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Developmental Biology

माउस कान और पूंछ के ऊतकों से उत्पन्न प्राथमिक तंतुकोशिका संस्कृति

Published: January 10, 2016 doi: 10.3791/53565
Automatic Translation
1, 1,2
1Immunology Program, Department of Microbiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore

Summary

हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblasts पैदा करने के लिए एक सरल और त्वरित प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है। प्रक्रिया विशेष पशु प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से fibroblast संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

प्राथमिक कोशिकाओं ऊतकों से सीधे प्राप्त कर रहे हैं और स्थापित सेल लाइनों से विवो में कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति के अधिक प्रतिनिधि होने के लिए लगा रहे हैं। हालांकि, प्राथमिक सेल संस्कृतियों आम तौर पर एक परिमित जीवन काल है और बार-बार फिर से स्थापित किए जाने की जरूरत है। Fibroblasts प्राथमिक कोशिकाओं के एक आसानी से सुलभ स्रोत हैं। यहाँ, हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल और त्वरित प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर चर्चा की। प्रोटोकॉल के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का सावधानी से पालन किया जाता है, संदूषण कुछ मामलों में विस्तारित समय के लिए भंडारित गैर बाँझ ऊतक के उपयोग के बावजूद घटित होने की संभावना नहीं है। Fibroblasts संस्कृति में तेजी से पैदा और replicative वार्धक्य से गुजरने के पहले पर्याप्त संख्या का विस्तार किया जा सकता है।

Introduction

प्राथमिक कोशिकाओं में इन विट्रो की शर्तों के तहत ऊतक और सुसंस्कृत रहने से निकाली गई है। यह आम तौर पर प्राथमिक कोशिकाओं को और अधिक बारीकी से शारीरिक स्थिति और वे अमर या ट्यूमर सेल लाइनों 1 से शुरु हुआ, जिसमें से ऊतक के आनुवंशिक पृष्ठभूमि के समान माना जाता है कि। कारण है कि, प्राथमिक कोशिकाओं जैविक सवालों 2,3 के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनिश्चित काल के बढ़ने कि स्थापित सेल लाइनों के विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं अंततः संस्कृति में वार्धक्य से गुजरना है और अक्सर फिर से स्थापित किए जाने की जरूरत है।

आमतौर पर इस्तेमाल किया प्राथमिक कोशिकाओं फ़ाइब्रोब्लास्ट, उपकला कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDC) शामिल हैं। Fibroblasts अक्सर प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। वे अन्य प्राथमिक कोशिकाओं से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। सेल संस्कृतियों आसानी से आसानी से बनाए रखा है, की स्थापना की और कोई purifica की आवश्यकता होती हैसंस्कृति के लिए पूर्व कोशिकाओं के tion। वे तेजी से प्रारंभिक प्रसार और विशेष मध्यम या सक्रियण प्रोटोकॉल के लिए कोई आवश्यकता है। Fibroblasts कुशलता से जैविक, रासायनिक और भौतिक प्रोटोकॉल 4,5 का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता। सेल संस्कृतियों की स्थापना करने से पहले आरटी पर अप करने के लिए 10 दिनों के लिए कान की दुकान करने की संभावना है। Fibroblast संस्कृतियों साइटोप्लास्मिक प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए अनुकूल और प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं 6 में reprogramming के लिए उपयुक्त हैं।

Fibroblasts कोलेजन प्रोटीन और बाह्य मैट्रिक्स 7 छिपाना कि संयोजी ऊतक के महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं। वे कई ऊतकों 8 में संरचनात्मक ढांचा प्रदान करते हैं और घाव भरने और ऊतकों की मरम्मत 9,10 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं।

यहाँ, हम fibroblast कान से संस्कृतियों और चूहों 11 की पूंछ की स्थापना के लिए एक सरल और त्वरित (<4 घंटा) प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल न्यूनतम माउस की आवश्यकता हैअनुभव (अन्य प्रोटोकॉल 12,13 के विपरीत) ऊतकों फसल के लिए और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर माध्यम में संग्रहित कान से संस्कृतियों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

चूहे euthanization तक संस्थागत दिशा निर्देशों (संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में और प्रयोगशाला पशु अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय सलाहकार समिति (NACLAR) के दिशा निर्देशों) के अनुपालन में रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखे थे।

1. चूहे

  1. उचित आनुवंशिक पृष्ठभूमि से एक माउस आदेश। इस प्रोटोकॉल एक C57BL 6 / माउस से निकाली गई ऊतक पर आधारित है।

पूरा माध्यम से 2. तैयारी

  1. 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 50 माइक्रोन 2-mercaptoethanol, 100 माइक्रोन asparagine, 2 मिमी glutamine, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान: रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 1640 मध्यम करने के लिए निम्न घटक जोड़कर पूरा मध्यम तैयार करें।

एंजाइम समाधान के 3. तैयारी

  1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में कोलैजिनेज़ डी समाधान तैयार है।
    1. कोलैजिनेज़ डी Di के 10 मिलीग्राम वजन4 मिलीलीटर में ssolve कोलैजिनेज़ डी पूरा मध्यम।
  2. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में pronase समाधान तैयार है।
    1. Pronase के 10 मिलीग्राम वजन।
    2. 1 एम Tris बफर (8.0 पीएच) के 5 μl जोड़ें। 0.5 एम EDTA (8.0 पीएच) के 1 μl जोड़ें।
    3. बाँझ पानी के 494 μl से ऊपर।
    4. 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर pronase समाधान सेते हैं।

कोलेजिनेस डी-pronase मिक्स (≤2 पूंछ) 4. तैयारी

नोट: एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में बाद के चरणों का प्रदर्शन।

  1. कोलैजिनेज़ डी समाधान के 4 मिलीलीटर pronase समाधान के 250 μl जोड़ें।
  2. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से कोलैजिनेज़ डी-pronase मिश्रण से गुजरती हैं।

कान और पूंछ के ऊतकों से fibroblasts की 5. निष्कर्षण

  1. उचित संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों euthanize।
  2. सेल संस्कृति हुड में autoclaved सर्जिकल उपकरण (कैंची और संदंश) रखें।
  3. दो 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन प्रत्येक में 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम जोड़ें।
  4. कान (~ 1 सेमी त्रिज्या) और कैंची के साथ एक माउस की (पूंछ की नोक से) पूंछ के 5 सेमी कट और एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में 40 एमएल 70% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 5 मिनट के लिए हुड में एक खुले 10 सेमी सेल संस्कृति डिश में उन्हें रखने के द्वारा हवा शुष्क कान और पूंछ। एक बार कदम 5.3 में वर्णित के रूप में हस्तांतरण कान और दो संस्कृति व्यंजन को पूंछ टुकड़े "कान" और 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम युक्त "पूंछ" लेबल, सूख गया।
  6. कान और पूंछ का उपयोग कैंची से बालों को हटा दें।
  7. कैंची का उपयोग आकार में 3 मिमी की तुलना में छोटे टुकड़ों में कान और पूंछ कट।
  8. "कान" और "पूंछ" लेबल 1.8 मिलीलीटर cryotube शीशियों में कटौती ऊतकों स्थानांतरण और शीशी पर 1.8 मिलीलीटर निशान तक पहुंचने के लिए मात्रा के लिए पर्याप्त कोलैजिनेज़ डी-pronase समाधान जोड़ें।
  9. पीएक प्रकार के बरतन पर क्षैतिज cryotube शीशियों फीता और 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 200 rpm पर नमूने हिला।
  10. 90 मिनट ऊष्मायन के बाद, बरतन से cryotube शीशियों को हटाने और हुड में शीशियों जगह है।
  11. दो 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन, लेबल "कान" और "पूंछ" प्रत्येक में 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम जोड़ें, और प्रत्येक थाली में एक 70 माइक्रोन सेल झरनी डाल दिया।
  12. > 5 मिनट के लिए एक 10 मिलीलीटर सिरिंज सवार का उपयोग करते हुए ऊतकों को पीस जबरदस्ती कदम 5.11 में तैयार तदनुसार लेबल बर्तन में 70 माइक्रोन सेल झरनी में पच कान और पूंछ ऊतकों की जगह और। सेल झरनी के बाहर की कोशिकाओं को धोने के लिए माध्यम में कभी-कभी सेल झरनी हिला।
  13. "कान" और "पूंछ" लेबल दो 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूबों में प्रत्येक पकवान से सेल निलंबन पिपेट। अतिरिक्त 10 एमएल पूरा मध्यम के साथ पकवान और झरनी धो लें और उचित 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूबों के माध्यम जोड़ें।
  14. सेल स्पिन~ 580 XG पर 7 मिनट और एक प्रशीतित सेल सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए निलंबन।
  15. सतह पर तैरनेवाला निकालें 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में सेल गोली के लिए 10 मिलीलीटर पूरा मध्यम जोड़ने और कोशिकाओं resuspend।
  16. दोहराएँ कदम 5.14 और 5.15।

सेल मिश्रण के 6. संवर्धन

  1. सतह पर तैरनेवाला निकालें। सेल गोली अबाधित बनी हुई है कि सुनिश्चित करें।
  2. 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पूरा मध्यम पुनः निलंबित और "कान" और "पूंछ" लेबल दो 10 सेमी सेल संस्कृति व्यंजन के लिए संबंधित मिश्रण जोड़ें।
  3. संस्कृति के लिए: 10 μl amphotericin बी समाधान (250 माइक्रोग्राम / एमएल शेयर समाधान) जोड़ें।
  4. एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. तीसरे दिन, 10 मिलीलीटर ताजा पूरा मलबा हटाने के लिए amphotericin बी के 10 μl युक्त मध्यम (आंकड़े 1 और 2) के साथ मध्यम जगह।

Fibroblasts की 7. उप-संस्कृति

  1. Wheएन संस्कृति लगभग 70% confluency (दिन संस्कृति के 3-4) मध्यम हटाने और 5 मिलीलीटर बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोने के लिए पहुंचता है।
  2. पीबीएस निकालें और कोशिकाओं को 2 मिलीलीटर बाँझ 1x ट्रिप्सिन- EDTA समाधान जोड़ें।
  3. एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. 5 मिनट के बाद, धीरे संस्कृति डिश नल और कोशिकाओं को 6 मिलीलीटर पूरा मध्यम जोड़ें।
  5. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और एक प्रशीतित सेल सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर ~ 450 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें, और धीरे से 5 मिलीलीटर पूरा मध्यम में सेल गोली फिर से निलंबित।
  7. एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश में बीज 2 x 10 5 कोशिकाओं और 7.6 के लिए कदम 7.1 दोहरा से पहले 3-4 दिनों के लिए एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।

शिपमेंट के लिए कान के 8. तैयारी

नोट: टी प्रदर्शन करनावह एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में बाद के चरणों।

  1. उचित संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों euthanize।
  2. सेल संस्कृति हुड में autoclaved कैंची और संदंश रखें।
  3. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में 50 मिलीलीटर पूरा मध्यम जोड़ें।
  4. कैंची के साथ एक माउस के कान (~ 1 सेमी त्रिज्या) में कटौती।
  5. का उपयोग कर संदंश (चरण 3 में तैयार) के रूप में 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब में कान स्थानांतरण।
  6. एक उपयुक्त बॉक्स में आरटी पर शिपिंग से पहले parafilm के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे ट्यूब सील।

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Representative Results

ऊतक मलबे का एक महत्वपूर्ण राशि में ऊतक परिणामों से fibroblasts की निष्कर्षण (चित्रा 1)। ऊतक मलबे के विपरीत, fibroblasts दिन 1 और संस्कृति के बीच 3 टिशू कल्चर प्लास्टिक की सतहों का पालन करें। fibroblast संस्कृतियों का माध्यम सुरक्षित रूप से काफी संस्कृति (चित्रा 2) में मलबा वर्तमान के स्तर में कमी करनी चाहिए जो संस्कृति के दिन 3 पर बदला जा सकता है। Fibroblasts एक लम्बी आकृति विज्ञान और एक स्पष्ट रूप से दिखाई कोशिका द्रव्य (आंकड़े 1 और 2) प्रदर्शित करते हैं। Mitotic कोशिकाओं के बाद संस्कृति के दिन 3 से उपस्थित होना चाहिए और कोशिकाओं संस्कृति के 3-4 दिनों के भीतर सेल confluency के 70-80% तक पहुंच जाना चाहिए। एक 10 सेमी संस्कृति डिश में कान और पूंछ के ऊतकों से उपज 4 5 10 एक्स 5 (कान) और संस्कृति के 3 दिन 5 5 से 10 एक्स 6 के लिए कोशिकाओं (पूंछ) से चलता है। Fibroblasts के अलगाव के तीसरे दिन के बाद, कोशिकाओं passaged जा सकता है और 10 सेमी संस्कृति पकवान प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त।

10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से fibroblasts की निष्कर्षण संस्कृति के 5-6 दिनों के भीतर 70-80% सेल confluency (चित्रा 3) में परिणाम चाहिए। 5 दिन बाद 10 सेमी संस्कृति डिश प्रति 2 x 10 5 कोशिकाओं में कोशिकाओं सीडिंग भी संस्कृति के 3-4 दिनों के भीतर लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं को जन्म देना चाहिए। लंबी अवधि के भंडारण यह हमारे अनुभव में वार्धक्य दर्ज करने के लिए fibroblasts के लिए लगने वाले समय को प्रभावित नहीं करता (डेटा) नहीं दिखाया।

Vimentin धुंधला (चित्रा 4) ने संकेत के रूप में संस्कृति के 3 दिन बाद कोशिकाओं की पहचान सत्यापित करने के लिए, कोशिकाओं के ऊपर प्रोटोकॉल का प्रयोग fibroblasts मार्कर vimentin 14. के लिए लेबल किया जा सकता है, हम नियमित रूप से शुद्ध fibroblast संस्कृतियों प्राप्त करते हैं।

आकृति 1
पूर्व के 3 दिन के बाद निकासी पर चित्रा 1. तंतुकोशिका संस्कृति के माध्यम से बदलने के लिए।सेल मलबे के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (सफेद तीर) संस्कृति के दिन 3 पर मौजूद। छवियाँ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग 100 × बढ़ाई कब्जा कर लिया गया। पैमाने पर पट्टी 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
नए माध्यम के अलावा के बाद 3 दिन के बाद निकासी पर चित्रा 2. तंतुकोशिका संस्कृति। संस्कृति में 3 दिन fibroblasts की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। छवियाँ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग 100 × 320 × बढ़ाई कब्जा कर लिया गया। पैमाने पर पट्टी 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान ऊतकों से 3 दिन के बाद निकासी पर तंतुकोशिका संस्कृति। संस्कृति में 3 दिन में fibroblasts की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। छवियाँ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग 100 × 320 × बढ़ाई कब्जा कर लिया गया। पैमाने पर पट्टी 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
Vimentin के लिए fibroblast संस्कृतियों का चित्रा 4. लेबलिंग। संस्कृति के 3 दिन के कान और पूंछ fibroblasts की प्रतिनिधि confocal छवि। ऊतकों से निकाली fibroblasts vimentin (लाल) और DAPI (नीला) के लिए चिह्नित किया गया। फ्लोरोसेंट छवियों confocal माइक्रो द्वारा हासिल किया गयाप्रति। पैमाने बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल, सस्ता और तेज प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करते हैं। निकासी के ऊतक के 3 दिन बाद अलगाव के भीतर पक्षपाती और तेजी से विभाजित fibroblasts में परिणाम चाहिए। प्राथमिक कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण सीमा बुढ़ापा, एक स्थायी विकास गिरफ्तारी 15 है। Fibroblasts वृद्ध होनेवाला बनने से पहले प्रोटोकॉल का उपयोग करना, fibroblast संस्कृतियों का आकार (2-3 गुना वृद्धि) और विस्तार करने के लिए विफलता में वृद्धि, कोशिकाओं के सपाट ने संकेत दिया, 5 से 6 बार के लिए passaged जा सकता है।

Fibroblasts की अलगाव प्रदर्शन करते हैं, ध्यान fibroblasts की कम वसूली में परिणाम होगा अपर्याप्त काटने या पाचन के रूप में, ऊतकों के विघटन के दौरान भुगतान किया जाना चाहिए। यह fibroblasts की संख्या में वृद्धि करने के लिए कान और पूंछ fibroblasts पूल करने के लिए संभव है। पेरिटोनियल और एक ही तरीके से कार्रवाई फेफड़े के ऊतकों सहित अतिरिक्त ऊतक टी बढ़ाने के लिए जोड़ा जा सकता हैfibroblasts की वह संख्या है। मलबे fibroblasts निकासी निम्नलिखित संस्कृति में मौजूद है, यह fibroblasts सेल संस्कृति व्यंजन का पालन करने के लिए समय लेने के रूप में केवल तीसरे दिन के बाद मध्यम बदलने के लिए सिफारिश की है।

प्रोटोकॉल का एक संभावित सीमा गैर बाँझ ऊतकों और सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के जुड़े संभावना का इस्तेमाल होता है। संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए, कान और पूंछ fibroblasts कटाई से पहले 70% इथेनॉल में incubated हैं। इसके अलावा, रोधी amphotericin बी fibroblast संस्कृतियों की स्थापना जब खमीर और कवक के परिणाम, एक आम समस्या को रोकने के लिए प्राथमिक संस्कृति से जोड़ा जाता है। मध्यम भी पेनिसिलिन और जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। इन सावधानियों का उपयोग करना, संदूषण शायद ही कभी कई दिनों के लिए आरटी पर रखा गया था कि कान और पूंछ से fibroblasts की स्थापना भी जब मनाया जाता है।

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ में से एक abil हैअल्पसंख्यक fibroblasts के अलगाव से पहले करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर मध्यम में संग्रहीत किया गया है कि कान से fibroblasts उत्पन्न करने के लिए। हम भंडारण (70-80% confluency हौसले से अलग ऊतक के लिए 3-4 दिनों की तुलना में 5-6 दिनों के भीतर पहुँच जाता है) के 10 दिनों के बाद कान fibroblast संस्कृति स्थापित करने में एक विनय कमी आई है दक्षता मनाया। एक्सप्रेस शिपमेंट की सिफारिश की है हालांकि इसलिए, चूहों के कान, मानक शिपिंग का उपयोग करते हुए शोधकर्ताओं द्वारा विमर्श किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, इस्तेमाल में आसानी के कान और ऊतक शायद ही प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है कि इस तथ्य को प्राप्त करने के लिए अक्सर समय लेने वाली अन्यथा प्राप्त करने के लिए हो सकता है कि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के ऊतक के लिए उपयोग की अनुमति देता है। पूंछ के लिए भंडारण के बाद उबरने fibroblasts की दक्षता में व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं और कान लदान के लिए उपलब्ध नहीं हैं, तो पूंछ ही इस्तेमाल किया जाना चाहिए। ऊतक की फसल चूहों से निपटने में कम से कम विशेषज्ञता और प्रशिक्षण की आवश्यकता के रूप में अंत में, ज्यादातर लोगों को, प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने में सक्षम होना चाहिए।

प्रोटोकॉल केवल माउस के ऊतक का उपयोग कर परीक्षण किया गया है, लेकिन सिद्धांत रूप में प्रोटोकॉल आगे अनुकूलन की जरूरत हो सकती है, हालांकि अन्य प्रजातियों के ऊतक का उपयोग fibroblast संस्कृतियों की पीढ़ी की अनुमति चाहिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

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References

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Khan, M., Gasser, S. Generating… More

Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

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