer viser distinkte kvikksølv isotopiske topper (innfellinger), som brukes for å bestemme antall av kvikksølvioner i komplekset så vel som antall Deprotonations. For eksempel, viser figur 1b innfelt kvikksølv isotop signaturen i peptid-kvikksølv-addukt, som svarer til de syv viktigste naturlig forekommende isotoper av kvikksølv: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), med prosent naturlige Forekomsten er angitt i parentes. De to hoved isotopene 200 og 202 Hg Hg viser en tydelig relativ intensitet forhold på 2,3: 3. I henhold til den mest intense isotopiske toppen av en kvikksølv-isotopen cluster danner monoisotopic massen for adduktet (m / z = 539). Det korrelerer med en to-koordinat-komplekset, som er dannet ved deprotonering av to cysteinyl tioler for å danne [(CGGC-2H + Hg) + H] + addukt. Denne analysen er som følger:

m / z-verdien for [(CGGC-2H + Hg) + H] + er utstal til (338-2 + 202 1) = 539.

Figur 1A innfelt viser kvikksølv isotop signaturen i peptid-kvikksølv Adduktet, noe som tilsvarer en to-kvikksølv komplisert som beregnes ved hjelp av ChemCal program for [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + (figur 4). Den teoretiske protonert monoisotopic masse svarer til en m / z verdi på 1077.061, som er den niende isotop toppen i den beregnede isotop-klyngen. Figur 1 A nedfelling viser en isotop topp tilsvarende en m / z verdi på 1077,1, som også er den niende peak i den observerte isotop klyngen. Derfor kan den opprinnelige adduktet for denne isotop-klyngen bli tildelt for [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +.

Figur 4
Figur 4. Teoretiske isotoper mønstre for [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + sup>. De teoretiske isotoper mønstre for [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + som beregnes ved hjelp av ChemCal program. Pil viser monoisotopic peak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. kationisert addukter. Noen kationisert natrium og kalium addukter knyttet til kvikksølv-peptid komplekser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 viser noen kat-ioniserte natrium- og kalium-addukter er forbundet med kvikksølv-peptid-komplekser som er dannet ved CGGC. Sodiated addukter er 22 masse enheter større tHan tilsvarende protonkvikksølv CGGC komplekser, mens kalium addukter er 38 masse enheter større. Den dominerende protonert CGGC dimer (m / z = 677) også danner kationisert arter med natrium (m / z = 699) og kaliumioner (m / z = 715). Dette bekrefter ytterligere dannelse av dimerer CGGC uten oksidasjon av cysteinyl tiolgrupper for å danne disulfider, noe som ville ha resultert i en reduksjon av to masseenheter for protonerte eller kationisert addukter.

Figur 6
Figur 6. Overlapping 1 og 2 lade stater. Overlappende topper assosiert med kvikksølv-peptid ioner [(CEEC-4H + 2HG) + H] + i +1 og +2 lade stater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 7. Teoretiske isotoper mønstre for [(CEEC-4H + 2HG) + H] +. De teoretiske isotoper mønstre for [(CEEC-4H + 2HG) + H] + som beregnes ved hjelp av ChemCal program. Pil viser monoisotopic peak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6 viser overlappende topper assosiert med kvikksølv CEEC addukter i en og to ekstra kostnader. Det viser isotopiske toppene som er forbundet med kvikksølv-peptid ioner [(CEEC-4H + 2HG) + H] + i en kostnad og en m / z verdi på 883. Dette er i samsvar med en to kvikksølv kompleks som beregnet for [(CEEC-4H + 2HG) + H] + ved hjelp av ChemCal programmet (figur 7). Den teoretiske proton monoisotopicmasse svarer til en m / z verdi på 883,032.

Ovennevnte observerte [(CEEC-4H + 2HG) + H] + addukt med en monoisotopic topp på 883,03 overlapper med et annet addukt inneholdende tilsvarende topper som viser en ytterligere 0.5 masseenheter. Med ekstremt høy oppløsning oppnås ved orbitrap massespektrometri instrument, kan det postuleres at disse overlappende topper tilsvarer addukter med en ladning på +2. Følgelig monoisotopic massen av det overlappende komplekset blir ionisert kan beregnes som følger. Figur 8 viser at m / z forskjellen mellom de isotope toppene er 0,5 og massen forskjellen mellom dem er en amu. Derfor er ladetilstand 2. For å beregne massen av kvikksølv-peptid-komplekset, er m / z for monoisotopic peak multiplisert med ladetilstand, og subtrahert fra massen av to protoner, noe som gjorde det komplekse ion positivt ladet.

Beregninger for to addisjonsproduktet:

m / z forskjell mellom toppene er 0,5 isotopiske

Mass forskjellen mellom isotoper topper er en amu (1 nøytron)

z = 1 dividere med 0,5 = 2

m / z for proton monoisotopic topp er (883,53 x 2) - 2 = 1765,06

Ovennevnte m / z-verdien for det protonerte monoisotopic toppen, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, er i overensstemmelse med den teoretiske verdi som beregnes av programmet som ChemCal 1765,056 (figur 8).

Figur 8
Figur 8. Teoretiskisotopiske mønstre for [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. De teoretiske isotoper mønstre for [(2CEEC-8H + 4HG) + H] + som beregnet ved hjelp av ChemCal program. Pil viser monoisotopic peak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fordelen med å analysere kvikksølv-peptid-komplekser med en ESI orbitrap massespektrometer er at ansvaret for hvert ion lett kan tildeles som vist ovenfor. Peptider som inneholder grunnleggende aminoende kan lett stabil positive ladninger. Ved bruk av elektrospray ionisering og en høy oppløsningsmasse analysator slik som orbitrap, ladetilstand peptid med ioner som er større enn en ladning, kan bestemmes lettere sammenlignet med lavere oppløsning iontrap masse analysator.

(figur 3A og figur 6), som beskrevet ovenfor, ble også analysert ved tandem MS. Det viste ingen MS-MS-fragmentering, noe som indikerte at de oppnådde signaler som tilhører den forventede forbindelse som omtalt ovenfor, og er ikke gruppert gjenstander som dannes ved høyere konsentrasjoner av kvikksølv-til-peptid-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den hydrofobe dicysteinyl Tetrapeptid CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; molekylvekt = 338) (figur 1), danner komplekser med kvikksølv (II) som vist i figur 2 og tabell 1. I tillegg danner peptid dimerer og trimerer. trinnvis etter hvert som mengden av peptid øker i reaksjonsblandingen. Som vist ved m / z-verdier i de tilknyttede dimer [(2M + H) + = 677] og trimerer [(3 M + H) + = 1015], tiolgruppene på CGGC ikke oksyderes for å danne disulfider under eksperimentelle betingelser . Dannelsen av disse tilknyttede CGGC artene kan være på grunn av hydrofobisiteten til dette tetrapeptid. CGGC danner to typer av komplekser med kvikksølv svarende til 1: 1 kvikksølv (II): peptid og 1: 2 kvikksølv (II) :( 2) peptid-komplekser som tidligere er rapportert for dicysteinyl tripeptider 7. Imidlertid, i nærvær av overskudd av eller tilsvarende kvikksølv (II), er det også forms en 2: 2 [kvikksølv (II)] 2: (peptid) 2-kompleks.

Den karboksylerte dicysteinyl Tetrapeptid CEEC (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; molekylvekt = 482) (figur 1) danner komplekser med kvikksølv (II) som vist i Figur 3 og Tabell 1. Det ikke dannet CEEC dimerer så lett som. som observerer for de mer hydrofobe CGGC. Sammenlignes med CGGC, danner komplekser med kvikksølv svarende til 1: 1 kvikksølv (II): peptid og 1: 2 kvikksølv (II) :( peptid) 2-komplekser. Men med hjelpe karboksylatgrupper, danner det 2: 2 [kvikksølv (II)] 2: (peptid) 2 komplisert lettere. Videre, i overskudd av kvikksølv, danner det 2: 1 [kvikksølv (II)] 2: peptid kompleks og 4: 2 [kvikksølv (II)] 4: (peptid) 2-peptid-komplekset, som ikke ble observert i CGGC.

Oppsummeringen av de observerte signaler for kompleksene formed som m / z-verdier er vist i tabell 1.

Tabell 1

Tabell 1. Sammendrag av kvikksølv-peptid komplekser signaler. Mercury-peptid komplekser signaler i LTQ / Orbitrap MS kromatogrammene i ammoniumformat buffer, pH 7,5.

Vi har vist at reaksjonen av kvikksølv (II) og to dicysteinyl tetrapeptider danne komplekser som er avhengig av de opprinnelige forhold av kvikksølv (II): peptid så vel som nærværet av hjelpbindingsgrupper i dicysteinyl tetrapeptid. Dessuten kan nøyaktig støkiometri av kvikksølv og peptid i kompleksene dannet under spesifiserte elektrosprayionisering betingelser bestemmes ved hjelp av høyoppløselig ESI massespektrometri basert på distinkte kvikksølv isotop-fordelingsmønster.

I reagere cysteinyl Peptides med kvikksølv (II), må det tas forholdsregler for å hindre oksidasjon av cysteinyl tiolgrupper å danne disulfidbindinger. Innenfor den beskrevne protokoll, ble bufferoppløsninger var forsiktig avgasset og oppbevart under argon. I tillegg er alle reaksjonsprøver fremstilt umiddelbart før analyse ved ESI massespektrometri.

På grunn av forskjeller i løselighet mellom de to tetrapeptidene, CEEC og CGGC, ble ulike konsentrasjoner brukt til å forberede stamløsninger. Fryseren lager av CGGC peptid ble fuktet med acetonitril og ble lett oppløst, etterfulgt av 5 mM ammoniumformiat-buffer, pH 7,5 for å fremstille en 7,5 x 10 -4 M CGGC oppløsning. Den CEEC ble fremstilt ved en lavere konsentrasjon, 7,5 x 10 -5 M, forut for kvikksølv (II): peptide reaksjonsblandingen trinn på grunn av dets lavere oppløselighet. Den optimale fortynning for analysering av kvikksølv (II) kompleksene ble ansett for å være 10 -5 M på grunn av løseligheten av peptidet og for å tillatefor fjerning av rester i massespektrometer. I kontrakten til CGGC løsninger, CEEC rester holder seg til rør, noe som nødvendiggjør en og annen slange erstatning.

Betydningen av å bruke ESI massespektrometri for analyse av kvikksølv-peptid-komplekser ligger i dens myke ionisering av analytter. Dette letter analysen av molekylære ioner med ubetydelig fragmentering. Som vist i dette arbeidet, kan den brukes til å karakterisere støkiometrier av kvikksølv-peptid-komplekser basert på signaturen kvikksølv isotop-fordelingsmønster. Imidlertid er en flyktig buffer system er nødvendig for analyse ved ESI massespektrometri. Dette kan begrense sin praktisk bruk for å identifisere analytter som krever mindre flyktige løsemidler eller buffer medier for oppløsning.

Som vi tidligere har nevnt 7,8, gir ESI massespektrometri et følsomt analytisk verktøy for en nøyaktig bestemmelse av støkiometrien av kvikksølv og Peptide i kvikksølv-peptid komplekser under spesifiserte elektrosprayionisering tilstand. Imidlertid er det nødvendig å bruke andre metoder (for eksempel, 1 H, 13 C, 199 Hg NMR-spektroskopi, utvidet røntgen-absorpsjon fin struktur, eller potensiometri 17-18) for å tilveiebringe en mer nøyaktig bestemmelse av innholdet av komplekser i løsning.

Vi har vist at med en orbitrap ESI masse analysator kan brukes til å analysere kvikksølv-peptid-komplekser. Vi forventer at denne teknikken kan brukes mot analyse av andre metallioner og deres komplekser med diverse små forbindelser. Det vil være spesielt nyttig for å analysere komplekser som er dannet av andre metallioner som kan eksistere i forskjellige isotopiske former.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S erkjenner støtte fra National Science Foundation, RUI gi CHE 1011859. Forfatterne ønsker å takke for den Triad massespektrometri Facility ved University of North Carolina i Greensboro for bruk av Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL massespektrometer. Forfatterne takker Daniel Todd, Vincent Sica, og Brandie Erhmann ved University of North Carolina i Greensboro for nyttige innspill og kommentarer angående dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

Kjemi Mercury-peptid komplekser kvikksølv isotoper topper massespektrometri ESI MS cysteinyl peptider
En studie av kompleks av Mercury (II) med Dicysteinyl tetrapeptidene av elektrosprayionisering massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter