Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Исследование комплексообразования ртути (II) с Dicysteinyl тетрапептидов электрораспылительной ионизации масс-спектрометрии

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Примечание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Хлорид ртути является токсичным химическим. Личное защитное оборудование (перчатки, защитные очки и лаборатории пальто) должны носить при передаче ее и все связанные решения. Утилизировать решений в четко обозначенных бутылок химических отходов, предназначенных для тяжелых металлов.

1. Получение 5 мМ формиат аммония дегазированной буфера, рН 7,5

  1. Растворите 0.1576 г формиата аммония буфера в 450 мл воды для ВЭЖХ. Доводят рН указанного выше раствора с 1 М муравьиной кислоты и 1М гидроксидом аммония до 7,5. Передача этого раствора в 500 мл мерную колбу и добавить воду, чтобы ВЭЖХ калибровочной линии, чтобы сделать 5 мМ раствор формиата аммония.
  2. Дегазации 5 мМ формиата аммония буфер под вакуумом системы в течение 10 мин и продувке аргоном. Повторите два раза, и магазин решение в атмосфере аргона. В день применения, фильтруют буферный раствор через 0,2-микронный фильтр BEFORе использование.

2. Подготовка ртути (II) хлорид Solutions

  1. Взвесить 0.2375 г ртути (II), хлорида. Растворите его в 25 мл 5 мМ формиата аммония буфера для получения 0,035 М ртути (II) раствор хлорида.
  2. Добавить 0,214 мл 0,035 М раствора хлорида ртути (II), в 9.785 мл 5 мМ формиата аммония буфера, чтобы создать 7,5 х 10 -4 М раствора. Одеяло на 7,5 х 10 -4 М ртути (II) раствор с газом аргоном.

3. Подготовка CGGC маточного раствора

  1. Растворить 2,0 мг dicysteinyl тетрапептида, CGGC, в 0,118 мл ацетонитрила для ВЭЖХ, а затем добавить 1,0647 мл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфере, который был дегазируют аргоном в получая 5 мм CGGC маточного раствора.
  2. Добавить 225 мкл мМ маточного раствора CGGC 5 до 1275 мкл 5 мМ формирования аммония, рН 7,5 буфер с получением раствора М CGGC 7,5 х 10 -4.

4. Подготовкаиз различных смесей реакции ртути (II) и CGGC

  1. Получение 1: 0,5 соотношение ртути (II) Раствор CGGC
    1. Поместите 255 мкл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 30 мкл 7,5 x10 -4 М раствора хлорида ртути, (II), в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с буфером формиата аммония.
    2. Vortex решение в течение 10 сек. Затем добавить 15 мкл 7,5 х 10 -4 М раствора CGGC в микроцентрифуге 1,5 мл. Vortex решение в течение 10 сек. Пусть решение стоять в течение 10 мин до инъекции в масс-спектрометр.
  2. Получение 1: 1 отношение ртути (II): Раствор CGGC
    1. Поместите 240 мкл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 30 мкл 7,5 x10 -4 М раствора хлорида ртути, (II), в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с буфером формиата аммония.
    2. Vortex решение в течение 10 сек. затемдобавить 30 мкл 7,5 х 10 -4 М раствора CGGC в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Повторите таким же образом, как описано в разделе 4.1.
  3. Получение 1: 2 соотношение ртути (II): Раствор CGGC
    1. Поместите 210 мкл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 30 мкл 7,5 x10 -4 М раствора хлорида ртути, (II), в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с буфером формиата аммония.
    2. Vortex решение в течение 10 сек. Затем добавить 60 мкл 7,5 х 10 -4 М раствора CGGC в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Повторите таким же образом, как описано в разделе 4.1.

5. Подготовка ЦВЕ маточного раствора

  1. Растворите 3,5 мг dicysteinyl тетрапептида, ЦВЕ, в 0,145 мл ацетонитрила для ВЭЖХ, чтобы растворить пептид. Затем добавьте 13,067 мл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер, который был в дегазированной аргона, чтобы произвести 0,5 мМ раствора ЦВЕ.
  2. Vortex решение, пока все пептид не растворится. Добавить 1,125 мл 0,5 мМ раствора ЦВЕС и 0,375 мл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер с 1,5 мл микроцентрифужных трубки с получением раствора х 10 -5 М CEEC 7,5. Вихрь, пока не смешано.

6. Подготовка различных смесей реакции ртути (II) и ЦВЕ решения

  1. Получение 1: 0,5 соотношение ртути (II): ЦВЕС решение
    1. Поместите 255 мкл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 30 мкл 7,5 x10 -4 М раствора хлорида ртути, (II), в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с буфером формиата аммония.
    2. Vortex решение в течение 10 сек. Затем добавить 15 мкл 7,5 х 10 -4 М раствора ЦВЕ в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Повторите таким же образом, как описано в разделе 4.1.
  2. Получение 1: 1 отношение ртути (II) Раствор ЦВЕС
    1. Поместите 24081; л 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 30 мкл 7,5 x10 -4 М раствора хлорида ртути, (II), в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с буфером формиата аммония.
    2. Vortex решение в течение 10 сек. Затем добавить 30 мкл 7,5 х 10 -4 М раствора ЦВЕ в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Повторите таким же образом, как описано в разделе 4.1.
  3. Получение 1: 2 соотношение ртути (II) Раствор ЦВЕС
    1. Поместите 210 мкл 5 мМ формиата аммония, рН 7,5 буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 30 мкл 7,5 x10 -4 М раствора хлорида ртути, (II), в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с буфером формиата аммония.
    2. Vortex решение в течение 10 сек. Затем добавить 60 мкл 7,5 х 10 -4 М раствора ЦВЕ в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Повторите таким же образом, как описано в разделе 4.1.

7. анаЗин реакционных смесей ртути (II) и CGGC образцов Orbitrap ESI масс-спектрометрии

  1. Подготовка масс-спектрометр ESI 16
    1. Draw 100 мкл калибровочных стандартов в стеклянный шприц 500 мкл.
    2. Поместите шприц в шприце колыбели MS насоса, приложите трубку, и ввести в массовое спектрофотометра.
    3. Настройте имя файла для запуска, выбрав значок файла и введите имя файла.
    4. Выберите кнопку данных приобрести в модуле сбора данных и собрать 150 сканирований.
    5. Анализ хроматограмму для проверки калибровочных стандартов, открыв модуль обработки данных программного обеспечения. Откройте модуль, перейдите к меню файла и выберите "открыть", и выберите файл в диалоговом окне. Убедитесь, что пики на хроматограмме коррелируют с массы к заряду отношения стандартам.
    6. Очистите стеклянный шприц 500 мкл путем составления 500 мкл метанола для ВЭЖХ, а затем дозировать мэтанола в химический стакан.
    7. Составьте 500 мкл ВЭЖХ метанолом в стеклянный шприц и промыть систему как при шаге 7.1.2.
    8. Выберите модуль установки метод программного обеспечения, чтобы установить параметры. Выберите меню режима сканирования и идентификации анализатора как FTMS, а затем нажмите кнопку «ОК». Затем, нажав на различных иконок на реальном времени страницы вид спектра, установите следующие параметры: расход газа оболочка: 10, температура Источник: 0, напряжение в капилляре 37 В, трубки линзы: 95 V, спрей напряжение: 4.20 кВ , скорость потока 10.00 мкл / мин, анализатор: FTMS, число сканирований: 150.
  2. Запуск образцы CGGC на ESI масс-спектрометра
    1. Запустите 5 мм формиата аммония рН 7,5 буфер.
      1. Поместите 500 мкл 5 мм формиата аммония буфера в стеклянный шприц 500 мкл, поместите его в шприц колыбели MS насоса и прикрепите трубки.
      2. Запуск буфер через трубку в течение 1-2 мин.
      3. Настройте имя файла для запускавыбрав значок файла и введите имя файла.
      4. Выберите кнопку данных приобрести в модуле и собирать 150 сканирований.
      5. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы остановить сбор после 150 сканирует собираются.
      6. Откройте модуль браузера данных, а затем перейти к меню файл и выберите "Открыть" и выберите файл в диалоговом окне. Убедитесь, что нет пиков при 483, 683, 1163 и 1363 м / г не присутствуют, что напоминают пептид или ртуть (II) -пептидом комплексы.
    2. Запустите 1: 0,5 ртуть (II): CGGC отношение решение.
      1. Поместите 250 мкл 1: 0,5 ртути (II) соотношение CGGC образца в шприц.
      2. Поместите шприц в шприц колыбели MS насоса, приложите трубку, и премьер-аппарат.
      3. Выберите имя файла для запуска, выбрав значок файла и введите имя файла.
      4. Нажмите кнопку получения данных в модуле сбора данных и собрать 150 сканирований и нажмите кнопку Выполнить, чтобы остановить сбор.
      5. Откройте модуль, перейдите к меню файла и выберите "открыть", и выберите файл в диалоговом окне. Убедитесь, что хроматограмма содержит пики в том числе и для только пептида CGGC.
      6. Промыть шприц путем аспирации с 500 мкл буфера формиата аммония и затем раздачи формиат аммония буфер в стакан.
      7. Выберите кнопку отходов на MS и промойте трубки три раза 500 мкл буфера формиат аммония.
      8. Промыть шприц путем аспирации с 500 мкл метанола, а затем метанол дозирования в стакан.
      9. Промойте трубки один раз с 500 мкл метанола.
      10. Выберите кнопку детектора нагрузка на РС.
      11. Добавить 500 мкл буфера формиат аммония в шприц.
      12. Поместите шприц в шприц колыбели MS насоса, приложите трубку, и премьер-аппарат.
      13. Выберите имя файла для буфера запустить, выбрав значок файла и введите имя файла.
      14. Нажмитекнопка данные приобретают и собирать 150 сканирований, а затем нажмите кнопку остановки выполнения.
      15. Откройте модуль браузера данных, перейдите к меню файла и выберите "открыть", и выберите файл в диалоговом окне. Убедитесь, что хроматограмма является недействительным пиков по сравнению с предыдущим рт: CGGC перспективе.
    3. Запустите 1: 1 ртути (II): CGGC отношение решение.
      1. Поместите 250 мкл 1: 1 ртути (II) CGGC соотношение образца в шприц.
      2. Повторите таким же образом, как описано для шага 7.2.2.2 в 7.2.2.15.
    4. Запустите 1: 2 ртуть (II): CGGC отношение решение
      1. Поместите 250 мкл 1: 2 ртути (II) CGGC концентрация образца в шприц.
      2. Повторите таким же образом, как описано для шага 7.2.2.2 в 7.2.2.15.

8. Анализ реакционной смеси ртути и ЦВЕ образцов Orbitrap ESI масс-спектрометрии

  1. Запуск ЦВЕ образцов на ESI масс-спектрометра
    1. Повторите процедуру анализа (Шаги 7.1 до 7,2), используя ЦВЕ образцы и реакционных смесей ртути (II) и в странах ЦВЕ в различных стехиометрических соотношениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Исследование было проведено с целью охарактеризовать возможные ртути пептидный комплекс состава в течение двух тетрапептидов, CGGC и в странах ЦВЕ (рисунок 1) по ESI масс-спектрометрии. Комплексы ртути (II) с CGGC или ЦВЕС были исследованы с помощью реакции смеси ртути (II) и пептидные растворы при трех различных молярных соотношениях: 1: 0,5, 1: 1 и 1: 2 (ртути (II) пептида) , Концентрация ртути (II), 7,5 х 10 -6 М, а концентрация пептида измененные соответственно.

Рисунок 1
Рисунок 1. Dicysteinyl пептидные структуры. Химические структуры dicysteinyl тетрапептидов, CGGC и в странах ЦВЕ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ЛОР "FO: Keep-together.within-странице =" 1 "> фигура 2
Рисунок 2. ESI MS ртути (II) и CGGC ионизацией электрораспылением Orbitrap масс-спектры из раствора, содержащего 7,5 х 10 -6 м Hg2 + в формиат аммония буфере, рН 7,5, содержащего различные Hg 2+:. CGGC стехиометрических отношений: (А ) 1: 0,5 соотношение, (Б) 1: 1, и (С) 1: 2 соотношение. На врезках ртути изотопные модели указанных ртутных-пептид комплексов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. ESI MS ртути (II) и стран ЦВЕ. Ионизация электрораспылением Orbitrap масс-спектры отраствор, содержащий 7,5 х 10 -6 м Hg2 + в формиат аммония буфере, рН 7,5, содержащего различные Hg 2+: ЦВЕ стехиометрические соотношения: (А) 1: 0,5 соотношение, (Б) 1: 1, и (С) 1 : отношение 2. На врезках ртути изотопные модели указанных ртутных-пептид комплексов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Ионизация электрораспылением Orbitrap массовой хроматограммы были собраны для ртути (II) комплекс с CGGC (рисунок 2) и ЦВЕС (рисунок 3) при различных ртути (II), в пептидной стехиометрические соотношения (1: 0,5, 1: 1, и 1: 2). Наблюдаемые ртути пептидный комплекс типа отчетливые пики изотопов ртути, (вставки), которые используются для определения количества ионов ртути в комплексе, а также количество DEPROtonations. Например, 1б вставке показана ртуть изотопный подписи в пептид-ртутной аддукта, который соответствует семи основных естественных изотопов ртути: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 Hg (13,22%), 202 Hg (29,80%), 204 Hg (6,85%), с процентов натуральных содержаний, указанных в скобках. Две основные изотопы 200 Hg и 202 Hg показывают четкое соотношение относительной интенсивности 2,3: 3. Соответственно наиболее интенсивный пик изотопного этом один изотопом ртути кластера представляет моноизотопном массы для аддукта (M / Z = 539). Это коррелирует с двумя-координаты комплекса, который формируется депротонировании двух цистеинил тиолов, чтобы сформировать [(CGGC-2H + Hg) + H] + аддукта. Этот анализ производится следующим образом:

Значение м / з для [(CGGC-2Н + Hg) + H] + является фасаль к (338 - 2 + 202 = +1) 539.

1А вставке показана ртути изотопный подписи в пептид-ртути аддукта, который соответствует два ртути комплекса, рассчитанная с помощью программы ChemCal для [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (Рисунок 4). Теоретический протонированной моноизотопный масса соответствует значению M / Z от 1077.061, что девятый изотопного пика в расчетной изотопного кластера. 1А вставке показаны изотопный пик, соответствующий значению M / Z от 1077.1, который также девятый пик в наблюдаемом изотопного кластера. Таким образом, исходный аддукт для этого изотопного кластера могут быть назначены для [(2CGGC-4Н + 2Hg) + H] +.

Рисунок 4
Рисунок 4. Теоретические модели для изотопные [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + SUP>. Теоретические модели изотопные для [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] +, рассчитанная с помощью программы ChemCal. Стрелка указывает моноизотопных пика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. катионизированных аддукты. Некоторые катионизированные аддукты натрия и калия, связанные с ртутью пептид комплексов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фиг.5 показывает некоторые катионизированные аддукты натриевые и калиевые, связанные с ртутью пептид комплексов, образованных CGGC. Sodiated аддукты 22 массовых единиц больше, тХань соответствующие протонированные комплексы ртути CGGC, в то время как аддукты калия 38 массовых единиц больше. Доминирующим протонированной CGGC димер (м / Z = 677) также образует катионизированных виды с натрием (м / Z = 699) и ионы калия (м / Z = 715). Это еще раз подтверждает формирование CGGC димеров без окисления тиоловых групп цистеинил с образованием дисульфидов, которые бы привели к снижению двух единицах массы для протонированных или катионизированных аддуктов.

Рисунок 6
Рисунок 6. Перекрытие +1 и +2 заряда государства. Перекрытие пиков, связанных с ртутью-пептид ионов [(ЦВЕ-4H + 2Hg) + H] + в +1 и +2 зарядовых состояний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.

Рисунок 7. Теоретические модели изотопные для [(ЦВЕ-4H + 2Hg) + H] +. Теоретические моделей изотопных для [(ЦВЕ-4H + 2Hg) + H] +, рассчитанная с помощью программы ChemCal. Стрелка указывает моноизотопных пика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

На рисунке 6 показан совпадающих вершин, связанных с ртутью ЦВЕ аддуктов в заряда +1 и +2. Это показывает, изотопные пики, связанные с ртутью пептид ионов [(ЦВЕ-4H + 2Hg) + H] + в +1 заряда и значением м / г в 883. Это согласуется с двумя ртути комплекса в расчете на [(ЦВЕ-4H + 2Hg) + Н] + с помощью программы ChemCal (рисунок 7). Теоретическая протонированный моноизотопныймасса соответствует значению м / г в 883.032.

Наблюдаемое выше [(ЦВЕС-4H + 2Hg) + Н] + аддукт с моноизотопном пика 883.03 перекрывается с другом аддукта, содержащего соответствующие пики, показывающие еще ​​0,5 единицы массы. С очень высоким разрешением, достигнутый Orbitrap масс-спектрометрии инструмента, можно утверждать, что эти перекрывающие пики соответствуют аддуктов с зарядом +2. Соответственно, моноизотопном масса перекрытие комплекс ионизуемой может быть рассчитана следующим образом. Рисунок 8 показывает, что разность м / з между изотопных пиков 0,5, а масса разница между ними 1 а.е.м.. Таким образом, государственное обвинение +2. Для расчета массы ртути пептид комплекса, м / г для моноизотопном пика умножается на состояние заряда, и вычитается из массы двух протонов, который сделал комплексный ион положительно заряженный.

Расчеты +2 аддукта:

Разница м / г между изотопным пиков 0,5

Масса разница между изотопным пиков 1 а.е.м. (1 нейтрон)

г = 1 разделить на 0,5 = 2

м / г для протонированного пика моноизотопном является (883,53 х 2) - 2 = 1765,06

Указанное выше значение м / г для протонированного моноизотопном пика, [(2CEEC-8H + 4Hg) + H] +, согласуется с теоретическим значением, рассчитанной программой ChemCal, как 1765.056 (рис 8).

Рисунок 8
Рисунок 8. Теоретическиеизотопные модели для [(2CEEC-8H + 4Hg) + H] +. Теоретические моделей изотопных для [(2CEEC-8H + 4Hg) + H] +, рассчитываемые с помощью программы ChemCal. Стрелка указывает моноизотопных пика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Преимущество анализа ртути-пептид, с масс-спектрометром давал ESI Orbitrap является то, что заряд каждого иона может быть легко назначен как показано выше. Пептиды, содержащие основную аминоконца легко стабилизировать положительные заряды. При использовании ионизации электрораспылением и масс-анализатора с высоким разрешением, таких как Orbitrap, заряда состояния ионов пептидов с более +1 заряда можно определить с большей готовностью по сравнению с более низким разрешением iontrap масс-анализатора.

(фиг.3А и фиг.6), как описано выше, также анализировали с помощью тандемной MS. Это не показали фрагментации MS-MS, в котором указано, что полученные сигналы относятся к ожидаемым соединения, как описано выше, и не группируются артефакты, образованные при более высоких концентрациях ртуть в-пептид соотношениях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Гидрофобный dicysteinyl тетрапептид CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; ММ = 338) (рис 1), образует комплексы с ртутью (II), как показано на рисунке 2 и в таблице 1 Кроме того, она образует пептидные димеры и тримеры. порядке возрастания, как количество пептида увеличивается в реакционной смеси. Как показано значений M / Z ассоциированных димеров [(2M + Н) + = 677] и тримеров [(3M + Н) + = 1 015], тиоловые группы CGGC не окисляется с образованием дисульфидов в условиях эксперимента , Формирование этих ассоциированных видов CGGC может быть связано с гидрофобностью этой тетрапептида. CGGC образует два типа комплексов с ртутью, соответствующих 1: 1 ртути (II) пептида и 1: 2 ртути (II), пептид) :( 2 комплекса, как сообщалось ранее для dicysteinyl трипептидов 7. Тем не менее, в присутствии избытка или эквивалентного ртути (II), он также FORMS 2: 2 [ртути (II)] 2: (пептид) 2 комплекс.

Карбоксилированный dicysteinyl Тетрапептид ЦВЕ (С 16 Н 26 N 4 O 9 S 2; МВт = 482) (рис 1) образуют комплексы с ртутью (II), как показано на рисунке 3 и в таблице 1 Это не образуют ЦВЕ димеры, как легко, как. соблюдайте для более гидрофобной CGGC. Сопоставимые CGGC, он образует комплексы с ртутью, соответствующий 1: 1 ртути (II) пептида и 1: 2 ртути (II), :( пептид) 2 комплексов. Тем не менее, со вспомогательными карбоксилатных групп, она образует 2: 2 [ртути (II)] 2: (пептид) 2 комплекс легче. Кроме того, в избытке ртути, она образует 2: 1 [ртути (II)] 2: пептидный комплекс и 4: 2 [ртути (II)] 4: (пептид) 2 пептидный комплекс, который не наблюдались CGGC.

Резюме наблюдаемых сигналов для комплексов Formed качестве значения M / Z приведены в таблице 1.

Таблица 1

Таблица 1. Резюме ртути-пептид комплексов сигналов. Меркурий-пептидные комплексы сигналов в хроматограмм LTQ / Orbitrap MS в формиата аммония буфера, рН 7,5.

Мы показали, что реакция ртути (II) и двух dicysteinyl тетрапептидов образовывать комплексы, которые зависят от начальных коэффициентов ртути (II): пептида, а также наличием дополнительных связующих групп в dicysteinyl тетрапептида. Кроме того, точное стехиометрическое ртути и пептида в образующихся комплексов при определенных условиях ионизации электрораспылением может быть определена с помощью высокого разрешения ESI масс-спектрометрии на основании отличие ртути шаблонов изотопное распределение.

В реакции цистеинил PeptIDEs с ртутью (II), следует соблюдать меры предосторожности, чтобы предотвратить окисление тиоловых групп цистеинилового чтобы образования дисульфидных связей. В описанном протокола, буферные растворы были тщательно дегазировали и хранили в атмосфере аргона. Кроме того, все образцы реакции готовили непосредственно перед анализом по ESI масс-спектрометрии.

Из-за различий в растворимости между двумя тетрапептидов, ЦВЕ и CGGC различные концентрации были использованы для получения исходных растворов. Морозильник запас CGGC пептида смачивали ацетонитриле и легко растворяется с последующим 5 мМ формиата аммония буфере, рН 7,5 с получением раствора х 10 -4 М CGGC 7,5. СЦВЕ был приготовлен при более низкой концентрации, 7,5 х 10 -5 М, до ртути (II) пептидные шаги реакционной смеси из-за его низкой растворимости. Оптимальное разбавление для анализа ртути (II) было сочтено 10 -5 М, из-за растворимости пептида и позволитьдля удаления остатков в масс-спектрометре. В договоре на решения CGGC, ЦВЕ остатки придерживаться трубки, что требует замены иногда труб.

Значение помощью масс-спектрометрии ESI для анализа ртути-пептид состоит в своей мягкой ионизации аналитов. Это облегчает анализ молекулярных ионов с незначительной фрагментации. Как показано в этой работе, он может быть использован для характеристики стехиометрии ртути-пептид комплексов на основе подписи ртути схем распределения изотопного. Однако летучие буферная система необходима для анализа с помощью масс-спектрометрии ESI. Это может ограничить его практическое использование для идентификации анализируемых, которые требуют меньше летучих растворителей или буферные носители для растворения.

Как мы уже упоминалось ранее 7,8, ESI масс-спектрометрии обеспечивает чувствительный аналитический инструмент для точного определения стехиометрии ртути и PeptIDE в ртутных-пептид, в соответствии с указанным условием электрораспылением ионизацией. Тем не менее, необходимо использовать дополнительные методы (например, 1 Н, 13 С, 199 рт.ст. ЯМР-спектроскопии, поглощение тонкой структуры расширен рентгеновского или потенциометрия 17-18), чтобы обеспечить более точное определение содержания комплексов в решение.

Мы показали, что ESI с Orbitrap масс-анализатора может быть использована для анализа ртути-пептид,. Мы ожидаем, что этот метод может быть применен к анализу других ионов металлов и их комплексов с различными небольшими соединений. Это будет особенно полезно для анализа комплексов, образованных другими ионами металлов, которые могут существовать в различных формах изотопных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S подтверждает поддержку от Национального научного фонда, Руи предоставить CHE 1011859. Авторы выражают благодарность Триада масс-спектрометрии фонд в Университете Северной Каролины в Гринсборо для использования масс-спектрометра Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Авторы выражают благодарность Даниэль Тодд, Винсент Сика, и Brandie Erhmann в университете Северной Каролины в Гринсборо за полезные комментарии и предложения по этой работе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

Химия выпуск 107 Меркурий-пептидные комплексы ртуть изотопные пики масс-спектрометрия ESI MS цистиновый пептиды
Исследование комплексообразования ртути (II) с Dicysteinyl тетрапептидов электрораспылительной ионизации масс-спектрометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter