Summary
Se describe un procedimiento experimental sencillo y rápido para la generación de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El procedimiento no requiere una formación especial de los animales y se puede utilizar para la generación de cultivos de fibroblastos de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días.
Abstract
Las células primarias se derivan directamente de tejidos y se cree que son más representativa del estado fisiológico de las células in vivo que las líneas celulares establecidas. Sin embargo, cultivos de células primarias por lo general tienen una vida finita y deben ser restablecido con frecuencia. Los fibroblastos son una fuente fácilmente accesible de células primarias. En este caso, hablamos de un procedimiento experimental simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. El protocolo puede ser utilizado para establecer cultivos de fibroblastos primarios de los oídos almacenados a temperatura ambiente durante hasta 10 días. Cuando el protocolo se sigue cuidadosamente, las contaminaciones son poco probable que ocurra a pesar de la utilización de tejido no estéril almacenada por un tiempo prolongado en algunos casos. Los fibroblastos proliferan rápidamente en la cultura y se puede ampliar a un número considerable antes de someterse a la senescencia replicativa.
Introduction
Las células primarias se derivan de tejido y se cultivaron viven bajo condiciones in vitro. Se asume generalmente que las células primarias se asemejan más el estado fisiológico y el fondo genético del tejido del que se derivan de líneas celulares inmortalizadas o tumorales 1. Por esa razón, las células primarias representan un modelo útil para el estudio de cuestiones biológicas 2,3. Sin embargo, a diferencia de las líneas celulares establecidas que crecen indefinidamente, células primarias, finalmente, se someten a la senescencia en la cultura y necesitan ser restablecido con frecuencia.
Células primarias comúnmente usados incluyen fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, células T, células B, macrófagos derivados de médula ósea (BMDM) y células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC). Los fibroblastos se utilizan a menudo como modelo de cultivo celular primario. Ofrecen ventajas clave sobre otras células primarias. Los cultivos celulares son fáciles de establecer, fácilmente mantenido y no requieren Purificación de las células antes de la cultura. Tienen rápida proliferación inicial y sin necesidad de protocolos de medio o de activación especializados. Los fibroblastos se pueden transfectar eficientemente usando biológicos, químicos, físicos y protocolos de 4,5. Hay una posibilidad de almacenar oídos por hasta 10 días a temperatura ambiente antes de establecer cultivos celulares. Cultivos de fibroblastos son propicias para la visualización de los procesos citoplásmicos y adecuado para la reprogramación en células madre pluripotentes inducidas (iPS) 6.
Los fibroblastos son células importantes del tejido conectivo que secretan las proteínas de colágeno y matriz extracelular 7. Ellos proporcionan el marco estructural en muchos tejidos 8 y juegan un papel esencial en la curación de heridas y reparación de tejidos 9,10.
A continuación, describimos una (<4 h) Protocolo simple y rápida para establecer cultivos de fibroblastos de las orejas y la cola de los ratones 11. El protocolo requiere un mínimo de ratónexperiencia para la cosecha de los tejidos (en contraste con otros protocolos 12,13) y se puede utilizar para establecer cultivos de oídos almacenados en un medio a temperatura ambiente durante hasta 10 días.
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Protocol
Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en el cumplimiento de las directrices institucionales hasta la eutanasia (El Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) directrices de la Universidad Nacional de Singapur y el Comité Nacional Asesor para el Laboratorio de Investigación Animal (NACLAR) directrices).
1. Los ratones
- Ordene un ratón del fondo genético apropiado. Este protocolo se basa en el tejido derivado de un ratón C57BL / 6.
2. Preparación de medio completo
- Preparar medio completo mediante la adición de los siguientes componentes a Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640: 10% de suero de ternera fetal (FCS), 50 mM 2-mercaptoetanol, 100 mM de asparagina, glutamina 2 mM, solución de penicilina-estreptomicina al 1%.
3. Preparación de soluciones de enzima
- Prepare la solución de colagenasa D en un tubo de fondo cónico de 15 ml.
- Pesar 10 mg de colagenasa D. Dissolve colagenasa D en 4 ml de medio completo.
- Prepare la solución de pronasa en un tubo de 1,7 ml de microcentrífuga.
- Pesar 10 mg de pronasa.
- Añadir 5 l de tampón Tris 1 M (pH 8,0). Añadir 1 l de 0,5 M EDTA (pH 8,0).
- Rellene con 494 l de agua estéril.
- Incubar la solución de pronasa a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos.
4. Preparación de colagenasa D-pronasa Mix (≤2 colas)
Nota: Realice los pasos siguientes en una campana de cultivo celular estéril.
- Añadir 250 l de solución de pronasa a 4 ml de solución de colagenasa D.
- Pasar la colagenasa-D pronasa mezcla a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en un tubo de fondo cónico de 15 ml estéril.
5. Extracción de fibroblastos de oreja y rabo tejidos
- La eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados.
- Coloque autoclave instrumentos quirúrgicos (tijeras y pinzas) en la campana de cultivo celular.
- Añadir 10 ml de medio completo en dos platos de 10 cm de cultivo de células cada uno.
- Cortar las orejas (~ 1 cm de radio) y 5 cm de la cola (de la punta de la cola) de un ratón con tijeras y se incuba durante 5 min en etanol 40 ml 70% en un tubo de fondo cónico de 50 ml estéril.
- Oídos Aire seco y cola colocándolos en una abierta 10 cm placa de cultivo celular en la campana durante 5 min. Una vez secas, oído transferencia y piezas de la cola a dos placas de cultivo etiquetados "orejas" y "cola" que contiene 10 ml de medio completo como se describe en el paso 5.3.
- Quitar el pelo de las orejas y la cola con unas tijeras.
- Cortar orejas y rabo en trozos más pequeños de 3 mm de tamaño con unas tijeras.
- Transferir los tejidos cortados en 1,8 ml viales criotubo etiquetados "orejas" y "cola" y añadir la solución D-pronasa suficiente de colagenasa para el volumen para alcanzar la marca de 1,8 ml en el frasco.
- Pata los viales criotubo horizontalmente en una coctelera y agitar las muestras a 200 rpm durante 90 minutos a 37 ° C.
- Después de 90 minutos de incubación, retire los viales criotubo de la coctelera y colocar los viales en el capó.
- Añadir 10 ml de medio completo en dos 10 cm placas de cultivo de células, etiquetados "oídos" y "cola" cada uno, y poner un filtro de 70 micras de células en cada plato.
- Coloca los tejidos del oído y de la cola digeridos en el colador de 70 micras de células en los platos en consecuencia etiquetados preparados en el paso 5.11 y con fuerza moler los tejidos utilizando una jeringa de émbolo 10 ml durante> 5 min. Agite el filtro de células de vez en cuando en el medio para lavar las células del filtro de células.
- Pipetear la suspensión de células de cada plato en tubos de fondo dos 15 ml cónicos etiquetados "orejas" y "cola". Lave el plato y el colador con otros 10 ml de medio completo y añadir el medio a los tubos de fondo cónico de 15 ml apropiadas.
- Centrifugar la célulasuspensión durante 7 min a 580 xg y ~ 4 ° C utilizando una centrífuga refrigerada celular.
- Aspirar el sobrenadante, añadir 10 ml de medio completo al sedimento celular en los 15 ml de tubo de fondo cónico y resuspender las células.
- Repita el paso 5.14 y 5.15.
6. Cultivo de mezcla de células
- Eliminar el sobrenadante. Asegúrese de que el sedimento celular se mantiene inalterado.
- Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio completo y añadir la mezcla correspondiente a dos placas de cultivo celular de 10 cm etiquetados "orejas" y "cola".
- Añadir 10 l solución de anfotericina B (solución madre: 250 mg / ml) a la cultura.
- Se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
- En el tercer día, sustituir el medio con medio completo fresco que contiene 10 ml 10 l de anfotericina B para eliminar los residuos (Figuras 1 y 2).
7. Sub-cultivo de fibroblastos
- When cultivo alcanza alrededor de 70% de confluencia (día 3-4 de la cultura) se elimina el medio y se lavan las células con solución salina estéril fosfato 5 ml 1x tamponada (PBS).
- Retirar PBS y añadir 2 ml de solución de tripsina-EDTA 1x estéril a las células.
- Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
- Después de 5 minutos, toque suavemente la placa de cultivo y añadir 6 ml de medio completo a las células.
- Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml de fondo cónico y girar el tubo durante 5 min a 450 xg y ~ 4 ° C utilizando una centrífuga refrigerada celular.
- Eliminar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento de células en 5 ml de medio completo.
- Semilla 2 x 10 5 células en una placa de 10 cm de cultivo celular y se incuban las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora durante 3-4 días antes de repetir los pasos 7.1 a 7.6.
8. Preparación de Orejas para Embarque
Nota: Realice tque los pasos subsiguientes en una campana de cultivo celular estéril.
- La eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales apropiados.
- Coloque las tijeras y fórceps autoclave a la campana de cultivo celular.
- Añadir 50 ml de medio completo en un tubo de fondo cónico de 50 ml.
- Cortar orejas (~ 1 cm de radio) de un ratón con tijeras.
- La transferencia de los oídos en el tubo de fondo cónico de 50 ml (como se ha preparado en el paso 3) el uso de fórceps.
- Sellar el tubo inferior 50 ml cónico con parafina antes de enviar a temperatura ambiente en una caja apropiada.
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Representative Results
Extracción de fibroblastos de resultados de tejidos en una cantidad significativa de restos de tejido (Figura 1). En contraste con restos de tejido, los fibroblastos se adhieren a las superficies de plástico de cultivo de tejido entre el día 1 y 3 de la cultura. El medio de cultivos de fibroblastos se puede cambiar de forma segura en el día 3 de la cultura, lo que debería reducir significativamente los niveles de residuos presentes en la cultura (Figura 2). Los fibroblastos muestran una morfología alargada y un citoplasma claramente visible (Figuras 1 y 2). Las células mitóticas deben estar presentes desde el día 3 de la cultura en adelante y células deben llegar a un 70-80% de confluencia celular dentro de 3-4 días de cultivo. El rendimiento de los tejidos del oído y de la cola en una placa de cultivo de 10 cm oscila entre 4 a 5 x 10 5 (orejas) y de 5 a 6 x 10 5 células (cola) en el día 3 de la cultura. Tras el tercer día de aislamiento fibroblastos, las células pueden ser pasados y se sembraron a 2 x 10 5 células por 10 cm placa de cultivo.
Extracción de fibroblastos de oídos almacenados a temperatura ambiente durante 10 días debería dar como resultado en el 70-80% de confluencia celular dentro de 5 a 6 días de cultivo (Figura 3). Siembra de las células a 2 x 10 5 células por 10 cm placa de cultivo tras día 5 también debería dar lugar a aproximadamente 1 x 10 6 células dentro de 3-4 días de cultivo. El almacenamiento a largo plazo no afecta el tiempo que toma para los fibroblastos para entrar en senescencia en nuestra experiencia (datos no mostrados).
Para verificar la identidad de las células después de 3 días de cultivo, las células se pueden etiquetar para la vimentina fibroblastos marcador 14. Utilizando el protocolo anterior, se obtiene rutinariamente cultivos de fibroblastos puros, como se indica por la tinción de vimentina (Figura 4).
Figura 1. cultura de fibroblastos en el día 3 después de la extracción antes de cambiar de medio.Imágenes de campo claro representativos de los restos celulares (flechas blancas) presentes en el día 3 de la cultura. Las imágenes fueron capturadas en 100 × magnificación utilizando un microscopio de luz. La barra de escala representa 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. cultura de fibroblastos en el día 3 después de la extracción después de la adición del nuevo medio. Imágenes de campo claro representativos de los fibroblastos en el día 3 en la cultura. Las imágenes fueron capturadas en 100 × 320 × magnificación y el uso de un microscopio de luz. La barra de escala representa 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. cultura de fibroblastos en el día 3 después de la extracción de los tejidos del oído almacenados a temperatura ambiente durante 10 días. Imágenes de campo claro representativos de los fibroblastos en el día 3 en la cultura. Las imágenes fueron capturadas en 100 × 320 × magnificación y el uso de un microscopio de luz. La barra de escala representa 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Etiquetado de los cultivos de fibroblastos para vimentina. Imagen confocal Representante de oreja y rabo fibroblastos en el día 3 de la cultura. Los fibroblastos extraídos de los tejidos se marcaron para vimentina (rojo) y DAPI (azul). Las imágenes fluorescentes fueron adquiridos por micros confocalcopia. La barra de escala representa 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí le ofrecemos un procedimiento experimental simple, barato y rápido para establecer cultivos de fibroblastos primarios de las orejas y la cola de los ratones. La extracción debe resultar en fibroblastos en división adherentes y rápidamente dentro de 3 días post-aislamiento del tejido. Una limitación importante de células primarias es la senescencia, una detención del crecimiento permanente 15. Utilizando el protocolo, cultivos de fibroblastos se pueden pasaron durante 5 a 6 veces antes de fibroblastos senescentes se convierten, indicado por el aplanamiento de las células, aumentar de tamaño (2-3 veces de aumento) y el fracaso para expandir.
Al realizar el aislamiento de los fibroblastos, se debe prestar atención durante la interrupción de los tejidos, como el corte o la digestión insuficiente resultará en baja recuperación de los fibroblastos. Es posible agrupar los fibroblastos de oreja y rabo para aumentar el número de fibroblastos. Tejido adicional incluyendo peritoneal y tejido pulmonar procesado de la misma manera se puede añadir para aumentar tél número de fibroblastos. Aunque los desechos está presente en la cultura después de la extracción de los fibroblastos, se recomienda cambiar el medio sólo después del tercer día como fibroblastos toman tiempo para adherirse a las placas de cultivo celular.
Una limitación potencial del protocolo es el uso de tejidos no estériles y la posibilidad de contaminación microbiana asociada. Para reducir el riesgo de contaminación, orejas y la cola se incuban en 70% de etanol antes de recoger los fibroblastos. Además, se añade el antifúngico anfotericina B para el cultivo primario para evitar la proliferación de levaduras y hongos, un problema común al establecer cultivos de fibroblastos. El medio también contiene penicilina y estreptomicina para prevenir la contaminación bacteriana. El uso de estas precauciones, contaminaciones raramente se observan incluso cuando el establecimiento de fibroblastos de orejas y colas que se mantuvieron a temperatura ambiente durante varios días.
Una de las principales ventajas de este protocolo es el abildad para generar fibroblastos de oídos que estaban almacenados en un medio a temperatura ambiente durante un máximo de 10 días antes de fibroblastos aislamiento. Se observó una disminución de la eficiencia modestamente en el establecimiento de cultivo de fibroblastos de oído después de 10 días de almacenamiento (70-80% de confluencia se alcanza dentro de 5-6 días en comparación con los 3-4 días para recién aisladas de tejido). Por lo tanto, las orejas de ratones se pueden intercambiar por los investigadores que utilizan el envío estándar, aunque se recomienda el envío expreso. En nuestra experiencia, la facilidad de uso para obtener orejas y el hecho de que el tejido se utiliza raramente para los procedimientos experimentales a menudo permite el acceso a los tejidos de ratones genéticamente modificados que pueden llevar mucho tiempo para obtener de otra manera. Para las colas de la eficiencia de los fibroblastos se recuperan después de almacenamiento puede variar ampliamente y colas sólo debe usarse si los oídos no están disponibles para el envío. Por último, la mayoría de la gente debe ser capaz de realizar el protocolo, como la cosecha de tejido requiere experiencia mínima y capacitación en el manejo de los ratones.
El protocolo sólo se ha probado el uso de tejido de ratón, pero en teoría debería permitir la generación de cultivos de fibroblastos utilizando tejidos de otras especies, aunque el protocolo puede ser que necesite una mayor optimización.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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