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Chemistry

Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Nota: Por favor consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Cloruro de mercurio es una sustancia química tóxica. Equipo de protección personal (guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio) deben ser usados ​​cuando entregarlo y todas las soluciones asociadas. Deshágase de las soluciones en botellas de residuos químicos etiquetados claramente designadas para los metales pesados.

1. Preparación de 5 mM desgasificado formiato de amonio Buffer, pH 7,5

  1. Disolver 0,1576 g de tampón de formiato de amonio en 450 ml de agua de grado HPLC. Ajustar el pH de la solución anterior con 1 M de ácido fórmico y de hidróxido de amonio 1 M a 7,5. Transferir dicha solución a un matraz aforado de 500 ml y añadir agua HPLC a la línea de calibración para hacer una solución de formiato de amonio 5 mM.
  2. Desgasificar la 5 mM de tampón de formiato de amonio en virtud de un sistema de vacío durante 10 min y purga con argón. Repetir dos veces y solución de tienda bajo argón. En el día de uso, filtrar la solución tampón a través de un filtro de 0,2 micras se acabene uso.

2. Preparación de mercurio (II) Cloruro de Soluciones

  1. Pesar 0,2375 g de mercurio (II). Disolver en 25 ml de tampón de formiato de amonio 5 mM para producir una (II) solución de cloruro de 0.035 M mercurio.
  2. Añadir 0,214 ml de solución 0,035 M de mercurio (II) cloruro de 9.785 ml de 5 mM de tampón de formiato de amonio para crear una solución 7,5 x 10 -4 M. Manta la solución 7,5 x 10 -4 M de mercurio (II) con gas argón.

3. Preparación de CGGC de la Solución

  1. Disolver 2,0 mg del tetrapéptido dicysteinyl, CGGC, en 0.118 ml de acetonitrilo de grado HPLC y luego añadir 1,0647 ml de formiato de amonio 5 mM, pH 7,5 tampón que ha sido desgasificado en argón para dar una solución madre 5 mM CGGC.
  2. Añadir 225 l de la solución madre 5 mM CGGC a 1.275 l de 5 mM formación de amonio pH 7,5 tampón para dar una solución M CGGC 7,5 x 10 -4.

4. Preparaciónde diversas mezclas de reacción de mercurio (II) y CGGC

  1. Preparación de 1: 0,5 proporción de mercurio (II): solución CGGC
    1. Coloque de 255 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 15 l de 7,5 x 10 -4 M solución CGGC en el microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex la solución durante 10 s. Dejar reposar la solución durante 10 min antes de la inyección en el espectrómetro de masas.
  2. Preparación de 1: 1 relación de mercurio (II): solución CGGC
    1. Coloque 240 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. entoncesañadir 30 l de 7,5 x 10 -4 M CGGC solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.
  3. Preparación de 1: 2 proporción de mercurio (II): solución CGGC
    1. Coloque 210 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 60 l de 7,5 x 10 -4 M CGGC solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.

5. Preparación de PECO Stock Solución

  1. Disolver 3,5 mg del tetrapéptido dicysteinyl, PECO, en 0.145 ml de acetonitrilo de grado HPLC para disolver el péptido. A continuación, añadir 13.067 ml de formiato de amonio 5 mM, pH 7,5 tampón que ha sido desgasificado en argón para producir 0,5 mSolución M PECO.
  2. Vortex la solución hasta que se disuelva todo péptido. Añadir 1,125 ml de 0,5 mM solución PECO y 0,375 ml de 5 mM de formiato de amonio, pH 7,5 tampón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para dar una solución x 10 -5 M PECO 7.5. Vortex hasta que se mezcle.

6. Preparación de diversas mezclas de reacción de mercurio (II) y la solución PECO

  1. Preparación de 1: 0,5 proporción de mercurio (II): solución de PECO
    1. Coloque de 255 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 15 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.
  2. Preparación de 1: 1 relación de mercurio (II): solución de PECO
    1. Coloque 24081; l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 30 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.
  3. Preparación de 1: 2 proporción de mercurio (II): solución de PECO
    1. Coloque 210 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio.
    2. Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 60 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1.

7. Analyzing las mezclas de reacción de mercurio (II) y muestras CGGC por espectrometría de masas ESI Orbitrap

  1. Preparar el espectrómetro de masas ESI 16
    1. Dibuje 100 l de estándares de calibración en una jeringa de vidrio de 500 l.
    2. Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, e inyectar en el espectrofotómetro de masas.
    3. Configure el nombre de archivo para la carrera seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
    4. Seleccione el botón de datos adquieren en el módulo de adquisición de datos y recoger 150 exploraciones.
    5. Analizar el cromatograma para verificar los estándares de calibración mediante la apertura del módulo de procesamiento de datos del software. Abra el módulo, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Compruebe que los picos en el cromatograma se correlacionan con la masa para cargar proporciones de los estándares.
    6. Limpie la jeringa de vidrio de 500 l mediante la elaboración de 500 l de metanol grado HPLC y luego distribuir el metanol en un vaso de precipitados.
    7. Elaborar 500 l de metanol grado HPLC en la jeringa de vidrio y limpiar el sistema como en el paso 7.1.2.
    8. Seleccione el módulo de configuración de métodos de software para ajustar los parámetros. Seleccione el menú de modo de exploración e identificar el analizador como FTMS, y luego haga clic en "Aceptar". A continuación, haga clic en los varios iconos en la página de vista de espectro en tiempo real, establecer los siguientes parámetros: Envoltura caudal de gas: 10, la temperatura Fuente: 0, la tensión capilar: 37 V, lente del tubo: 95 V, el voltaje de pulverización: 4,20 kV , caudal 10,00 l / min, Analizador: FTMS, Número de exploraciones: 150.
  2. Ejecución de muestras CGGC en ESI espectrómetro de masas
    1. Ejecutar el formiato de amonio, pH 7,5 5 mM.
      1. Coloque 500 l de tampón de formiato de amonio 5 mM en la jeringa de vidrio de 500 l, colocarlo en el soporte de jeringa de la bomba de la EM, y conecte el tubo.
      2. Ejecutar tampón a través del tubo durante 1-2 min.
      3. Configure el nombre de archivo para la carreraseleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
      4. Seleccione el botón de datos adquieren en el módulo y recoger 150 exploraciones.
      5. Haga clic en el botón de ejecución para detener colección después se recogen 150 exploraciones.
      6. Abra el módulo explorador de datos, a continuación, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que no hay picos a 483, 683, 1.163 y 1.363 m / z están presentes que se asemejan al péptido o mercurio (II) -péptido.
    2. Ejecute el 1: 0,5 de mercurio (II): Solución relación CGGC.
      1. Colocar 250 ml de 1: 0,5 de mercurio (II): relación CGGC de la muestra en la jeringa.
      2. Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, y el primer aparato.
      3. Seleccione un nombre de archivo para la carrera seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
      4. Pulse el botón de datos adquieren en el módulo de adquisición de datos y recoger 150 exploraciones y haga clic en el botón de ejecución para detener la colección.
      5. Abra el módulo, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que el cromatograma contiene picos incluyendo el uno para el péptido CGGC solo.
      6. Lavar la jeringa mediante la aspiración con 500 l de tampón formiato de amonio y luego dispensar el tampón de formiato amónico en un vaso de precipitados.
      7. Seleccione el botón de residuos en la MS y lave el tubo tres veces con tampón de formiato amónico 500 l.
      8. Lavar la jeringa mediante la aspiración con 500 l de metanol y luego dispensar el metanol en un vaso de precipitados.
      9. Enjuague bien el tubo una vez con 500 l de metanol.
      10. Seleccione el botón detector de carga en la MS.
      11. Añadir 500 l de tampón de formiato de amonio a la jeringa.
      12. Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, y el primer aparato.
      13. Seleccione un nombre de archivo para la memoria intermedia de ejecutar seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo.
      14. oprimael botón y datos adquieren recoger 150 exploraciones y luego haga clic en el botón de parada de ejecución.
      15. Abra el módulo de datos del navegador, vaya al menú Archivo y seleccione "Abrir" y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que el cromatograma es nula de los picos de los últimos Hg: run CGGC.
    3. Ejecute el 1: 1 de mercurio (II): Solución relación CGGC.
      1. Colocar 250 ml de 1: 1 de mercurio (II): relación CGGC muestra en la jeringa.
      2. Repita de una manera similar a la descrita para los pasos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.
    4. Ejecute el 1: 2 de mercurio (II): Solución relación CGGC
      1. Colocar 250 ml de 1: 2 de mercurio (II): CGGC muestra la concentración en la jeringa.
      2. Repita de una manera similar a la descrita para los pasos 7.2.2.2 a 7.2.2.15.

8. Analizar las mezclas de reacción de Mercurio y muestras de los PECO por Orbitrap ESI Espectrometría de Masas

  1. Ejecución de las muestras de los PECO en ESI espectrómetro de masas
    1. Repita el procedimiento de análisis (Pasos 7.1 a 7.2), utilizando muestras de los PECO y las mezclas de reacción de mercurio (II) y los PECO en diversas proporciones estequiométricas.

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Representative Results

Se realizó un estudio para caracterizar la posible composición compleja de mercurio de péptido durante dos tetrapéptidos, CGGC y PECO (Figura 1) por espectrometría de masas ESI. Los complejos de mercurio (II) con CGGC o PECO se investigaron mediante la reacción de las mezclas de mercurio (II) y soluciones de péptidos en tres proporciones diferentes molares: 1: 0,5, 1: 1 y 1: 2 (mercurio (II): péptido) . La concentración de mercurio (II) fue de 7,5 x 10 -6 M y la concentración de péptido variarse en consecuencia.

Figura 1
Figura 1. estructuras peptídicas Dicysteinyl. Las estructuras químicas de los tetrapéptidos dicysteinyl, CGGC y PECO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 2
Figura 2. ESI MS de mercurio (II) y CGGC electrospray orbitrap espectros de masas de ionización a partir de una solución que contiene 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ en tampón de formiato de amonio, pH 7,5 que contiene variando Hg 2+:. CGGC relaciones estequiométricas: (A ) 1: 0,5 ratio, (B) 1: 1, y (C) 1: 2. El recuadro muestra los patrones isotópicos de mercurio de los complejos péptido-mercurio indicados. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. ESI MS de mercurio (II) y PECO. Los espectros de masas de ionización electrospray de orbitrapuna solución que contiene 7,5 x 10 -6 M Hg 2+ en tampón de formiato de amonio, pH 7,5 que contiene variando Hg 2+: relaciones estequiométricas PECO: (A) 1: 0,5 ratio, (B) 1: 1, y (C) 1 : 2. El recuadro muestra los patrones isotópicos de mercurio de los complejos péptido-mercurio indicados. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Electropulverización cromatogramas de masas Orbitrap ionización se recogieron para el mercurio (II) complejante con CGGC (Figura 2) y PECO (Figura 3) a distintas mercurio (II) al péptido relaciones estequiométricas (1: 0,5, 1: 1, y 1: 2). Los tipos de complejos péptido-mercurio observados muestran distintos picos isotópicos mercurio (inserciones), que se utilizan para determinar el número de iones de mercurio en el complejo, así como el número de DEPROtonations. Por ejemplo, inserción Figura 1b muestra la firma isotópica de mercurio en el aducto péptido-mercurio, que corresponde a los siete principales isótopos naturales de mercurio: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) , 200 Hg (23,13%), 201 de Hg (13,22%), 202 de Hg (29,80%), 204 de Hg (6,85%), con abundancias naturales por ciento indicadas entre paréntesis. Los dos principales isótopos 200 y 202 de Hg Hg muestran una relación de intensidad relativa distinta de 2,3: 3. De acuerdo con el pico más intenso isotópica de este cúmulo de isótopos de una sola mercurio constituye la masa monoisotópica para el aducto (m / z = 539). Se correlaciona con una de dos coordenadas complejo, que está formado por la desprotonación de dos tioles cisteinil para formar el [(CGGC-2H + Hg) + H] + aducto. Este análisis se realiza de la siguiente manera:

valor m / z para [(CGGC-2H + Hg) + H] + es equAl a (338 - 2 + 202 1) = 539.

Inserción Figura 1A muestra la firma isotópica de mercurio en el aducto péptido-mercurio, que corresponde a un complejo de dos mercurio tal como se calcula mediante el programa para chemcal [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (Figura 4). La masa monoisotópica protonada teórica corresponde a un valor m / z de 1.077,061, que es el pico isotópica noveno en el clúster isotópica calculada. Inserción Figura 1A muestra un pico isotópica correspondiente a un valor m / z de 1077,1, que es también el noveno pico en el cluster isotópico observado. Por lo tanto, el aducto originarios para esta clúster isotópica se puede asignar para [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] +.

Figura 4
Figura 4. patrones isotópicos teóricas para [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + sup>. Los patrones isotópicos teóricas para [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] +, calculado mediante el programa chemcal. La flecha indica el pico monoisotópico. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. aductos cationizada. Algunos aductos de sodio y potasio cationizados asociados con los complejos péptido-mercurio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 5 muestra algunos aductos de sodio y potasio cationizada asociados con los complejos de mercurio péptido formados por CGGC. Aductos Sodiated son 22 unidades de masa más grande tHan complejos del mercurio CGGC protonadas correspondientes, mientras que los aductos de potasio son 38 unidades de masa más grandes. El dímero CGGC protonada dominante (m / z = 677) también forma cationizadas con especies de sodio (m / z = 699) y los iones de potasio (m / z = 715). Esto confirma adicionalmente la formación de dímeros CGGC sin la oxidación de los grupos tiol de cisteinilo para formar disulfuros, lo que habría dado lugar a una disminución de dos unidades de masa para los aductos protonadas o cationizados.

Figura 6
Figura 6. La superposición de 1 y 2 de carga estados. La superposición de picos asociados con iones de mercurio péptido [(PECO-4H + 2HG) + H] + en los +1 y +2 estados de carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

"Figura Figura 7. patrones isotópicos teóricas para [(PECO-4H + 2Hg) + H] +. Los patrones isotópicos teóricas para [(PECO-4H + 2Hg) + H] +, calculado mediante el programa chemcal. La flecha indica el pico monoisotópico. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 6 muestra picos asociados con aductos de mercurio PECO en la carga 1 y 2 superpuestas. Se muestra picos isotópicos que se asocian con los iones de mercurio péptido [(PECO-4H + 2HG) + H] + 1 en el cargo y un valor de m / z de 883. Esto está de acuerdo con un complejo de dos mercurio como calculado para [(PECO-4H + 2Hg) + H] + utilizando el programa chemcal (Figura 7). El monoisotópico protonada teóricomasa corresponde a un valor m / z de 883.032.

Lo anterior observado [(PECO-4H + 2Hg) + H] + aducto con un pico de 883,03 monoisotopic se solapa con otro aducto que contiene picos correspondientes que muestran un adicional de 0,5 unidades de masa. Con la extremadamente alta resolución alcanzada por el instrumento de espectrometría de masas orbitrap, se puede postular que estos picos corresponden a la superposición de aductos con una carga de 2. En consecuencia, la masa monoisotópica de la superposición compleja de ser ionizado se puede calcular de la siguiente manera. La Figura 8 muestra que la diferencia m / z entre los picos isotópicos es 0,5 y la diferencia de masa entre ellos es 1 amu. Por lo tanto, el estado de carga es 2. Para calcular la masa del complejo péptido-mercurio, el m / z para el pico monoisotopic se multiplica por el estado de carga, y se resta de la masa de dos protones, lo que hizo que el ion complejo cargado positivamente.

Los cálculos para el 2 aducto:

diferencia m / z entre los picos isotópicos es 0.5

Diferencia de masa entre los picos isotópicos es 1 amu (1 neutrón)

z = 1 dividir por 0,5 = 2

m / z para el pico monoisotópico protonada es (883,53 x 2) - 2 = 1.765,06

El valor m / z anteriormente para el pico monoisotopic protonada, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, es consistente con el valor teórico calculado por el programa chemcal como 1765.056 (Figura 8).

Figura 8
Figura 8. Teóricapatrones isotópicos para [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. Los patrones isotópicos teóricas para [(2CEEC-8H + 4HG) + H] + calculados utilizando el programa chemcal. La flecha indica el pico monoisotópico. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La ventaja de analizar los complejos de mercurio péptido con un espectrómetro de masas ESI orbitrap es que la carga de cada ion se puede asignar fácilmente como se muestra arriba. Los péptidos que contienen amino-terminal básico puede estabilizar fácilmente cargas positivas. Cuando se utiliza ionización por electrospray y un analizador de masas de alta resolución tales como el orbitrap, el estado de carga de los iones de péptidos con mayor que 1 carga se puede determinar más fácilmente en comparación con la resolución más baja iontrap analizador de masas.

(Figura 3A y Figura 6), como se describió anteriormente, también se analizaron mediante MS en tándem. No mostró ninguna fragmentación MS-MS, que indicó que las señales obtenidas pertenecen al compuesto esperado como se discutió anteriormente, y no se agrupan los artefactos formados a mayores concentraciones de mercurio-péptido a ratios.

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Discussion

El tetrapéptido dicysteinyl hidrófobo CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW = 338) (Figura 1), forma complejos con mercurio (II) como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 1 Además, forma dímeros peptídicos y trímeros. incremental a medida que la cantidad de péptido aumentos en la mezcla de reacción. Como se muestra por los valores de m / z de los dímeros asociados [(2M + H) + = 677] y trímeros [(3M + H) + = 1,015], los grupos tiol de CGGC no se oxida para formar disulfuros en las condiciones experimentales . La formación de estas especies CGGC asociados podría ser debido a la hidrofobicidad de este tetrapéptido. CGGC forma dos tipos de complejos con mercurio correspondientes a 1: 1 de mercurio (II): péptido y 1: 2 de mercurio (II) :( 2) péptido complejos como se informó anteriormente para tripéptidos dicysteinyl 7. Sin embargo, en presencia de un exceso de mercurio o equivalente (II), también forms un 2: 2 [mercurio (II)] 2: (péptido) 2 compleja.

El tetrapéptido dicysteinyl carboxilado PECO (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482) (figura 1) forman complejos con mercurio (II) como se muestra en la Figura 3 y la Tabla 1 no formaba dímeros PECO tan fácilmente como. que observan para los más hidrofóbica CGGC. Comparable a CGGC, forma complejos con el mercurio que corresponde a 1: 1 de mercurio (II): péptido y 1: 2 de mercurio (II) :( péptido) 2 complejos. Sin embargo, con los grupos carboxilato auxiliares, forma el 2: 2 [mercurio (II)] 2: (péptido) 2 complejo más fácilmente. Además, en exceso de mercurio, forma el 2: 1 [mercurio (II)] 2: péptido complejo y el 4: 2 [mercurio (II)] 4: (péptido) 2 complejo de péptido, que no se observó para CGGC.

El resumen de las señales observadas para los complejos formed como valores de m / z se muestran en la Tabla 1.

Mesa 1

Tabla 1. Resumen de los complejos de señales de mercurio péptido complejos señales Mercurio-péptido en los cromatogramas LTQ / Orbitrap MS en tampón de formiato de amonio, pH 7,5..

Hemos demostrado que la reacción de mercurio (II) y dos tetrapéptidos dicysteinyl formar complejos que dependen de las proporciones iniciales de mercurio (II): péptido así como la presencia de grupos de unión auxiliares en el tetrapéptido dicysteinyl. Por otra parte, la estequiometría exacta de mercurio y el péptido en los complejos formados en condiciones de ionización por electrospray específicos se puede determinar mediante el uso de alta resolución ESI espectrometría de masas basado en los patrones de distribución isotópica distinta de mercurio.

Al reaccionar Pept cisteinilides con mercurio (II), se deben tomar precauciones para evitar la oxidación de los grupos tiol cisteinil para formar enlaces disulfuro. Dentro del protocolo descrito, las soluciones tampón fueron cuidadosamente desgasificaron y se almacenan en atmósfera de argón. Además, todas las muestras de reacción se preparan inmediatamente antes del análisis por espectrometría de masas ESI.

Debido a las diferencias de solubilidad entre los dos tetrapéptidos, PECO y CGGC, se utilizaron diferentes concentraciones para preparar las soluciones madre. El congelador de stock de péptido CGGC se humedeció con acetonitrilo y se disuelve fácilmente seguido por 5 mM de tampón de formiato de amonio, pH 7,5 para producir una solución x 10 -4 M CGGC 7.5. El PECO se preparó a una concentración más baja, 7,5 x 10 -5 M, antes de la mercurio (II): pasos de péptidos mezcla de reacción debido a su menor solubilidad. La dilución óptima para analizar el mercurio complejos (II) se consideró que era 10 -5 M debido a la solubilidad del péptido y para permitirpara la eliminación de residuos en el espectrómetro de masas. En contrato para las soluciones CGGC, los residuos de los PECO se adhieren a la tubería, lo que requiere el reemplazo de tubos ocasional.

La importancia de la utilización de espectrometría de masas ESI para el análisis de los complejos de péptido-mercurio se encuentra en su suave ionización de analitos. Esto facilita el análisis de los iones moleculares con la fragmentación insignificante. Como se muestra en este trabajo, que puede ser utilizado para caracterizar las estequiometrías de los complejos de péptido-mercurio en base a los patrones de distribución isotópica firma de mercurio. Sin embargo, un sistema tampón volátil es necesaria para el análisis por espectrometría de masas ESI. Esto puede limitar su uso práctico para la identificación de analitos que requieren disolventes menos volátiles o medios de almacenamiento en búfer para la disolución.

Como ya hemos mencionado 7,8, ESI espectrometría de masas proporciona una herramienta analítica sensible para una determinación precisa de la estequiometría de mercurio y Peptide en los complejos péptido-mercurio en el marco del estado de ionización electrospray especificado. Sin embargo, es necesario utilizar métodos adicionales (por ejemplo, 1 H, 13 C, espectroscopia NMR 199 Hg, estructura fina de absorción de rayos X extendida, o potenciometría 17-18) para proporcionar una determinación más precisa del contenido de los complejos en solución.

Hemos demostrado que la ESI con un analizador de masas orbitrap se puede utilizar para analizar los complejos de péptido-mercurio. Esperamos que esta técnica se puede aplicar hacia el análisis de otros iones metálicos y sus complejos con diversos compuestos pequeños. Será especialmente útil para el análisis de complejos formados por otros iones metálicos que pueden existir en diferentes formas isotópicas.

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Acknowledgments

MN-S reconoce el apoyo de la National Science Foundation, RUI conceder CHE 1011859. Los autores agradecen el Fondo Tríada Espectrometría de Masas de la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro para el uso del espectrómetro de masas Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Los autores agradecen a Daniel Todd, Vincent Sica y Brandie Erhmann en la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro para sugerencias y comentarios útiles con respecto a este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

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Química Número 107 complejos Mercurio en péptidos picos isotópicos mercurio espectrometría de masas ESI MS péptidos cisteinil
Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización
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Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

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