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Neuroscience

Induction d'un Etat isoélectrique cerveau chargé d'enquêter sur l'impact de l'activité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité Published: March 31, 2016 doi: 10.3791/53576
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Summary

Cette procédure effectue de longue durée des enregistrements intracellulaires in vivo de neurones isolés au cours des états cérébraux physiologiquement pertinents et après l' abolition complète des activités électriques en cours, ce qui entraîne un état ​​du cerveau isoélectrique. Les constantes physiologiques de l'animal sont soigneusement surveillés pendant la transition vers l'état comateux artificiel.

Abstract

Les informations de processus de neurones façon dépend à la fois sur leurs propriétés membranaires intrinsèques et sur la dynamique du réseau synaptique afférente. En particulier, l'activité du réseau endogène généré, qui varie fortement en fonction de l'état de vigilance, modulent considérablement neuronal calcul. Pour étudier comment les différentes dynamiques cérébrales spontanées impact sur ​​les propriétés d' intégration des neurones simples de, nous avons développé une nouvelle stratégie expérimentale chez le rat consistant à supprimer in vivo toute l' activité cérébrale au moyen d'une injection systémique d'une forte dose de pentobarbital de sodium. activités corticales, surveillées en permanence par électrocorticogramme combinée (EcoG) et des enregistrements intracellulaires sont progressivement ralenties, conduisant à un profil isoélectrique stable. Cet état extrême du cerveau, en mettant le rat dans un état comateux profond, a été soigneusement contrôlée en mesurant les constantes physiologiques de l'animal tout au long des expériences. r intracellulairesecordings nous a permis de caractériser et de comparer les propriétés d'intégration du même neurone intégré dans la dynamique corticales physiologiquement pertinents, tels que ceux rencontrés dans le cycle veille-sommeil, et quand le cerveau était entièrement silencieux.

Introduction

En l'absence de stimuli environnementaux ou des tâches comportementales, le "repos" cerveau génère un flux continu de l'activité électrique qui peut être enregistré à partir du cuir chevelu, comme électroencéphalographiques (EEG) des ondes. Le corrélat intracellulaire de cette activité cérébrale endogène est caractérisée par des fluctuations de tension de la membrane de fond (également connu sous le nom de «bruit synaptique»), qui sont composés d'une combinaison de potentiels synaptiques excitateurs et inhibiteurs qui reflètent l'activité en cours des réseaux afférences 1,2. Cette activité spontanée varie en fréquence et en amplitude avec les différents états de vigilance. Elucider l'impact de l' activité du réseau sur l'excitabilité et la réactivité des neurones individuels est l' un des principaux défis des neurosciences 3,4.

De nombreuses études expérimentales et informatiques ont exploré l'impact fonctionnel de l'activité synaptique en cours sur la propertie intégratives des neurones. Cependant, le rôle des différents paramètres neuronaux touchés par le bruit de fond synaptique reste insaisissable. Par exemple, le niveau moyen de dépolarisation de la membrane a été trouvé de manière positive ou négative 5,6 09/07 corrélée avec la capacité des entrées sensorielles pour déclencher de potentiels d'action. De plus, alors que certaines études suggèrent que les fluctuations du potentiel de membrane, résultant d'un courant variant de façon continue des apports synaptiques afférences, affectent fortement la réactivité des neurones isolés en modulant le gain de leur relation d' entrée-sortie 3,10-13, d' autres indiquent que les changements dans la conductance membranaire entrée à médiation par l' inhibition shuntage sont suffisantes pour moduler le gain neuronale indépendamment de l'ampleur des fluctuations des membranes 14,15. Enfin, des études récentes effectuées sur des animaux éveillés ont souligné comment le traitement de l'information sensorielle unique neurone dépend essentiellement de l'état de vigilance d'une la demande 16,17 comportementale actuelle.

Une stratégie simple pour élucider le rôle fonctionnel d'un procédé donné dans un système hautement interconnectée est de déterminer son absence modifie spécifiquement le fonctionnement du système. Cette méthode a été largement utilisé dans la recherche en neurosciences, par exemple en utilisant des lésions expérimentales ou inactivation des différentes zones du cerveau 18-21, ou le blocage pharmacologique des canaux ioniques spécifiques 22,23. Notamment, il a été appliqué in vivo pour dévoiler la façon dont la connectivité réseau et la dynamique fonctionnelle affectent le calcul de la cellule unique 24-27. Cependant, à ce jour les manipulations locales destinées à bloquer la décharge des neurones et / ou de perturber leurs propriétés biophysiques de base peut être partiellement efficace et sont limitées à des volumes relativement faibles du cerveau 28.

Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle approche expérimentale in vivo dans dele rat pour comparer les propriétés électrophysiologiques des neurones individuels enregistrés dans un état ​​du cerveau donnée, à savoir, intégrés dans un réseau particulier dynamique, à ceux obtenus après la suppression complète du cerveau toute l' activité synaptique 29. Dans les conditions témoins, deux dynamiques corticales distinctes pourraient être générés. électrocorticographiques (ECoG) Les habitudes de sommeil-like ont été induites par l'injection de doses modérées de pentobarbital de sodium. Alternativement, les vagues ECoG rapides de faible amplitude comparable à l'activité corticale sous-jacente de l'état de veille (le dessin d'éveil-like) pourraient être produites par injection de fentanyl. Par la suite, tout en conservant la même EcoG et l'enregistrement intracellulaire, une inactivation complète de l'activité électrique du cerveau endogène a été obtenu par injection systémique d'une dose élevée de pentobarbital sodique, caractérisé par EcoG isoélectrique et les activités intracellulaires. Parce que l'induction d'un tel coma extrême pourrait avoir CONSÉCUTIFS fatalebureaux sur les fonctions biologiques, une surveillance attentive et continue des variables physiologiques était essentielle. Par conséquent, nous avons suivi avec soin la fréquence cardiaque de battement, la concentration de CO 2 télé-expiratoire (EtCO 2), la saturation en O 2 (SpO 2) et la température du coeur du rat au cours des expériences.

Nous évaluons simples propriétés des neurones au cours de ces différents états à l' aide de microélectrodes pointus, qui sont particulièrement adaptés pour les enregistrements longs et stables in vivo. La procédure décrite ici, peut être combiné avec d'autres approches électrophysiologiques et d'imagerie et pourrait être étendu à d'autres modèles animaux.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec les directives de l'Union européenne (directive 2010/63 / UE) et approuvé par le Comité d'éthique Charles Darwin sur l'expérimentation animale. Nous décrivons ici la procédure que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire, mais la plupart des mesures peuvent être adaptées pour répondre aux besoins spécifiques de chacun.

1. Préparation chirurgicale

Note: Tous les points d'incision et de pression doivent être infiltrés à plusieurs reprises avec un anesthésique local (lidocaïne ou bupivacaïne). La présente procédure est terminal, si une préparation aseptique est nécessaire plusieurs modifications doivent être mises en œuvre.

  1. Anesthésier un rat avec du pentobarbital sodique (40 mg / kg) et de kétamine (50 mg / kg) par voie intrapéritonéale à deux séparés localement (IP) d'injections.
  2. Laissez l'animal aller sous anesthésie générale et à plusieurs reprises vérifier qu'un plan chirurgical de l'anesthésie est atteint (pas de réaction aux pieds pincement). Placez le rat sur une feedback couverture chauffante et insérer une sonde rectale pour maintenir la température de base d'environ 37 ° C.
  3. Placer un cathéter dans la cavité peritoneale afin de faciliter l' injection ultérieure d'agents anesthésiques et pour éviter des organes de perforation par piqûres d'aiguille répétées 30.
    1. Couper les poils sur un petit (~ 2 - 3 mm) zone au-dessus d'une région située dans le quadrant inférieur droit ou gauche de l'estomac.
      Remarque: la crème dépilatoire peut également être utilisé.
    2. Faire un 2 - mm incision 3 sur la peau avec des ciseaux pointus ou un scalpel. Utilisation de dissection, enlever les couches de graisse et de muscle jusqu'à ce que la cavité péritonéale est observée.
    3. Insérez environ 1 - 2 cm d'un petit cathéter dans la cavité et fermer la plaie avec de la colle chirurgicale.
      (. Par exemple, 2 Français - correspondant à 0.043 mm de diamètre intérieur): Remarque Le diamètre et la longueur totale du cathéter devrait être minime pour réduire les volumes morts. tubes en polyuréthane sont les plus adaptés.
    4. Faire une boucle et la suture til cathéter à la peau pour le fixer en place.
  4. Installez un tube trachéal pour contrôler la ventilation pendant la respiration artificielle.
    1. Quant à l'étape précédente, préparer la zone d'intérêt (1 - 2 cm au-dessus de la trachée juste au-dessus du manubrium), enlever les poils et inciser la peau.
    2. Blunt disséquer les premières couches de graisse et de muscles, puis déplacez la glande salivaire de côté et exposer la trachée en disséquant doucement la dernière couche de muscles.
    3. Retirez délicatement les tissus sur la trachée et glisser un fil ci-dessous à l'aide de petites pinces. Faire le noeud d'un chirurgien avec le fil, mais ne pas serré encore.
    4. Inciser la transversale trachée entre deux anneaux cartilagineux. sang Swab dans la trachée le cas échéant.
    5. Insérez un tube trachéal avec le diamètre approprié et serrer le noeud du fil pour fixer le tube stable. Pour plus de stabilité le fil peut en outre être fixé à un point du tube de trachée supérieur.
    6. Suture la plaie à proximité ou utiliser des agrafes chirurgicales. Éviter la colle chirurgicale ici si le tube trachéal est destiné à être réutilisé.
  5. Installez l'animal dans un cadre stéréotaxique et surveiller attentivement les variables physiologiques suivantes: ECoG, SpO 2, ETCO 2, la fréquence cardiaque (via un électrocardiogramme, ECG) et de la température interne. Surveiller et ajuster ces variables afin de maintenir une bonne profondeur de l'anesthésie et de l'état physiologique. Plus précisément, compléter l'anesthésie avec une faible dose (10 mg / kg) de pentobarbital sodique si nécessaire.
  6. Appliquer une pommade oculaire sur les deux yeux pour éviter la dessiccation. Couper les poils sur le cuir chevelu, faire une incision longitudinale (~ 2 cm) et réséquer les tissus conjonctifs recouvrant le crâne à l'aide d'un scalpel ou d'une curette.
  7. Faire un petit (~ 1,5 mm de diamètre) craniotomie sur la région d'intérêt avec une perceuse dentaire.
    Note: Ici, le champ du cortex somatosensoriel primaire du canon est ciblé (7 - 8 mm antérieure à la ligne interauriculaire, 4.5- 5,5 mm latéralement à la ligne médiane 31). Rincer à plusieurs reprises pour dissiper la chaleur.
  8. Utilisez une pince extra fines pour faire doucement un petit trou dans la dure-mère. Réserver une région ~ 0,5 mm dans le trépanation crânienne pour placer l'électrode EcoG (voir l'étape suivante). En permanence garder le cortex humide avec une solution de NaCl à 0,9% (ou de liquide céphalo-rachidien artificiel).
  9. Placer une impédance faible (~ 60 kQ) électrode d'argent (l'électrode ECoG) sur la dure-mère, en évitant la région corticale ne sont pas couverts par les méninges et placer l'électrode de référence sur un muscle du cuir chevelu de l'autre côté de la tête.
  10. À ce stade (30 minutes après l'injection de pentobarbital de sodium dernière), à ​​maintenir l'anesthésie par des injections répétées de pentobarbital sodique (10-15 mg / kg / h) ou fentanyle (3-6 ug / kg / h) par l'intermédiaire du cathéter IP. L'ancien se traduira par une oscillation lente, motif EcoG semblable au sommeil alors que celui-ci se traduira par un désynchronisé, comme la veille, le profil corticale.
  11. Réglez la v artificielleSystème de entilation de sorte que la fréquence et le volume respiratoire sont semblables à ceux de la respiration spontanée du rat (plage normale 70-115 respiration / min 32). Ensuite, connectez la ventilation mécanique au tube trachéal et vérifier l'inflation de la cage thoracique appropriée (des deux côtés). Sinon, régler la position du tube d'aération dans l'axe de la trachée. Si nécessaire, aspirer la sécrétion présente dans la trachée d'un cathéter relié à une seringue ou d'une pompe à vide.
  12. Si toutes les variables physiologiques 32-35 et EcoG 29,36 motifs reflètent un plan chirurgical stable de l' anesthésie, faire une injection intramusculaire de gallamine triéthiodure dans chaque jambe de paralyser le rat, 40 mg / kg pour la première injection, puis 20 mg / kg , chaque 2hr 19,29,36,50.

2. intracellulaires Recordings

  1. Tirez une micropipette de verre (microélectrodes forte) avec un ~ 0,2 um pointe telles que sa résistance varie between 50 et 80, une fois rempli avec MQ 2 M d'acétate de potassium (KAc).
  2. Placer la pipette dans un support spécifique avec un argent / chlorure d'argent (Ag / AgCl) pour connecter le fil de la solution de la pipette à un amplificateur intracellulaire (par l'intermédiaire d'un étage de tête). Le titulaire doit être attaché à un micromanipulateur. Placer une électrode de référence Ag / AgCl sur les muscles du cou du rat.
  3. Introduire lentement la pipette dans le cerveau jusqu'à la région d'intérêt et de vérifier sa résistance en surveillant les chutes de tension en réponse aux mesures actuelles. Utilisez le buzz (ou zapper) touche de l'amplificateur pour effacer la pipette si nécessaire.
  4. Utilisez des cotons-tiges ou des triangles d'absorption synthétiques pour sécher la craniotomie (attention à ne pas toucher le EcoG ou électrodes intracellulaires) avant de le couvrir avec un élastomère de silicone ou 4% d'agarose pour réduire les mouvements du cerveau.
  5. Abaisser la pipette dans 1 - 2 pm étapes jusqu'à ce que sa résistance augmente à l'approche d'une cellule. Ensuite, utilisez la fonction de buzz de l'amplificateur à PenetraTe dans le neurone.

3. Provoquer l'État isoélectrique

  1. Effectuer le protocole expérimental approprié (par exemple, les courants de tir réponses aux injecté intracellulairement, les relations courant-tension, les réponses des stimuli sensoriels) à ce stade , tout en surveillant simultanément le potentiel de membrane du neurone, le EcoG et les variables physiologiques.
  2. Assurez-vous que l'électrode intracellulaire est stable dans la cellule en analysant la stabilité à la fois du potentiel de membrane et l'action, propriétés potentielles tout au long de la session d'enregistrement. Si non, ne vont pas à l'étape suivante et attendre jusqu'à ce que l'enregistrement devienne stable à nouveau ou rechercher un autre neurone.
  3. Injecter une dose élevée, mais infra-létale de pentobarbital de sodium (~ 90 mg / kg, peut être aussi faible que 35 mg / kg de la condition initiale du pentobarbital et jusqu'à 155 mg / kg du fentanyl état initial) via la ligne IP.
    Remarque: Dans les 15 - 20 min intracellulaire et EcoG waveforms devrait ralentir avec des silences électriques intermittents pour atteindre transitoirement le "burst-suppression» que l' on appelle le profil de 37,38, qui s'écroule progressivement à un état ​​isoélectrique complet. Il est prévu que le rythme cardiaque ralentit considérablement (d'environ 10 - 20%) , mais la SpO 2 et EtCO 2 devrait rester relativement stable.
  4. Si l'état isoélectrique est pas atteint, l'injection d'une petite quantité de pentobarbital sodique (~ 10% de la dose étape 3.1). Attendez 15 min avant d'ajouter plus anesthésique si l'état isoélectrique est toujours pas atteint.
  5. Répétez le protocole expérimental pour comparer l'impact de la dynamique du réseau sur les propriétés d'intégration du neurone enregistré.
    Note: Après l'arrêt des injections anesthésiques, l'activité électrique du cerveau devrait se rétablir complètement dans les 3 à 4 heures.
  6. A la fin de l'expérience, l'injection d'une dose létale de pentobarbital de sodium (200 mg / kg, IP) pour euthanasier le rat.

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Representative Results

Induire et le maintien d' un état ​​du cerveau isoélectrique est délicate in vivo procédure expérimentale. Il a été prouvé être un outil puissant pour étudier directement l'impact de l' activité du réseau cortical sur l' excitabilité neuronale et la fonction de transfert 29. La figure 1 montre la surveillance multi-paramètres, y compris EcoG et des constantes vitales, de l' état ​​physiologique de l'animal avant (Figure 1A ) et après (figure 1B) induction de l'état isoélectrique.

Figure 1
Figure 1. Surveillance des paramètres physiologiques dans des conditions isoélectriques contrôle et.
A et B, les enregistrements simultanés de EcoG (top traces) et des paramètres physiologiques au cours de l' état ​​actif corticale (A) et sous - marinsequent période isoélectrique (B). La température centrale (Temp.), EtCO 2 et SpO 2 sont essentiellement stables tout au long de l'expérience. Taux de battement de coeur, en revanche, diminue progressivement après l'induction de l'état isoélectrique (de 382 à 349 battements / min), comme on le voit sur ​​l'ECG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pendant les sessions de contrôle, les paramètres physiologiques ont été similaires à celles mesurées chez les animaux sains et éveillés 32-35 et sont restées inchangée après l' induction de l'état isoélectrique, à l' exception de la fréquence cardiaque qui a été légèrement ralentie (figure 1). Cette est un point important puisque l' hypoxie 39 ou hypercapnie 40 peut sensiblement modifier l' excitabilité neuronale et peut donc introduire un biais grave dans un goujon y explorer un cerveau modulation dépendant de l'état des propriétés intégratives neuronales.

Nous avons obtenu le statut isoélectrique de deux conditions initiales différentes imitant la dynamique corticales endogène générées durant les premiers stades du sommeil (Figure 2AA, panneau de gauche) ou pendant la veille (Figure 2Ab, panneau de gauche). Ces états actifs ont été soit induite par injection de pentobarbital de sodium (semblable au sommeil) ou le fentanyl (réveil-like). Dans les deux cas, l'injection ultérieure d'une forte dose de pentobarbital de sodium a entraîné une suppression complète de l' activité spontanée dans le EcoG et les neurones enregistrés simultanément (Figure 2Aa et b, panneaux à droite), d' où le terme isoélectrique. La suppression de l'activité synaptique continue a entraîné une importante constante hyperpolarisation du potentiel de membrane neuronale (figure 2B).

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 2
Figure 2. Conséquences de l' activité synaptique répression sur la dynamique spontanée de potentiel membranaire.
(A) Enregistrements représentatifs simultanées de EcoG (top traces) et les activités intracellulaires (Intra, traces de fond) pendant le sommeil comme (A a) et le réveil-like (A b) motifs (panneaux de gauche), et pendant les époques isoélectriques ultérieures correspondantes (aux moments indiqués après l'injection suppressive; isoélectriques, panneaux à droite). L'analyse temps-fréquence des signaux électrocochléographie (densité d'énergie pour le 0 - 50 Hz gamme de fréquence) est représenté par des échelles de couleur. Densités (B) de probabilité (P) de la membrane des valeurs potentielles (Vm, la taille du bac 0,5 mV, 10 sec de l'enregistrement) des neurones illustrés dans le panneau A. Ce chiffre a été modifié, avec permission, de ref 29./ftp_upload/53576/53576fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour illustrer l'impact fonctionnel de cet état du cerveau extrême, nous avons extrait les propriétés intrinsèques passives et actives de neurones isoélectriques et les avons comparées à celles mesurées au cours de la condition initiale correspondante. En utilisant cette stratégie, nous avons montré que les neurones pouvaient tirer des potentiels d'action en réponse à l' injection intracellulaire du courant de dépolarisation pendant l'état isoélectrique, ce qui démontre qu'ils sont restés pleinement excitable , même après la suppression complète de l' arrière - plan l' activité synaptique (Figure 3Aa et b, isoélectrique). Par ailleurs, nous avons constaté que la fonction de transfert des neurones, évaluée en mesurant la fréquence de déclenchement induite par étapes de courant d'intensité croissante (relation FI) dépolarisant, est décalée à droite par rapport aux conditions initiales actives, ce qui indiqueune diminution de la sensibilité des neurones aux entrées excitatrices faibles (figure 3B). Le gain neuronal, à savoir, la pente de la courbe de FI correspondant, est resté inchangé ou a été réduite lorsque l'état de contrôle était de type réveil sommeil- ou, respectivement (figure 3B). De manière surprenante, la résistance d'entrée de neurones apparente n'a pas été modifiée de façon significative en l'absence d'entraînement synaptique par rapport aux conditions de contrôle actif (figure 3AA b). Plus de résultats, y compris l' analyse de la population et la quantification des modes de tir temporels de neurones dans les conditions actives et isoélectriques, sont disponibles dans notre document initial 29.

Figure 3
Figure 3. Impact comparatif des modèles Trois corticale Activité sur les propriétés membranaires et des relations d' entrée-sortie.
(A) Voltag réponses e (traces du milieu) de neurones corticaux somatosensoriel à dépolarisants et des impulsions de courant hyperpolarisants (traces en bas) pendant le sommeil comme (un A) et le réveil-like (A b) les modèles de ECoG (top records) et après la privation de l' activité synaptique (isoélectrique ). Résistance à la membrane d'entrée (R m, les valeurs sont indiquées) a été mesurée à partir de chutes de tension (traces grises, moyennes de 20 essais) induits par hyperpolarisants injections d'impulsion de courant (-0,4 nA). (B) courbes FI correspondantes, fournissant la fonction de transfert des neurones illustrés dans le panneau (A). Le taux d'allumage a été mesurée en réponse à la dépolarisation des impulsions de courant (200 msec) d'intensité croissante. Chaque intensité de courant a été appliqué 20 fois et les taux de combustion correspondants ont été en moyenne. Les lignes pointillées indiquent les réponses des cellules indiquées en (A). Ce chiffre a été modifié, avec permission, de ref 29.télécharger / 53576 / 53576fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour supprimer in vivo l' activité électrique cérébrale spontanée à la fois le réseau et les niveaux cellulaires. Cette procédure conduit à un état ​​du cerveau extrême, connu sous le nom comateux isoélectrique 41. D'un point de vue clinique, une telle inactivité est l'anomalie électrique cérébral la plus sévère qui peut être vu sur l'EEG. Elle est principalement associée à un coma irréversible, avec tous les patients soit mourants ou continue dans un état ​​végétatif persistant 42, mais peut être au moins partiellement inversée lorsque causée par une intoxication avec nerveux médicaments dépresseurs du système central (comme thiopental), une hypothermie accidentelle 42 ou un asphyxique arrêt cardiaque 43. Dans notre modèle expérimental, l'état isoélectrique est progressivement réalisée par une injection systémique de pentobarbital sodique à des doses élevées, ce qui induit rapidement une première diminution de la teneur en fréquence EcoG, un mode "burst-suppression"41,42, ce qui conduit finalement à une EcoG complètement à plat. Au niveau intracellulaire, la disparition de l'activité spontanée suit un cours de temps similaire avec une réduction concomitante de dépolarisation et de la membrane hyperpolarisant fluctuations potentielles. Ainsi, on peut supposer que l'injection de pentobarbital de sodium augmente d' abord la transmission synaptique inhibiteur conduisant à une réduction de l' activité des neurones corticaux de tir, la suppression progressive de la transmission synaptique excitatrice et d' inhibition qui résulte finalement en EcoG isoélectrique et les activités intracellulaires 29,44. Transitions similaires d'active à motifs ECoG isoélectriques peuvent être obtenus suite à l'administration d'autres agents anesthésiques tels que la kétamine (observation personnelle) ou isoflurane 45,46.

La procédure peut sembler relativement simple. Cependant, en raison de l'état comateux extrêmement profond induit, le maintien des variables physiologiques de base au sein deles plages normales est d'une importance capitale pour le succès de l'expérience. Les changements dans EtCO 2 fluctuations peuvent être le résultat d'un bouchon muqueux formant dans la trachée. Dans une telle situation, le ventilateur doit être débranché et le mucus rapidement aspiré ou effacé par le tube trachéal. En outre, la stabilité mécanique de la préparation est cruciale pour l'enregistrement intracellulaire. Ainsi, des efforts particuliers doivent être faits pour réduire vasculaire et respiratoire pulsations, en ajustant soigneusement le corps du rapport de l'animal à la tête tout en maintenant un bon alignement du tube trachéal, et en appliquant agarose ou élastomère de silicone sur la craniotomie. Il est également nécessaire d'éviter les contractions spontanées du muscle par l'injection d'un agent paralysant. Enfin, les vibrations de l'environnement et du bruit électrique devraient être réduits autant que possible. D' autres publications en détail les étapes essentielles pour un optimal dans la préparation in vivo permettant intracellulaire stable ou patch-clamp quiLe enregistrements de cellules 29,47-50.

La capacité de découpler neuronales propriétés membranaires intrinsèques et des réseaux dynamiques est essentielle pour disséquer les mécanismes par lesquels les neurones individuels traitent l'information dans leur environnement hautement connecté. Comme indiqué dans l'introduction, des études antérieures consacrées à cette question centrale des neurosciences fondamentales ont conduit à des résultats contradictoires, en partie en raison des caractéristiques spécifiques des neurones et des réseaux étudiés et les diverses conditions expérimentales, y compris in vitro vs préparations in vivo et, éventuellement, la les techniques d'anesthésie différents utilisés (voir par exemple 29,36,51). Nous proposons que la présente approche pourrait être utilisée pour valider et réconcilier éventuellement, les résultats obtenus à partir du réduit dans la préparation in vitro et à partir des expériences in vivo. En effet, elle permet d'examiner et de comparer dans la même neurone et au cours de la même procédure expérimentale directementl'impact des modèles distincts d'entrées synaptiques afférences, de la dynamique-comme la veille pour terminer l'inactivité, sur les propriétés d'intégration neuronales dans un animal vivant.

Un trait distinctif de ce protocole est que, une fois maîtrisé, il peut être combiné avec d'autres techniques expérimentales, telles que la surface et la profondeur EEG enregistrements multisites, des indicateurs fluorescents génétiquement codés enquêtes fondées et imagerie même hémodynamique et métabolique du cerveau, pour enquêter sur le caractère multidimensionnel propriétés du cerveau isoélectrique. Comme perspectives cliniques et diagnostiques, puisque nous avons démontré que les neurones sont encore excitable pendant le coma isoélectrique persistant, il serait pertinent de tester les fonctions corticales, par exemple le traitement de l'information sensorielle, des patients et des modèles animaux immergés dans un tel état pathologique du cerveau inactivité.

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Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de France, l'Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, l'Université Pierre et Marie Curie et le programme «Investissements d'avenir 'ANR-10-IAIHU-06.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Pentobarbital Centravet Pentobarbital
Ketamine 500 Merial Imalgène 500
Fentanyl  Janssen-Cilag Fentanyl
Xylocaine Centravet Xylovet
Gallamine triethiodide Sigma G8134
ECoG amplifier A-M Systems AC amplifier, Model 1700
Intracellular amplifier Molecular Devices Axoclamp 900A
Data acquisition interface Cambridge Electronic Design CED power 1401-3 
Data analysis software Cambridge Electronic Design Spike2 version 7
micromanipulator Scientifica IVM-3000
Capillary Puller Narishige PE-2
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-10
Silver wire 0.125 mm (intracellular recording) WPI AGT0525
Ag-AgCl reference Phymep E242
Silver wire 0.25 mm (ECoG recording) WPI AGT1025
Artificial respiration system Minerve Alpha Lab
Physiological parameters monitoring Digicare LifeWindow Lite
Heating Blanket Harvard Apparatus 507215
Stereomicroscope Leica M80
Scissors FST 15005-08
Forceps Dumont #5 FST 11295-10
Forceps Dumont #5SF FST 11252-00
IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69 mm   Instech BTPU-027
Silicon elastomere WPI KWIK-CAST
Dental drill NSK Y1001151 and P496
Surgical glue 3M vetbond

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fatt, P., Katz, B. Some observations on biological noise. Nature. 166 (4223), 597-598 (1950).
  2. Brock, L. G., Coombs, J. S., Eccles, J. C. The recording of potentials from motoneurones with an intracellular electrode. J. Physiol. 117 (4), 431-460 (1952).
  3. Destexhe, A., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  4. Silver, R. A. Neuronal arithmetic. Nat. Rev. Neurosci. 11 (7), 474-489 (2010).
  5. Azouz, R., Gray, C. M. Cellular mechanisms contributing to response variability of cortical neurons in vivo. J. Neurosci. 19 (6), 2209-2223 (1999).
  6. Sanchez-Vives, M. V., Nowak, L. G., McCormick, D. A. Membrane Mechanisms Underlying Contrast Adaptation in Cat Area 17 In Vivo. J. Neurosci. 222 (11), 4267-4285 (2000).
  7. Petersen, C. C. H., Hahn, T. T. G., Mehta, M., Grinvald, A., Sakmann, B. Interaction of sensory responses with spontaneous depolarization in layer 2/3 barrel cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (23), 13638-13643 (2003).
  8. Sachdev, R. N. S., Ebner, F. F., Wilson, C. J. Effect of Subthreshold Up and Down States on the Whisker-Evoked Response in Somatosensory Cortex. J. Neurophysiol. 92 (6), 3511-3521 (2004).
  9. Hasenstaub, A., Sachdev, R. N. S., McCormick, D. A. State Changes Rapidly Modulate Cortical Neuronal Responsiveness. J. Neurosci. 27 (36), 9607-9622 (2007).
  10. Chance, F. S., Abbott, L. F., Reyes, A. D. Gain modulation from background synaptic input. Neuron. 35 (4), 773-782 (2002).
  11. Shu, Y., Hasenstaub, A., Badoual, M., Bal, T., McCormick, D. A. Barrages of synaptic activity control the gain and sensitivity of cortical neurons. J. Neurosci. 23 (32), 10388-10401 (2003).
  12. Mitchell, S. J., Silver, R. A. Shunting inhibition modulates neuronal gain during synaptic excitation. Neuron. 38 (3), 433-445 (2003).
  13. Prescott, S. A., De Koninck, Y. Gain control of firing rate by shunting inhibition: roles of synaptic noise and dendritic saturation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (4), 2076-2081 (2003).
  14. Graham, L. J., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and IBK in Rat and Cat Cortex. Dynamic-clamp: From principles to applications. , (2009).
  15. Fernandez, F. R., White, J. A. Gain control in CA1 pyramidal cells using changes in somatic conductance. J. Neurosci. 30 (1), 230-241 (2010).
  16. Polack, P. O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat. Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
  17. Zhou, M., Liang, F., et al. Scaling down of balanced excitation and inhibition by active behavioral states in auditory cortex. Nat. Neurosci. 17 (6), 841-850 (2014).
  18. Contreras, D., Destexhe, A., Sejnowski, T. J., Steriade, M. Spatiotemporal Patterns of Spindle Oscillations in Cortex and Thalamus. J. Neurosci. 17 (3), 1179-1196 (1997).
  19. Charpier, S., Mahon, S., Deniau, J. M. In vivo induction of striatal long-term potentiation by low-frequency stimulation of the cerebral cortex. Neuroscience. 91 (4), 1209-1222 (1999).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and Mechanisms of Wakefulness on Local Cortical Networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
  21. Poulet, J. F. A., Fernandez, L. M. J., Crochet, S., Petersen, C. C. H. Thalamic control of cortical states. Nat. Neurosci. 15 (3), 370-372 (2012).
  22. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes, Third Edition. , Sinauer Associates. Sunderland, Mass. (2001).
  23. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  24. Ferster, D., Chung, S., Wheat, H. Orientation selectivity of thalamic input to simple cells of cat visual cortex. Nature. 380 (6571), 249-252 (1996).
  25. Paré, D., Shink, E., Gaudreau, H., Destexhe, A., Lang, E. J. Impact of spontaneous synaptic activity on the resting properties of cat neocortical pyramidal neurons In vivo. J. Neurophysiol. 79 (3), 1450-1460 (1998).
  26. Destexhe, A., Paré, D. Impact of network activity on the integrative properties of neocortical pyramidal neurons in vivo. J. Neurophysiol. 81 (4), 1531-1547 (1999).
  27. Kara, P., Pezaris, J. S., Yurgenson, S., Reid, R. C. The spatial receptive field of thalamic inputs to single cortical simple cells revealed by the interaction of visual and electrical stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (25), 16261-16266 (2002).
  28. Lomber, S. G. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. J. Neurosci. Meth. 86 (2), 109-117 (1999).
  29. Altwegg-Boussac, T., Chavez, M., Mahon, S., Charpier, S. Excitability and responsiveness of rat barrel cortex neurons in the presence and absence of spontaneous synaptic activity in vivo. J. Physiol. 592 (16), 3577-3595 (2014).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl. Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates (2nd edn). , Academic Press. (1986).
  32. Wolfensohn, S. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. , Wiley-Blackwell. (2013).
  33. Bester, H., Chapman, V., Besson, J. M., Bernard, J. F. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. J. Neurophysiol. 83 (4), 2239-2259 (2000).
  34. Greene, S. A. Veterinary Anesthesia and Pain Management Secrets. , Elsevier Health Sciences. (2002).
  35. Morgan, B. J., Adrian, R., Bates, M. L., Dopp, J. M., Dempsey, J. A. Quantifying hypoxia-induced chemoreceptor sensitivity in the awake rodent. J. Appl. Physiol. 117 (7), 816-824 (2014).
  36. Mahon, S., Deniau, J. M., Charpier, S. Relationship between EEG potentials and intracellular activity of striatal and cortico-striatal neurons: an in vivo study under different anesthetics. Cereb. Cortex. 11 (4), 360-373 (2001).
  37. Ganes, T., Lundar, T. The effect of thiopentone on somatosensory evoked responses and EEGs in comatose patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 46 (6), 509-514 (1983).
  38. Schmid-Elsaesser, R., Schröder, M., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. EEG burst suppression is not necessary for maximum barbiturate protection in transient focal cerebral ischemia in the rat. J. Neurol. Sci. 162 (1), 14-19 (1999).
  39. Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G. Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J Clin Invest. 91 (2), 608-615 (1993).
  40. Gu, X. Q., Kanaan, A., Yao, H., Haddad, G. G. Chronic High-Inspired CO2 Decreases Excitability of Mouse Hippocampal Neurons. J. Neurophysiol. 97 (2), 1833-1838 (2007).
  41. Lehembre, R., Gosseries, O., et al. Electrophysiological investigations of brain function in coma, vegetative and minimally conscious patients. Arch Ital Biol. 150 (2/3), 122-139 (2012).
  42. Husain, A. M. Electroencephalographic assessment of coma. J Clin Neurophysiol. 23 (3), 208-220 (2006).
  43. Fink, E. L., Alexander, H., et al. An Experimental Model of Pediatric Asphyxial Cardiopulmonary Arrest in Rats. Pediatr Crit Care Med. 5 (2), 139-144 (2004).
  44. Lukatch, H. S., McIver, M. B. Synaptic mechanisms of thiopental-induced alterations insynchronized cortical activity. Anesthesiology. 84, 1425-1434 (1996).
  45. Kroeger, D., Amzica, F. Hypersensitivity of the anesthesia-induced comatose brain. J Neurosci. 27, 10597-10607 (2007).
  46. Kroeger, D., Florea, B., Amzica, F. Human brain activity patterns beyond the isoelectric line of extreme deep coma. PLoS ONE. 8 (9), e75257 (2013).
  47. Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Arch. 444 (4), 491-498 (2002).
  48. DeWeese, M. Whole-Cell Recording In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. , (2007).
  49. Schramm, A. E., Marinazzo, D., Gener, T., Graham, L. J. The Touch and Zap Method for In Vivo Whole-Cell Patch Recording of Intrinsic and Visual Responses of Cortical Neurons and Glial Cells. PLoS ONE. 9 (5), e97310 (2014).
  50. Mahon, S., Charpier, S. Bidirectional Plasticity of Intrinsic Excitability Controls Sensory Inputs Efficiency in Layer 5 Barrel Cortex Neurons in Vivo. J. Neurosci. 32 (33), 11377-11389 (2012).
  51. Destexhe, A., Rudolph, M., Paré, D. The high-conductance state of neocortical neurons in vivo. Nat. Rev. Neurosci. 4 (9), 739-751 (2003).

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Neuroscience numéro 109 les enregistrements intracellulaires, l'excitabilité l'activité synaptique ECoG isoélectriques cortex le coma des constantes physiologiques cérébraux
Induction d&#39;un Etat isoélectrique cerveau chargé d&#39;enquêter sur l&#39;impact de l&#39;activité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité<em&gt; In Vivo</em
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