Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Elektrosprey İyonizasyon kütle spektrometresi ile Dicysteinyl tetrapeptidlerle ile Merkür (II) kompleksinin Bir Çalışma

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53536
Automatic Translation
1, 2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of North Carolina at Greensboro, 2Department of Chemistry, Winston-Salem State University

Protocol

Not: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) danışın. Cıva klorür toksik bir kimyasaldır. Onu ve ilgili tüm çözümleri teslim sırasında Kişisel koruyucu ekipmanlar (eldivenler, emniyet gözlükleri ve laboratuvar önlüğü) giyilmelidir. Ağır metaller için belirlenen açıkça etiketlenmiş kimyasal atık şişelerde çözümler atınız.

1. Hazırlık 5 mM gazı alınmış Amonyum format tamponu, pH 7.5

  1. HPLC dereceli su 450 ml amonyum format tamponu 0,1576 g çözündürülür. 1 M formik asit ve 7.5 1 M amonyum hidroksit ile, yukarıda çözeltinin pH ayarlayın. 500 ml'lik bir ölçülü balona bu çözüm aktarın ve 5 mM amonyum format çözeltisinin yapılması için bir kalibrasyon hattına HPLC su ilave edilir.
  2. Argon ile 10 dakika karıştırıldı ve tasfiye için bir vakum sistemi ile 5 mM amonyum format tamponu gaz çıkışına. İki kez tekrarlayın ve argon altında mağaza çözüm. Kullanılacağı gün, bir 0.2 mikron filtre befor ile tampon çözeltisi filtree kullanımı.

Civa (II) klorür çözeltisi 2. Hazırlık

  1. 0,2375 g cıva (II) klorür tartılır. 0.035 M cıva (II) klorid solüsyonu elde etmek için 5 mM amonyum format tamponu, 25 ml içinde çözülür.
  2. Bir 7.5 x 10 -4 M çözelti oluşturmak için 9,785 ml 5 mM amonyum format tampon 0.214 mi, 0.035 M cıva (II) klorür solüsyonu ekleyin. Argon gazı ile 7.5 x 10 -4 M cıva (II) çözeltisi battaniye.

CGGC Stok Çözeltisinin Hazırlanması 3.

  1. HPLC dereceli asetonitril 0.118 ml dicysteinyl tetrapeptid, CGGC 2.0 mg, çözülür ve daha sonra 1,0647 ml 5 mM amonyum format, pH'ı 5 mM CGGC stok çözeltisi oluşturacak şekilde argon gazı alınmış olan 7,5 tamponu ilave edin.
  2. 5 mM amonyum oluşumu pH 1275 ul bir 7.5 x 10 -4 M CGGC çözelti vermek üzere 7.5 tampon, 5 mM CGGC stok çözeltisi 225 ul ekle.

4. HazırlıkCıva '(II) ve CGGC çeşitli Reaksiyon Karışımlarının

  1. 1 Hazırlanması: civanın 0.5 oranı (II): CGGC çözeltisi
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 5 mM amonyum format, pH 7,5 tampon 255 ul koyun. Amonyum format tamponu ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7,5 x 10 -4 M cıva (II) klorür solüsyonu 30 ul ekle.
    2. 10 saniye için çözüm karıştırın. Sonra 1.5 ml mikrosantrifüj içine 7.5 x 10 -4 M CGGC solüsyonu 15 ul ekleyin. 10 saniye için çözüm karıştırın. Çözelti kütle spektrometresi içine enjeksiyondan önce 10 dakika boyunca bekletin.
  2. Cıva 1 oranında, (II): 1 hazırlanması CGGC çözeltisi
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 5 mM amonyum format, pH 7,5 tampon 240 ul koyun. Amonyum format tamponu ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7,5 x 10 -4 M cıva (II) klorür solüsyonu 30 ul ekle.
    2. 10 saniye için çözüm karıştırın. Daha sonra1,5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7.5 x 10 -4 M CGGC çözeltisi 30 ul ekle. Bölüm 4.1'de tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.
  3. Cıva 2 oranında (II): 1 hazırlanması CGGC çözeltisi
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 5 mM amonyum format, pH 7,5 tampon 210 ul koyun. Amonyum format tamponu ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7,5 x 10 -4 M cıva (II) klorür solüsyonu 30 ul ekle.
    2. 10 saniye için çözüm karıştırın. Daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7.5 x 10 -4 M CGGC çözeltisi 60 ul ekle. Bölüm 4.1'de tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.

CEEC Stok Çözeltisinin Hazırlanması 5.

  1. Peptidi eritmek için HPLC dereceli asetonitril 0.145 ml dicysteinyl tetrapeptid, ODAÜ 3.5 mg, eritin. Daha sonra 13,067 mi, 5 mM amonyum format ilave pH argon gazı alınmış olan 7,5 tamponu 0.5 m üretmekM CEEC çözüm.
  2. Tüm peptid çözünene kadar çözelti vorteksleyin. Bir 7.5 x 10 5 M CEEC çözeltisi vermek üzere bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, pH 7,5 tampon çözelti, 1.125 mi CEEC 0,5 mM ilave edin ve 0,375 mi mM 5 amonyum format. Vortex karışık kadar.

Cıva '(II) ve CEEC Çözüm çeşitli Reaksiyon karışımları 6. hazırlanması

  1. 1 preparasyonu: cıva (II) 0,5 oranı: CEEC Çözelti
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 5 mM amonyum format, pH 7,5 tampon 255 ul koyun. Amonyum format tamponu ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7,5 x 10 -4 M cıva (II) klorür solüsyonu 30 ul ekle.
    2. 10 saniye için çözüm karıştırın. Daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7.5 x 10 -4 M CEEC çözeltisi 15 ul ekle. Bölüm 4.1'de tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.
  2. Civa (II): 1 oranında 1 hazırlanması CEEC çözeltisi
    1. 240 koyun81; 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 5 mM amonyum format, pH 7.5 tamponu. Amonyum format tamponu ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7,5 x 10 -4 M cıva (II) klorür solüsyonu 30 ul ekle.
    2. 10 saniye için çözüm karıştırın. Daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7.5 x 10 -4 M CEEC çözeltisi 30 ul ekle. Bölüm 4.1'de tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.
  3. Civa (II) 2 oranı: 1 hazırlanması CEEC çözeltisi
    1. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 5 mM amonyum format, pH 7,5 tampon 210 ul koyun. Amonyum format tamponu ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7,5 x 10 -4 M cıva (II) klorür solüsyonu 30 ul ekle.
    2. 10 saniye için çözüm karıştırın. Daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine 7.5 x 10 -4 M CEEC çözeltisi 60 ul ekle. Bölüm 4.1'de tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.

7. AnalyOrbitrap ESI kütle spektrometresi ile cıva (II) ve CGGC Örneklerinde Reaksiyon karışımları hareketlendirmek

  1. ESI kütle spektrometresi 16 Hazırlanması
    1. 500 ul cam şırıngaya kalibrasyon standartları 100 ul çizin.
    2. MS pompa enjektör beşiği şırınga yerleştirin tüp takmak ve kitle spektrofotometre içine enjekte edilir.
    3. Dosya simgesini seçip dosya adını yazarak çalıştırmak için dosya adını ayarlayın.
    4. Veri toplama modülü acquire veri düğmesini seçin ve 150 taramaları toplamak.
    5. Yazılımın veri işleme modülü açarak kalibrasyon standartları doğrulamak için kromatogram analiz edin. Modülü açın, menü dosya gidin ve "açık" seçeneğini seçin ve iletişim kutusunda dosyayı seçin. Kromatogramda zirveleri standartları oranları şarj etmek için kitle ilişkili olduğunu doğrulayın.
    6. 500 ul HPLC dereceli metanol yukarı çizerek 500 ul cam şırınga temizleyin ve sonra m dağıtmakBir beher içine etanol.
    7. Cam şırınga içine HPLC dereceli metanol 500 ul çizin ve adım 7.1.2 başına sistemini yıkayın.
    8. Parametreleri ayarlamak için yazılım yöntemi kurulum modülünü seçin. Tarama modu menüsünü seçin ve Ftms olarak analizörü tanımlamak ve sonra "Tamam" düğmesine tıklayın. Kılıf gaz akış hızı: 10, Kaynak sıcaklığı: 0, Kılcal gerilimi: 37 V, Tüp lensi: 95 V, Sprey gerilimi: 4.20 kV Sonra gerçek zamanlı görünümü spektrum sayfasında çeşitli ikonları tıklayarak, şu parametreleri ayarlayabilirsiniz Akış 10.00 ul / dk, Analyzer oranı: Ftms, taramalar sayısı: 150.
  2. ESI kütle spektrometresi üzerinde CGGC örnekleri çalıştırma
    1. 5 mM amonyum format, pH 7,5 tampon çalıştırın.
      1. 500 ul bir cam şırınga içine 5 mM amonyum format tamponu 500 ul koyun MS pompasının şırınga tutucuya yerleştirin ve boru ekleyin.
      2. 1-2 dakika boyunca, boru içinden geçen tampon çalıştırın.
      3. Çalıştırmak için dosya adını ayarlayındosya simgesini seçip dosya adını yazarak.
      4. Modülünde acquire veri düğmesini seçin ve 150 taramaları toplamak.
      5. 150 taramalar toplandıktan sonra toplama durdurmak için çalışma düğmesine tıklayın.
      6. Veri tarayıcı modülü açın, daha sonra menüyü dosya gidin ve "açık" seçeneğini seçin ve iletişim kutusunda dosyayı seçin. 483, 683, 1.163 ve 1.363 m / z hiçbir zirveleri peptid veya civa (II) kompleksleri -peptid benzediğine mevcut olduğundan emin olun.
    2. 0,5 cıva (II): CGGC oranı çözeltisi 1 çalıştırın.
      1. 0,5 cıva (II): şırınga içine örnek CGGC oranı 1 250 ul koyun.
      2. Boru ve Başbakan aparat takın, MS pompa enjektör yuvasına şırınga yerleştirin.
      3. Dosya simgesini seçip dosya adını yazarak çalıştırmak için bir dosya adı seçin.
      4. Veri toplama modülü acquire veri düğmesine basın ve 150 tarama toplamak ve toplama durdurmak için çalışma düğmesini tıklatın.
      5. Modülü açın, menü dosya gidin ve "açık" seçeneğini seçin ve iletişim kutusunda dosyayı seçin. Kromatogram yalnız CGGC peptid için dahil olmak üzere doruklarına içerdiğini doğrulayın.
      6. 500 ul amonyum format tamponu ile aspire ve daha sonra bir kap içine amonyum format tamponu dağıtarak şırınga yıkayın.
      7. MS atık düğmesini seçin ve boru 500 ul amonyum format tamponu ile üç kez yıkayın.
      8. Bir beher içine metanol dağıtma daha sonra 500 ul metanol ile aspire edilmesiyle ve şırıngayı yıkayın.
      9. 500 ul metanol ile tüp bir kez yıkayın.
      10. MS Seç yük dedektör düğmesine basın.
      11. Şırıngaya amonyum format tamponu 500 ul ekle.
      12. Boru ve Başbakan aparat takın, MS pompa enjektör yuvasına şırınga yerleştirin.
      13. Dosya simgesini seçip dosya adını yazarak çalıştırmak tamponu için bir dosya adı seçin.
      14. Basınacquire veri düğmesi ve 150 tarama toplamak ve ardından stop çalıştırmak düğmesini tıklatın.
      15. Veri tarayıcı modülü açın, menü dosya gidin ve "açık" seçeneğini seçin ve iletişim kutusunda dosyayı seçin. CGGC run: kromatogram önceki Hg gelen zirvelerinden geçersiz olduğundan emin olun.
    3. 1 cıva (II): CGGC oranı çözeltisi 1 çalıştırın.
      1. Şırınga içine CGGC oranı örneği: 1 civa (II): 1 250 ul koyun.
      2. 7.2.2.15 Adımları 7.2.2.2 için tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.
    4. 2 cıva (II): 1 başlat CGGC oranı çözümü
      1. Şırınga içine CGGC konsantrasyonu örneği: 2 civa (II): 1 250 ul koyun.
      2. 7.2.2.15 Adımları 7.2.2.2 için tarif edildiği gibi benzer bir şekilde, tekrar edin.

8. Orbitrap ESI kütle spektrometresi ile Reaksiyon Merkür'ün karışımlar ve CEEC Örnekleri analiz

  1. ESI kütle spektrometresi üzerinde CEEC örnekleri Koşu
    1. Tekrar analiz prosedürü (Basamak 7.1 7.2) CEEC örnekleri ve çeşitli stoikiometrik oranlarda civa (II) ve ODAÜ tepkime karışımları kullanılarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir çalışma ESI kütle spektrometresi ile, iki tetrapeptidlerin, CGGC ve ODAÜ (Şekil 1) için olası cıva peptit kompleksi bileşimi karakterize etmek için yapıldı. CGGC ya ODAÜ ile civa (II) kompleksleri cıva karışımları reaksiyona sokulması suretiyle araştırılmıştır (II) ve üç farklı mol oranlarında Peptid çözeltileri: 1: 0.5, 1: 1, 1: 2 ((II) civa: peptid) . Civa (II) konsantrasyonu 7.5 x 10 -6 M ve peptit konsantrasyonu buna göre de değişecektir.

figür 1
Şekil 1. Dicysteinyl peptid yapıları. Dicysteinyl tetrapeptidlerin, CGGC ve ODAÜ kimyasal yapıları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "ent Şekil 2,
Cıva Şekil 2. ESI MS (II) ve a, amonyum format tamponu içinde 2 + Hg değişen ihtiva eden pH 7.5 7.5 x 10 -6 M Hg + 2 ihtiva eden bir çözeltiden CGGC Elektrosprey iyonizasyon kütle spektrumları Orbitrap: CGGC stoikiometrik oranlarda. (A ) 1: 0,5 oranında, (B) 1: 1 oranında, ve (C) 1: 2 oranı. Insets belirtilen cıva peptid komplekslerinin cıva izotop kalıplarını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. ESI cıva MS (II) ve CEEC. Adlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrumları Orbitrap, amonyum format tamponu içinde pH 2+ Hg değişen içeren 7,5 x 7,5 10 -6 M Hg + 2 ihtiva eden bir çözelti,: CEEC stoikiometrik oranları: (A) 1: 0,5 oranında, (B) 1: 1 oranında, ve (C) 1 : 2 oranı. Insets belirtilen cıva peptid komplekslerinin cıva izotop kalıplarını göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Elektrosprey iyonizasyon Orbitrap kütle kromatogramları (II) stokiometrik oranlarda peptit için çeşitli cıva de CGGC (Şekil 2) ve ODAÜ civa (II) kompleks (Şekil 3) için toplanmıştır (1: 0.5, 1: 1 ve 1: 2). Gözlemlenen civa-peptid kompleks türleri komplekse cıva iyonlarının numarasının yanı sıra DEPRO sayısını belirlemek için kullanılan farklı cıva izotopik zirveleri (takmalar) göstermektonations. Örneğin, Şekil 1b ilave cıva yedi ana doğal olarak oluşan izotop karşılık gelen peptit cıva yaklaşımlı civa izotopik imza gösterilmektedir: 196 Hg (0,146%), 198 Hg (10,02%), 199 Hg (16,84%) parantez içinde belirtilen yüzde doğal bollukları 200 Hg (23.13%), 201 Hg (13.22%), 202 Hg (29.80%), 204 Hg (6.85%). Iki büyük izotoplar 200 Hg ve 202 Hg 2.3 ayrı bir nispi yoğunluk oranı gösterir: 3. Buna uygun olarak bu bir civa izotop kümesinin en yoğun tepe izotopik katılma ürününün (m / z = 539) için monoizotopik ağırlığıdır. Bu iki koordinat oluşturmak üzere iki sisteinil tiol deprotone edilmesiyle oluşturulan kompleksin [(CGGC-2H + Hg) + H] + adüktü ile ilişkilidir. Aşağıdaki gibi analiz yapılır:

[(CGGC-2H + Hg) + H] + için m / z değeri ambalajlama olan(- 2 + 202 1 338) = 539 kadar al.

Şekil 1A ilave [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + (Şekil 4) Chemcal programı kullanılarak hesaplanmıştır gibi iki civa kompleksine karşılık gelen peptit civa adüktü, cıva izotopik imza gösterir. Teorik protonlanmış monoizotopik kütle hesaplanan izotopik küme dokuzuncu izotopik zirvesidir 1077.061 bir m / z değeri karşılık gelir. Şekil 1A ilave, aynı zamanda, dokuzuncu zirvesidir 1077.1 bir m / z değeri, karşılık gelen bir izotopik pik gösterir gözlenen izotop kümede. Bu nedenle, bu izotopik küme için kaynak ilave maddesi [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + için atanabilir.

Şekil 4,
[(2CGGC-4H + 2HG) + H] Şekil 4. Teorik izotopik desen + sup>. [(2CGGC-4H + 2HG) + H] + teorik izotop desen Chemcal programını kullanarak hesaplanan. Ok Monoizotopik zirve gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Katyonize aduktları. Cıva peptid kompleksleri ile ilişkili bazı katyonize sodyum ve potasyum adüktleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5, CGGC oluşturduğu cıva peptid kompleksleri ile ilgili bazı katyonize, sodyum ve potasyum adüktleri gösterir. Sodiated adüktler 22 kütle birimi daha t'ninhan potasyum adüktleri 38 kütle birimi daha büyük ise, protonlanmış cıva CGGC kompleksleri gelir. Baskın protonlanmış CGGC dimer (m / z = 677), aynı zamanda, katyonize sodyum ile türler (m / z = 699) ve potasyum iyonları oluşturan (m / z = 715). Bu da protonlanmış veya katyonize adüktleri için iki kütle birimi bir azalma ile sonuçlanan olurdu disülfidleri oluşturmak için sisteinil tiyol gruplarının oksidasyonu olmadan CGGC dimerlerin oluşumunu teyit etmektedir.

Şekil 6,
Şekil 6. Üst üste 1 ve 2 şarj durumları. Cıva peptid iyonları [(CEEC-4H + 2HG) + H] + ile 1 ve 2 şarj devletler ilişkili Çakışan zirveleri. Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.

"Şekil [(MDAÜ-4H + 2HG) + H] +. [(MDAÜ-4H + 2HG) + H] teorik izotop kalıpları için Şekil 7. Teorik izotopik desen + Chemcal programı kullanılarak hesaplanan. Ok Monoizotopik zirve gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1 ve 2 görevli cıva CEEC adducts ile ilişkili doruklarına örtüşen 6 gösterileri Şekil. Bunun için hesaplanan iki civa kompleksi ile uyum içinde olan cıva peptid iyonları [(MDAÜ-4H + 2HG) + H] + ile 1 şarj ve 883. Bu bir m / z değeri ilişkili izotopik doruklarını gösterir [(MDAÜ-4H + 2HG) + H] Chemcal programı (Şekil 7) kullanılarak +. Teorik protone monoizotopikKütle 883.032 bir m / z değerine karşılık gelir.

883.03 bir monoizotopik zirve ile yukanda gözlenen [(MDAÜ-4H + 2HG) + H] + adüktü ilave 0,5 kütle birimlerini gösteren karşılık gelen tepe noktaları içeren bir kimyasal katkı ürününün ile örtüşmektedir. Orbitrap kütle spektrometresi aleti ile elde son derece yüksek çözünürlüğü ile, bu örtüşen zirveleri +2 bir ücret ile adüktlerin uygun öne edilebilir. Buna göre, monoizotopik kütle örtüşen kompleksi, aşağıdaki gibi hesaplanabilir iyonize edilir. 8 izotopik tepeler arasındaki m / z farkı 0,5 ve aralarındaki kütle farkı 1 amu olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, şarj durumu 2 olduğunu. Cıva peptid kompleksi kütlesini hesaplamak için, Monoizotopik zirve için m / z şarj devlet tarafından çarpılır ve pozitif yüklü iyon kompleks yapılan iki proton kütlesi, çıkarılır.

2 yaklaşımlı için Hesaplamalar:

izotopik tepeler arasındaki m / z farkı 0.5

Izotop zirveleri arasında kütle farkı 1 amu (1 nötron)

0.5 = 2 z = 1 böl

protonlanmış monoizotopik tepe m / z (883,53 x 2) 'nin - 2 = 1765,06

Protonlanmış monoizotopik zirve, [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +, yukarıda m / z değeri 1765,056 (Şekil 8) olarak Chemcal program tarafından hesaplanan teorik değer ile tutarlıdır.

Şekil 8
Şekil 8. TeorikChemcal programı kullanılarak hesaplanan [(2CEEC-8H + 4HG) + H] +. [(2CEEC-8H + 4HG) + H] teorik izotop desen + izotopik desenleri. Ok Monoizotopik zirve gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ESI Orbitrap kütle spektrometresi ile civa-peptid kompleksleri analiz avantajı, yukarıda gösterildiği gibi, her iyonun yükü kolaylıkla tayin edilebilmesidir. Bazik amino-terminalini içeren peptidler kolaylıkla pozitif yük sabitleyebilir. Böyle Orbitrap, daha büyük 1 şarj ile peptid iyonlarının şarj durumu olarak elektrosprey iyonizasyonu ve yüksek çözünürlüklü kütle analizörü kullanırken tespit daha kolay kütle analizörü iontrap düşük çözünürlükte mukayese edilebilir.

(Şekil 3A ve Şekil 6) ile bağlantılı üst üste pikler de ikili MS ile analiz edildi. Elde edilen sinyallerin, yukarıda tartışıldığı gibi, beklenen bileşiği aittir ve cıva için peptit oranları daha yüksek konsantrasyonlarında oluşan eserler kümelenmiş olmadığını belirtilen herhangi bir MS-MS: parçalanma, göstermemiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hidrofobik dicysteinyl tetrapeptit CGGC (Cı 10H 18 N 4 O 5S 2 MW = 338) (Şekil 1), cıva kompleksler oluşturan (II), Şekil 2'de gösterilen ve Tablo 1 Ayrıca, peptit dimerler ve trimerler de oluşturmasıyla ayrılır. aşamalı olarak, reaksiyon karışımı içindeki peptit miktarı arttıkça. M / z ilişkili dimerlerin değerleri [(2M + H) + = 677] ve trimerler ile gösterildiği gibi [(3M + H) + = 1015], CGGC tiol grupları deney koşulları altında disülfidleri oluşturmak için okside yoktu . Bu ilişkili CGGC türlerinin oluşumunun tetrapeptidin hidrofobikliği nedeniyle olabilir. 1 civa (II): peptid ve 1: (II) :( peptid 2 cıva) daha önce dicysteinyl tripeptidler 7 için bildirilen 2 kompleksleri CGGC 1 karşılık gelen cıva ile kompleksler iki tip oluşturur. Bununla birlikte, fazla ya da eşdeğer bir cıva (II) varlığında, aynı zamanda forms 2: 2: [cıva (II)] 2: (peptid) 2 kompleksi.

Karboksillenmiş dicysteinyl tetrapeptit CEEC (Cı 16 H 26 N 4 O 9 S 2; MW = 482) cıva ile (Şekil 1) bir şekilde kompleksleri (II), Şekil 3'te gösterilen ve Tablo 1 Bu kadar kolay şekilde CEEC dimerler yoktu. Bu daha hidrofobik CGGC için gözlemleyin. 1 civa (II): peptid ve 1: 2 civa (II) :( peptid) 2 kompleksleri CGGC ile karşılaştırıldığında, bu cıva 1 karşılık gelen kompleksler oluşturur. 2 [civa (II)] 2: (peptid) daha kolay bir şekilde 2 kompleksi Ancak, yardımcı karboksilat grupları ile, 2 oluşturur. 1 [cıva (II)] 2: karmaşık peptid ve 4: Ayrıca fazla cıva, 2 oluşturan 2 [cıva (II)] 4: CGGC için gözlenmemiştir (peptid) 2 peptit kompleksi.

Kompleksleri f gözlemlenen sinyallerin özetiormed m / z değerleri Tablo 1 de gösterildiği gibidir.

tablo 1

Tablo cıva peptid kompleksleri sinyallerin 1. Özeti. Amonyum format tamponu, pH 7.5 içinde LTQ / Orbitrap MS analizi civalı-peptid kompleksleri sinyaller.

Peptit aynı zamanda dicysteinyl tetrapeptidde yardımcı bağlanma grupların varlığı: Bu civa (II) ve iki dicysteinyl tetrapeptidlerin Reaksiyon civa (II) başlangıç ​​oranlarına bağlı olan kompleksler oluşturan olduğunu göstermiştir. Ayrıca, belirli bir elektrosprey iyonizasyon koşulları altında oluşan komplekslerin cıva ve peptit doğru stokiyometri farklı civa izotopik dağılım yolları göre yüksek çözünürlüklü ESI kütle spektrometresi ile belirlenebilir.

Sisteinil Pept reaksiyona olarakciva (II) amidler, önlemler disülfid bağları oluşturmak için sisteinil tiyol gruplarının oksidasyonunun önlenmesi için dikkat edilmelidir. Tarif edilen protokol içinde, tampon çözeltiler dikkatli bir şekilde gazı giderildi ve argon altında depolandı. Buna ek olarak, bütün reaksiyon numuneleri hemen ESI kütle spektrometresi ile analizden önce hazırlanır.

İki tetrapeptidlerin, ODAÜ ve CGGC arasındaki çözünebilirlik farklılıkları nedeniyle, farklı konsantrasyonlarda stok çözeltileri hazırlamak için kullanıldı. CGGC peptidin dondurucu hazır asetonitril ile ıslatılmıştır ve kolay bir şekilde 5 mM amonyum format tamponu, 7.5 x 10 -4 M CGGC solüsyon elde etmek üzere pH 7.5, ardından çözünmüştür. CEEC, daha düşük bir konsantrasyonda hazırlandı 7.5 x 10 5 M, cıva önce (II) için, alt çözünürlüğünün peptid reaksiyon karışımı adım. Cıva analiz etmek için uygun bir seyreltme (II) kompleksleri için peptidin ve izin vermek için çözünürlüğün 10 5 M olduğu görülmüştürkütle spektrometresinde tortularını çıkarmak için. CGGC çözümleri sözleşmede, CEEC kalıntılar arada boru değiştirme gerektiren boru, yapışır.

Civa-peptid kompleksleri analizi için ESI kütle spektrometresi ile önemi analitlerin yumuşak iyonizasyon yatmaktadır. Bu göz ardı parçalanma ile moleküler iyonların analizi kolaylaştırır. Bu çalışmada gösterildiği gibi, imza civa izotopik dağılım yolları göre civa-peptid komplekslerinin stoichiometries karakterize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, uçucu bir tampon sistemi ESI kütle spektrometresi ile analiz için gereklidir. Bu fesih için daha az uçucu çözücüler veya tamponlama medya gerektiren analitlerini belirlenmesi için pratik kullanımını kısıtlayabilir.

Daha önce 7,8 belirttiğimiz gibi, ESI kütle spektrometresi cıva ve Pept stoykiyometrisini doğru belirlenmesi için hassas bir analitik araç sağlarBelirtilen elektrosprey iyonizasyonu koşulu altında cıva peptid kompleksleri ide. Bununla birlikte, ek yöntemler kullanmak için gerekli olan (örneğin, 1 H, 13C, 199 Hg NMR spektroskopisi, exafs veya potansiyometrik 17-18) komplekslerinin içeriğinde daha doğru belirlenmesi sağlamak Çözelti.

Biz Orbitrap kütle analizörü ESI cıva peptid komplekslerini analiz etmek için kullanılabileceğini göstermiştir. Bu tekniğin diğer metal iyonları ve çeşitli küçük bileşikler ile komplekslerinin analizi doğru uygulanabilir bekler. Bu farklı izotop formlarda mevcut olabilir, diğer metal iyonları ile oluşturulan kompleksleri analizi için özellikle faydalı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

MN-S Ulusal Bilim Vakfı desteği kabul RUI yazarları minnetle Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL kütle spektrometresi kullanımına ilişkin Greensboro, Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Triad Kütle Spektrometre Tesisi kabul Che 1011859. verin. Yazarlar bu çalışmaları ile ilgili faydalı görüş ve önerileriniz için Greensboro, Kuzey Carolina Üniversitesi'nden Daniel Todd, Vincent Sica ve Brandie Erhmann teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mercury(II) chloride Sigma-Aldrich 429724 Highly toxic
Ammonium formate Sigma-Aldrich 516961
Formic acid Sigma-Aldrich F0507
Ammonium hydroxide Fisher A512-P500
HPLC water Fisher W5-4
HPLC Acetonitrile Fisher BP2405-1
HPLC Methanol Fisher A452-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clifton, J. C. Mercury exposure and public health. Pediatr. Clin. N. Am. 54, 237-269 (2007).
  2. Andersen, O. Principles and Recent Developments in Chelation Treatment of Metal Intoxication. Chem. Rev. 99, 2683-2710 (1999).
  3. Aposhian, H. V., Maiorino, R. M., Gonzalez-Ramirez, D., Zuniga-Charles, M., Xu, Z., Hurlbut, J. M., Junco-Munoz, P., Dart, R. C., Aposhian, M. M. Mobilization of heavy metals by newer, therapeutically useful chelating agents. Toxicology. 97, 23-38 (1995).
  4. Flora, S. J. S., Pachauri, V. Chelation in Metal Intoxication. Int. J. Environ. Res. Public Health. 7, 2745-2788 (2010).
  5. Campbell, J. R., Clarkson, T. W., Omar, M. D. The therapeutic use of 2,3-dimercaptopropane-1-sulfonate in two cases of inorganic mercury poisoning. JAMA. 256, 3127-3130 (1986).
  6. Rooney, J. P. K. The role of thiols, dithiols, nutritional factors and interacting ligands in the toxicology of mercury. Toxicology. 234, 145-156 (2007).
  7. Lin, X., Brooks, J., Bronson, M., Ngu-Schwemlein, M. Evalution of the association of mercury (II) with some dicysteinyl tripeptides. Bioorg. Chem. 44, 8-18 (2012).
  8. Ngu-Schwemlein, M., Lin, X., Rudd, B., Bronson, M. Synthesis and ESI mass spectrometric analysis of the association of mercury(II) with multi-cysteinyl peptides. J. Inorg. Biochem. 133, 8-23 (2014).
  9. Winther, J. R., Thorpe, C. Quantification of thiols and disulfides. Biochimica et. Biophysica Acta. 1840, 838-846 (2014).
  10. D'Agstino, A., Colton, R., Traeger, J. C., Cantry, A. J. An Electrospray Mass Spectrometric Study of Organomercury (II) and Mercuric Interactions with Peptides Involving Cysteinyl Ligands. Eur. Mass Spectrom. , 273-285 (1990).
  11. Hofstadler, S. A., Sannes-Lowery, K. A. Applications of ESI-MS in drug discovery: interrogation of noncovalent complexes. Nature Reviews Drug Discovery. 5, 585-595 (2006).
  12. Rubino, F. M., Verduci, C., Giampiccolo, R., Pulvirenti, S., Brambilla, G., Columbi, A. Molecular Characterization of Homo- and Heterodimeric Mercury (II)-bis-thiolates of Some Biologically Relevant Thiols by Electrospray Ionization and Triple Quadruple Tandem Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 288-300 (2003).
  13. Krupp, E. M., Milne, B. F., Mestrot, A., Meharg, A. A., Feldmann, J. Investigation into mercury bound to biothiols: structural identification using ESI-ion-trap MS and introduction of a method for their HPLC separation with simultaneous detection by ICP-MS and and ESI-MS. Anal. Bioanal. Chem. 390, 1753-1764 (2008).
  14. Schaumlöffel, D., Tholey, A. Recent directions of electrospray mass spectrometry for elemental speciation analysis. Anal. Bioanal. Chem. 400, 1645-1652 (2011).
  15. Patiny, L., Borel, A. ChemCalc: a building block for tomorrow's chemical infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 53, 1223-1228 (2013).
  16. Thermo Scientific. Xcaibur Versions 2.1.0-2.3.0 Data Acquisition and Processing User Guide. Revision E. United States. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2012).
  17. Falcone, G., Foti, C., Gianguzza, A., Giuffrè, O., Napoli, A., Pettignano, A., Piazzese, D. Sequestering ability of some chelating agents towards methylmercury(II). Anal. Bioanal. Chem. 405 (2), 881-893 (2013).
  18. Mah, V., Jalilehvand, F. Glutathione Complex Formation with Mercury(II) in Aqueous Solution at Physiological pH. Chem. Res. Toxicol. 23, 1815-1823 (2010).

Tags

Kimya Sayı 107 Cıva-peptid kompleksleri cıva izotop zirveleri kütle spektrometrisi ESI MS sisteinil peptidler
Elektrosprey İyonizasyon kütle spektrometresi ile Dicysteinyl tetrapeptidlerle ile Merkür (II) kompleksinin Bir Çalışma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A… More

Mazlo, J., Ngu-Schwemlein, M. A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (107), e53536, doi:10.3791/53536 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter