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Chemistry

Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Nota: Por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança do material (MSDS) relevantes antes de usar. Cloreto de mercúrio é uma substância química tóxica. Equipamentos de proteção individual (luvas, óculos de segurança, e jaleco) deve ser usado durante a entregá-lo e todas as soluções associadas. Descarte as soluções em frascos de resíduos químicos claramente identificados designados para os metais pesados.

1. Preparação de 5 mM de formato de amónio desgaseificada tampão, pH 7,5

  1. Dissolve-se 0,1576 g de tampão de formato de amónio em 450 ml de água de qualidade para HPLC. Ajustar o pH da solução acima referida com 1 M de ácido fórmico e 1 M de hidróxido de amónio a 7,5. Transferir esta solução para um balão volumétrico de 500 ml e adicionar água HPLC para a linha de calibração para fazer uma solução de formato de amónio 5 mM.
  2. Desgasificar o tampão de formato de amónio 5 mM sob um sistema de vácuo durante 10 min e purga com árgon. Repita duas vezes e solução de loja sob árgon. No dia da utilização, filtrar a solução tampão através de um filtro de 0,2 mícron antes da suauso e.

2. Preparação de mercúrio (II) Cloreto de Soluções

  1. Pesar 0,2375 g de mercúrio (II) cloreto. Dissolve-lo em 25 ml de tampão de formato de amónio 5 mM, para produzir uma solução de cloreto de 0,035 M de mercúrio (II).
  2. Adicionar 0,214 ml de uma solução M de mercúrio (II), cloreto de 0,035 para 9.785 ml de 5 mM de tampão de formato de amónio para criar uma solução de 7,5 x 10 -4 M. Cobertor a solução de 7,5 x 10 -4 M de mercúrio (II) com gás árgon.

3. Preparação de Solução Stock CGGC

  1. Dissolve-se 2,0 mg do tetrapéptido dicysteinyl, CGGC, em 0,118 ml de acetonitrilo de grau HPLC e, em seguida, adicionar 1,0647 ml de formato de amónio 5 mM, pH 7,5 tampão que foi desgaseif içada em árgon para se obter uma solução estoque 5 mM CGGC.
  2. Adicionar 225 ul da solução-mãe 5 mM a 1,275 CGGC ul de 5 mM de formação de amónio pH 7,5 tampão para dar uma solução de 7,5 x 10 -4 M CGGC.

4. Preparaçãode várias misturas de reacção de mercúrio (II) e CGGC

  1. Preparação de 1: 0,5 razão de mercúrio (II): solução CGGC
    1. Coloque 255 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 15 ul de 7,5 x 10 -4 M solução CGGC na microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex a solução durante 10 seg. Deixar a solução repousar durante 10 minutos antes da injecção no espectrómetro de massa.
  2. Preparação de 1: 1 razão de mercúrio (II): solução CGGC
    1. Coloque 240 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. depoisadicionar 30 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.
  3. Preparação de 1: 2 proporção de mercúrio (II): solução CGGC
    1. Coloque 210 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 60 ul de 7,5 x 10 -4 M CGGC solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.

5. Preparação de Solução Stock PECO

  1. Dissolve-se 3,5 mg do tetrapéptido dicysteinyl, PECO, em 0,145 ml de acetonitrilo de grau HPLC para dissolver o péptido. Em seguida, adicionar 5 ml de 13,067 formato de amónio mM, pH 7,5 tampão que foi desgaseif içada em árgon para produzir 0,5 mSolução M PECO.
  2. Vortex a solução até todo o péptido estar dissolvido. Adicionar 1,125 ml de solução 0,5 mM PECO e 0,375 ml de 5 mM de formato de amónio, pH 7,5 tampão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para dar uma solução de 7,5 x 10 -5 M PECO. Vortex até misturado.

6. Preparação de várias misturas de reacção de mercúrio (II) e solução PECO

  1. Preparação de 1: 0,5 razão de mercúrio (II): solução PECO
    1. Coloque 255 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 15 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.
  2. Preparação de 1: 1 razão de mercúrio (II): solução PECO
    1. Coloque 24081; l de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 30 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.
  3. Preparação de 1: 2 proporção de mercúrio (II): solução PECO
    1. Coloque 210 ul de formato de amónio 5 mM, tampão de pH 7,5 num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 30 ul de solução de mercúrio (II), cloreto de 7,5 x 10 -4 M no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com o tampão de formiato de amónio.
    2. Vortex a solução durante 10 seg. Em seguida, adicionar 60 ul de 7,5 x 10 -4 M PECO solução no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita em um modo semelhante ao descrito no ponto 4.1.

7. Analyzing as misturas de reacção de mercúrio (II) e as amostras CGGC por Espectrometria de Massa ESI Orbitrap

  1. Preparar o espectrómetro de massa ESI 16
    1. Desenhar 100 ul de padrões de calibração para uma seringa de vidro de 500 ul.
    2. Coloque a seringa no berço seringa da bomba MS, conectar o tubo e injetar no espectrofotômetro de massa.
    3. Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
    4. Selecione o botão de dados adquirem no módulo de aquisição de dados e recolher 150 varreduras.
    5. Analisar o cromatograma para verificar os padrões de calibração, abrindo módulo de processamento de dados do software. Abra o módulo, vá ao menu Arquivo e selecione "abrir", e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verificar que os picos no cromatograma correlacionam-se com a massa para razões de carga dos padrões.
    6. Limpe a seringa de vidro de 500 mL através da elaboração de 500 ul grau HPLC metanol e, em seguida, distribuir a metanol dentro de uma proveta.
    7. Elaborar 500 mL de metanol de grau HPLC para a seringa de vidro e lave o sistema de acordo com o passo 7.1.2.
    8. Selecione o módulo de configuração do método de o software para definir os parâmetros. Escolha o menu do modo de digitalização e identificar o analisador como FTMS, e depois clique em "OK". Em seguida, clicando sobre os vários ícones na página espectro de visão em tempo real, definir os seguintes parâmetros: Bainha caudal do gás: 10, temperatura Fonte: 0, a tensão capilar: 37 V, lente Tubo: 95 V, tensão Spray: 4.20 kV , taxa de fluxo 10.00 l / min, Analyzer: FTMS, Número de análises: 150.
  2. Correr amostras CGGC no espectrômetro de massa ESI
    1. Executar o formato de amónio, pH 7,5 tampão de 5 mM.
      1. Coloque 500 mL de tampão formato de amónio 5 mM para a seringa de vidro de 500 ml, coloque-o no suporte da bomba de seringa MS, e anexar a tubulação.
      2. Tampão executado através da tubulação para 1-2 min.
      3. Configure o nome do arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
      4. Selecione o botão de dados adquirem no módulo e recolher 150 varreduras.
      5. Clique no botão Executar para parar a coleta depois de 150 scans são coletados.
      6. Abra o módulo do navegador de dados, em seguida, vá ao menu Arquivo e selecione "Abrir" e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verificar que não há picos a 483, 683, 1.163 e 1.363 m / z estão presentes que assemelham-se o péptido ou de mercúrio (II) -péptido.
    2. Executar a 1: 0,5 de mercúrio (II): solução proporção CGGC.
      1. Coloque 250 ul de 1: 0,5 de mercúrio (II): proporção CGGC da amostra para a seringa.
      2. Coloque a seringa no suporte de seringa da bomba de MS, conectar o tubo, e preparar o aparelho.
      3. Escolha um nome de arquivo para a corrida, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
      4. Pressione o botão adquirir dados no módulo de aquisição de dados e recolher 150 scans e clique no botão de execução para parar a coleção.
      5. Abra o módulo, vá ao menu Arquivo e selecione "abrir", e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verifique se o cromatograma contém picos incluindo aquela para o peptídeo CGGC sozinho.
      6. Lava-se a seringa por aspiração com tampão de formiato de amónio e, em seguida, 500 ul de tampão de distribuir o formato de amónio para um copo.
      7. Selecione o botão de resíduos no MS e lave o tubo três vezes com 500 ul de tampão formato de amónio.
      8. Lava-se a seringa por aspiração com 500 ul de metanol e, em seguida, a distribuição do metanol para uma proveta.
      9. Lave a tubulação de uma vez com 500 mL de metanol.
      10. Escolha um botão detector carga sobre os MS.
      11. Adicionar 500 ul de tampão de formato de amónio para a seringa.
      12. Coloque a seringa no suporte de seringa da bomba de MS, conectar o tubo, e preparar o aparelho.
      13. Escolha um nome de arquivo para o buffer de executar, selecionando o ícone de arquivo e digitar o nome do arquivo.
      14. pressioneo botão e dados adquirem coletar 150 scans e, em seguida, clique no botão de parada de execução.
      15. Abra o módulo do navegador de dados, vá ao menu Arquivo e selecione "Abrir" e selecione o arquivo na caixa de diálogo. Verifique se o cromatograma é nula de picos do anterior Hg: run CGGC.
    3. Executar a 1: 1 de mercúrio (II): solução proporção CGGC.
      1. Coloque 250 ul de 1: 1 de mercúrio (II): CGGC razão amostra para a seringa.
      2. Repita de uma maneira semelhante ao descrito para Passos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.
    4. Executar a 1: 2 de mercúrio (II): solução proporção CGGC
      1. Coloque 250 ul de 1: 2 de mercúrio (II): CGGC concentração da amostra para a seringa.
      2. Repita de uma maneira semelhante ao descrito para Passos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.

8. Analisando as misturas de reacção de Mercúrio e amostras dos PECO por Orbitrap ESI Espectrometria de Massa

  1. Correr amostras dos PECO no espectrômetro de massa ESI
    1. Procedimento de análise de repetição (Passos 7.1 para 7.2) usando amostras PECO e misturas de reacção de mercúrio (II) e em vários PECO proporções estequiométricas.

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Representative Results

Foi realizado um estudo para caracterizar a composição complexa de mercúrio de peptídeo possível que dois tetrap�tidos, CGGC e PECO (Figura 1) por espectrometria de massa ESI. Complexos de mercúrio (II) com CGGC ou PECO foram investigados por meio de reacção das misturas de mercúrio (II) e as soluções de péptidos em diferentes relações molares: 1: 0,5, 1: 1 e 1: 2 (mercúrio (II): péptido) . A concentração de mercúrio (II) foi de 7,5 x 10 -6 M e a concentração de péptido variou de acordo.

figura 1
Figura 1. estruturas peptídicas. Dicysteinyl estruturas químicas dos tetrapéptidos dicysteinyl, CGGC e PECO. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 2
Figura 2. ESI de mercúrio (II) e os espectros de massa por Electroaspersão CGGC Orbitrap ionização a partir de uma solução contendo 7,5 x 10 -6 M de Hg 2+ em tampão de formato de amónio, pH 7,5 contendo variando Hg 2+:. CGGC proporções estequiométricas: (A ) 1: 0,5 razão, (B), proporção 1: 1, e (C) proporção de 1: 2. Inserções mostram os padrões isotópicos mercúrio dos complexos de mercúrio peptídeo-indicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. ESI de mercúrio (II) e PECO. Ionização por electrospray espectro de massa de Orbitrapuma solução contendo 7,5 x 10 -6 M de Hg 2+ em tampão de formato de amónio, pH 7,5 contendo variando Hg 2+: razões estequiométricas PECO: (a) 1: 0,5 razão, (B), proporção 1: 1, e (C) 1 : 2 proporção. Inserções mostram os padrões isotópicos mercúrio dos complexos de mercúrio peptídeo-indicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Electropulverização cromatogramas de massa de ionização Orbitrap foram recolhidas para o mercúrio de complexação (II) com CGGC (Figura 2) e PECO (Figura 3) a várias mercúrio (II) para o péptido proporções estequiométricas (1: 0,5, 1: 1 e 1: 2). Os tipos de complexos péptido-mercúrio observados mostram picos isotópicos distintos mercúrio (inserir), que são usados ​​para determinar o número de iões de mercúrio no complexo, bem como o número de DEPROtonations. Por exemplo, a Figura 1b inserção mostra a assinatura isotópica mercúrio no aducto de péptido-mercúrio, o que corresponde a sete principais isótopos naturais de mercúrio: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), com abundância natural por cento indicadas entre parêntesis. Os dois principais isótopos 200 Hg e 202 Hg mostrar a relação da intensidade relativa distinto de 2,3: 3. Por conseguinte, o pico isotópico mais intenso do presente conjunto de um isótopo de mercúrio constitui a massa monoisotópica para o aducto (m / z = 539). É correlaciona-se com um complexo de duas coordenadas, que é formado pela desprotonação de dois tióis cisteinilo para formar a [(CGGC-2H + Hg) + H] + aducto. Esta análise é feita como se segue:

valor m / z para [(CGGC-2H + Hg) + H] + é equal para (338-2 + 202 +1) = 539.

A Figura 1A mostra a inserção assinatura isotópica mercúrio no aducto de péptido-mercúrio, o que corresponde a um complexo de dois mercúrio como calculado utilizando o programa para ChemCal [(2CGGC-4H 2HG +) + H] + (Figura 4). A massa monoisotópica teórico protonada corresponde a um valor de m / z de 1077.061, que é o pico isotópico nona no agregado isotópico calculada. A figura 1A inserção mostra um pico isotópico correspondente a um valor de m / z de 1077,1, que também é o nono pico no agregado isotópico observada. Portanto, o aducto originário para este agregado isotópico pode ser atribuído para [(2CGGC-4H 2HG +) + H] +.

Figura 4
Figura 4. padrões isotópicos teóricas para [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + sup>. Os padrões isotópicos teóricas para [(2CGGC-4H + 2HG) + H] +, calculado usando o programa ChemCal. A seta indica pico monoisotópico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. adutos cationizada. Alguns adutos de sódio e potássio cationizados associados com os complexos de mercúrio-peptídeo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 5 mostra alguns adutos de sódio e potássio cationizada associados com os complexos de péptido-mercúrio formados por CGGC. Adutos Sodiated são 22 unidades de massa maior than o protonados complexos mercúrio-CGGC correspondente, ao passo que os adutos de potássio são 38 unidades de massa maiores. O dímero CGGC protonada dominante (m / z = 677) também forma cationizados com espécies de sódio (m / z = 699) e os iões de potássio (m / z = 715). Isto confirma ainda mais a formação de dimeros CGGC sem a oxidação dos grupos tiol de cisteinilo para formar dissulfuretos, o que teria resultado numa diminuição de duas unidades de massa para aductos protonados ou cationizados.

Figura 6
Figura 6. A sobreposição um e dois estados de carga. Picos sobrepostos associados com íons de mercúrio-peptídeo [(PECO-4H + 2HG) + H] + no + 1 e +2 estados de carga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Figura Figura 7. padrões isotópicos teóricas para [(PECO-4H + 2HG) + H] +. Os padrões isotópicos teóricas para [(PECO-4H + 2HG) + H] +, calculado usando o programa ChemCal. A seta indica pico monoisotópico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 6 mostra sobreposição de picos associados com adutos de mercúrio-PECO no cargo um e dois. Ele mostra picos isotópicos que estão associados com iões de mercúrio-péptido [(PECO-4H 2HG +) + H] + 1 na carga e um valor de m / z de 883. Isto é, de acordo com um complexo de dois mercúrio como calculada para [(PECO-4H 2HG +) + H] +, utilizando o programa ChemCal (Figura 7). O monoisotópico protonada teóricade massa corresponde a um valor de m / z de 883,032.

O acima observado [(PECO-4H 2HG +) + H] + aducto com um pico monoisotópico de 883,03 sobrepõe com outro aducto contendo picos correspondentes que mostra uma massa de 0,5 unidades adicionais. Com a resolução extremamente elevada atingida pelo instrumento Orbitrap espectrometria de massa, pode ser postulado que estes picos sobrepostos correspondem a adutos com uma carga de +2. Assim, a massa monoisotópica de sobreposição do complexo a ser ionizado pode ser calculada como se segue. A figura 8 mostra que a diferença de m / z entre os picos isotópicos é de 0,5 e a diferença em massa entre eles é 1 amu. Portanto, o estado de carga é 2. Para calcular a massa do complexo de mercúrio-péptido, a m / z para o pico monoisotópico é multiplicado pelo estado de carga, e subtraída da massa de dois protões, o que fez o ião complexo carregado positivamente.

Os cálculos para a 2 aduto:

diferença m / z entre picos isotópicos é de 0,5

Diferença de massa entre os picos isotópicos é um amu (1 nêutron)

z = 1 divisão por 0,5 = 2

m / z para protonada pico monoisotópico é (883,53 x 2) - 2 = 1765,06

O valor de m / z para cima do pico monoisotópico protonada, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, é consistente com o valor teórico, calculado pelo programa ChemCal como 1.765,056 (Figura 8).

Figura 8
Figura 8. Teóricopadrões isotópicos [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. Os padrões isotópicos teóricas para [(2CEEC-8H + 4HG) + H] + como calculados usando o programa ChemCal. A seta indica pico monoisotópico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A vantagem dos complexos de mercúrio analisando-péptido com um espectrómetro de massa ESI Orbitrap é que a carga de cada ião pode ser facilmente designadas como mostrado acima. Os péptidos contendo amino-terminal de base pode facilmente estabilizar cargas positivas. Quando se utiliza ionização por electropulverização e um analisador de massa de alta resolução, tais como o Orbitrap, o estado de carga de iões de péptidos com maior do que uma carga pode ser determinada mais facilmente em comparação com a resolução mais baixa iontrap analisador de massa.

(Figura 3A e Figura 6), tal como descrito acima, foram também analisadas por MS em tandem. Não mostrou qualquer fragmentação MS-MS, que indicou que os sinais obtidos pertencem ao composto esperado, como discutido acima, e não são aglomeradas artefactos formadas em concentrações elevadas de mercúrio-a-péptido rácios.

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Discussion

O tetrapéptido dicysteinyl hidrofóbico CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; PM = 338) (Figura 1), forma complexos com o mercúrio (II) como mostrado na Figura 2 e Tabela 1 Além disso, forma-se dímeros de péptidos e trímeros. incremental à medida que aumenta a quantidade de de péptidos na mistura de reacção. Como mostrado pelos valores de m / z dos dimeros associados [(2M + H) + = 677] e trímeros [(3M + H) + = 1,015], os grupos tiol de CGGC não oxidam para formar dissulfuretos, nas condições experimentais . A formação destas espécies CGGC associados pode ser devido à hidrofobicidade deste tetrapéptido. CGGC forma dois tipos de complexos com mercúrio correspondentes a 1: 1 de mercúrio (II): péptido e 1: 2 de mercúrio (II) :( 2) complexos de péptido Como relatado anteriormente por tripéptidos dicysteinyl 7. No entanto, na presença de excesso ou equivalente de mercúrio (II), que também foRMS de 2: 2 [mercúrio (II)] 2: (péptido) 2 complexo.

O tetrapéptido dicysteinyl carboxilado PECO (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; PM = 482) (Figura 1) formam complexos com o mercúrio (II) como mostrado na Figura 3 e Tabela 1, não se formaram dímeros PECO tão prontamente como. observar que para o CGGC mais hidrofóbico. Comparável a CGGC, forma complexos com mercúrio correspondente a 1: 1 de mercúrio (II): péptido e 1: 2 de mercúrio (II) :( péptido) 2 complexos. No entanto, com os grupos carboxilato auxiliares, forma-se o 2: 2 [mercúrio (II)] 2: (péptido) 2 complexo mais prontamente. Além disso, em excesso de mercúrio, que constitui a 2: 1 [mercúrio (II)] 2: péptido complexo e a 4: 2 [mercúrio (II)] 4: (péptido) 2 complexo de péptido, que não foram observadas para CGGC.

O resumo dos sinais observados para os complexos de fOrmed como valores m / z estão indicados no Quadro 1.

tabela 1

Tabela 1. Resumo dos sinais complexos de péptido-mercúrio. Sinais complexos de péptido-mercúrio nos cromatogramas LTQ / MS Orbitrap em tampão de formato de amónio, pH 7,5.

Demonstrou-se que a reacção de mercúrio (II) e dois tetrapéptidos dicysteinyl formar complexos que são dependentes das proporções iniciais de mercúrio (II): péptido, bem como a presença de grupos de ligação auxiliares no tetrapéptido dicysteinyl. Além disso, a estequiometria exacta do péptido em mercúrio e os complexos formados sob condições de ionização por electropulverização especificado pode ser determinada utilizando espectrometria de massa de alta resolução ESI baseado em padrões de distribuição isotópica de mercúrio distinta.

Em reacção cisteinil Peptides com o mercúrio (II), devem ser tomadas precauções para evitar a oxidação dos grupos tiol de cisteinilo para formar ligações dissulfureto. Dentro do protocolo descrito, as soluções tampão foram cuidadosamente desgaseificados e armazenados sob atmosfera de árgon. Além disso, todas as amostras de reacção são preparadas imediatamente antes da análise por espectrometria de massa ESI.

Devido às diferenças de solubilidade entre os dois tetrapéptidos, PECO e CGGC, concentrações diferentes foram utilizados para preparar as soluções de estoque. O estoque congelador de CGGC péptido foi humedecido com acetonitrilo e foi dissolvido facilmente seguido de tampão de formato de amónio 5 mM, pH 7,5 para produzir uma solução de 7,5 x 10 -4 M CGGC. O PECO foi preparada a uma concentração mais baixa, de 7,5 x 10 ~ 5 M, antes do mercúrio (II): em passos de mistura de reacção de péptidos devido à sua solubilidade mais baixa. A diluição óptima para a análise do mercúrio complexos (II) foi considerado como sendo de 10 -5 M por causa da solubilidade do péptido e para permitirpara a remoção de resíduos no espectrómetro de massa. No contrato para as soluções CGGC, resíduos PECO aderir ao tubo, o que exige a substituição ocasional tubulação.

A importância da utilização de espectrometria de massa ESI para a análise de complexos de péptido-mercúrio reside na sua ionização de analitos macio. Isto facilita a análise de fragmentação de iões moleculares com negligenciável. Como mostrado neste trabalho, ele pode ser utilizado para caracterizar os complexos de estequiometrias de mercúrio-péptido com base nos padrões de distribuição isotópica assinatura de mercúrio. No entanto, um sistema tampão volátil é necessário, para análise por espectrometria de massa ESI. Isso pode limitar seu uso prático para a identificação de analitos que requerem solventes menos voláteis ou meios de tamponamento para dissolução.

Como já anteriormente mencionado 7,8, espectrometria de massa de ESI fornece uma ferramenta analítica sensível para uma determinação precisa da estequiometria de mercúrio e PeptIDE nos complexos péptido-mercúrio sob a condição especificada por ionização por electropulverização. No entanto, é necessário utilizar métodos adicionais (por exemplo, 1 H, 13 C, 199 Hg espectroscopia de RMN, raios X estendido estrutura fina de absorção, ou potenciometria 17-18) para proporcionar uma determinação mais precisa do conteúdo de complexos em solução.

Mostrámos que ESI com um analisador de massa Orbitrap pode ser utilizado para analisar os complexos péptido-mercúrio. Espera-se que esta técnica pode ser aplicado para a análise de outros iões metálicos e os seus complexos com vários compostos pequenos. Será especialmente útil para a análise de complexos formados por outros iões de metais que podem existir em diferentes formas isotópicas.

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Acknowledgments

MN-S reconhece o apoio da National Science Foundation, RUI conceder CHE 1011859. Os autores agradecem a Facilidade Triad Espectrometria de Massa da Universidade de Carolina do Norte em Greensboro para uso do espectrômetro de massa Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Os autores agradecem Daniel Todd, Vincent Sica, e Brandie Erhmann na Universidade da Carolina do Norte em Greensboro para sugestões e comentários sobre este trabalho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

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Um estudo da complexação de mercúrio (II) com Dicysteinyl tetrapéptidos por Espectrometria de Massa de Ionização por Electrospray
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Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

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