Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur met behulp van twee-foton microscopie in een muismodel van de HIV-geïnduceerde Neuroinflammation

Introduction

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) binnendringt de hersenen tijdens de acute fase van virusinfectie en productief infecteert zowel microglia en brein macrofagen, waardoor hun activering - de afgifte van zowel gastheer afkomstig ontstekingsmediatoren en oplosbare HIV-1 virotoxins zoals Tat en gp120 (besproken ⁱⁿ 1,2). Bijgevolg wordt een chronische neuro-inflammatoire toestand ingesteld in het CZS, waarvan wordt gedacht dat bijdraagt ​​aan de pathogenese van HIV-1 geassocieerde Neurocognitieve Disorders (HAND) ^3-5.

Chronische overexpressie van HIV-1 Tat en interleukine (IL) -17A in het CZS van muizen is aangetoond dat het resulteert in microvasculaire verdunning ^6,7. Dit verhoogt de mogelijkheid dat chronische inflammatoire processen kan bijdragen tot de pathogenese van de hand door effecten op de cerebrale vasculatuur. Om dit vraagstuk nader te bestuderen, hebben we methoden om cerebrovasculaire struc kwantificeren ontwikkeldturen.

Dit document beschrijft een werkwijze voor het kwantificeren van het aantal capillaire knooppunten capillaire segmenten gemiddelde segmentlengte, totale segmentlengte, gemiddelde capillair diameter en totale capillaire volume met in vivo beeldvorming van capillaire netwerken via een dunne schedel corticale venster (gemodificeerd van eerder beschreven protocols) ^8,9, en ex vivo beeldvorming van hersencoupes, met behulp van twee-foton microscopie. Deze gecombineerde aanpak voorziet in een holistische kwantificering van cerebrale vasculaire parameters, omdat de in vivo dunne schedel corticale venster zorgt voor het behoud van de cerebrale milieu, maar ex vivo beeldvorming van capillaire netwerken in hersencoupes maakt de reconstructie van de volledige driedimensionale capillaire netwerken - dat vervolgens kan worden gekwantificeerd met behulp van commercieel verkrijgbare software.

Protocol

De Universiteit van de Universiteit van Rochester Comité op Animal Resources goedgekeurd alle procedures uitgevoerd in dit document.

1. Pre-operatieve voorbereiding (Muizen)

1. Bereid de chirurgische gebied met alle benodigde apparatuur. Steriliseren alle gereedschappen die tijdens de procedure vooraf behulp 70% ethanol. Optioneel gebruik maken van een glazen kraal sterilisator of autoclaaf om de instrumenten te steriliseren.
2. Plaats de muis in een isofluraan inductie kamer aangesloten op een isofluraan vaporizer. Stel isofluraan niveau tot 4% bij een snelheid van 1 l / min.
   Opmerking: voor de experimenten hier gerapporteerde muizen met doxycycline (DOX) induceerbaar HIV-1 Tat transgen gedreven door astrocyt specifieke gliale fibrillaire eiwit (GFAP) promoter (HIV Tat-Tg-muizen) ¹⁰ werden gebruikt om het effect van HIV onderzocht -1 veroorzaakte neuro-inflammatie op de cerebrale vasculaire structuur, zoals eerder beschreven ^7,10.
3. Zachtjes tip de inductie kamer te observeren de muis &# 39; s oprichtende reflex. Zodra de oprichtreflex is onderdrukt, stellen de isofluraan niveau 2% en leid de luchtstroom van de inductie kamer naar de neuskegel van de operatiewond bank.
4. Beweeg snel de muis van de inductie kamer aan het water toegediend verwarming pad. Blijven isofluraan (1,5-2%) toe te passen door middel van de neuskegel. Pas anesthesie volgens de individuele muis tolerantie beoordeeld via ademhalingsfrequentie (RR) monitoring.
   Opmerking: De depressie van RR kunnen verstoren fysiologische gas parameters veranderen van bloedtoevoer naar de hersenen en de beoordeling diameter vat. Poging om RR 55-65 ademhalingen per minuut te houden. Hartslag (HR) kan ook worden gebruikt beoordelen diepte van anesthesie; houden HR tussen de 300-450 slagen per minuut om fysiologische veranderingen in diameter vat te voorkomen. Typisch zal adequate narcose tussen 1,5-2,0% isofluraan ten 1 l / min gedurende een bepaalde muis.
5. Voer een teen knijpen om verder te controleren van de diepte van de anesthesie. Als de muis niet reageert, commvloeden de chirurgische procedures.

2. Voorbereiding van de Thin-schedel Cranial Window

1. Pas kunstmatige traan gel voor de ogen van de muis. Volledig te verwijderen het haar van de hoofdhuid van de muis met een schaar of een elektrisch scheerapparaat.
2. Steriliseer de hoofdhuid door toepassing van povidon-joodoplossing; laten drogen. Vervolgens onder een lichtmicroscoop, verwijder de huid van de hoofdhuid van de muis, volledig bloot de pariëtale botten, staart voorhoofdsbeenderen en bregma markering.
3. Breng een kleine hoeveelheid van een 10% ferrichloride-oplossing op de schedel teneinde de membranen voor het eenvoudig verwijderen drogen. Verwijder de gedroogde membranen met de # 5/45 tang door voorzichtig schrapen de schedel.
4. Breng een dunne laag lijm rond de headplate venster. Druk de kopplaat tegen de schedel van de muis, waarbij het interessegebied in het midden van het venster. Breng een druppel tandheelkundig cement op de hoofdplaat om de lijm te polymeriseren.
5. Breng een dun laagjelijm langs de rand van de kopplaat venster om een ​​reservoir waarin zoutoplossing moeten dekken. Zodra de lijm droog is, schroef de hoofdplaat in de muis headplate harnas.
   Let op: de muis hoofdplaat tuig gebruikt in deze procedure is een structuur met een metalen voet en twee metalen kolommen. Op elke kolom is er een veer en een vleugelmoer. De kopplaat is geplaatst op de top van de lente, en de vleugel moer wordt aangedraaid, totdat de kop is vlak en niet beweegt.
6. Verwijder eventuele lijm van de hoofdplaat venster met behulp van een boor gekoppeld aan een Microtorque boor ingesteld op 6000 rpm. Stoppen elke 10-15 sec tot oververhitting van de muis cranium die kunnen leiden tot structurele beschadiging van vaten voorkomen.
   1. Met een nieuwe boor, plaats de Microtorque boor 1,5 mm lateraal van de middellijn (één-derde van de diameter van de kopplaat venster). Beginnen te dun de schedel rond deze locatie op 4000 rpm. Beweeg de boor voorzichtig over de schedel met geen directe neerwaartse druk.
   2. Cease drilleng elke 10-15 sec tot oververhitting van de muis schedel te voorkomen. Gedurende deze tijd, verwijder het opgehoopte schedel stof met een perslucht bus.
   3. Gebruik druppels RT zoutoplossing om schedel afkoelen 5-10 sec. Verwijder voorzichtig alle vloeistof met een zacht weefsel aan de schedel dunner blijven.
7. Voor de laatste verdunning van de schedel, plaats een kleine hoeveelheid zout in de hoofdplaat reservoir en licht vegen een tandheelkundige microblad over het gebied van de rente tot kleine schepen zijn duidelijk zichtbaar.

3. Monitoring van fysiologische parameters

1. Zodra de schedel volledig is uitgedund, los van de muis uit de houder en plaats hem op zijn rug. Zachtjes band naar beneden beide achterpoten aan de mediale dijen duidelijk bloot.
2. Verwijder de haren over beide mediale dijen met een schaar of een elektrisch scheerapparaat. Ontsmet de operatiewond door het bedekken van de dijen met povidonjood.
3. Neem de huid aan de mediale rechterdij boven de femorale aderen slagader via de # 5 tang. Trek de huid naar boven en gebruik een schaar te knippen en verwijder de huid.
   Opmerking: de linkerdij is gereserveerd in het geval van chirurgische complicaties (vasculaire afwijkingen, gescheurde schepen).
4. Breng ongeveer 3-5 druppels 0,9% zoutoplossing operatieplaats. Dit zorgt voor een grotere vergroting van schepen, alsmede het bijhouden van de locatie gehydrateerd en het voorkomen van het drogen van de vaten. Scheid de dijader van slagader door botweg ontleden in het dijbeen neurovasculaire bundel met twee # 5/45 tang.
5. Plaats twee, 3 cm stukken van chirurgische hechtdraad onder de dij slagader ongeveer 1 cm uit elkaar. Draai de bovenste hechting met de klok mee om een ​​vasculaire tourniquet die zullen helpen om overmatig bloedverlies tijdens catheterisatie voorkomen creëren.
6. Maak een kleine incisie in de dij slagader met behulp van de lente een schaar. Plaats de katheter in de slagader door de incisie en vooruit totdat de catheter stevig in de slagader.
7. Injecteer 10 ul heparine (100 IU / ml) door de katheter om bloedstolling te voorkomen. Vervolgens chirurgisch sluiten van de rechterdij door het naaien van de huid samen met een 4-0 hechtdraad op een eenvoudige onderbroken patroon.
8. Injecteer 50 pi urethaan (1,2 mg / g) intraperitoneaal in het kwadrant rechtsonder. Vijf minuten later herhaald met een andere 50 pi injectie naar links onderste kwadrant voor een totaal van 100 pl intraperitoneaal urethaan. Langzaam verminderen van de isofluraan niveau tot ongeveer 0,25%, terwijl gelijktijdig hercontrole muis voor de diepte van de anesthesie.
   Opmerking: De naald oppervlakkig in de peritoneale holte langs de buikwand zodat het niet de darm perforeren. Dit kan worden bewerkstelligd door afklemmen van de abdominale rectus muscles weg van de ingewanden en vervolgens injecteren.
9. Met behulp van een capillaire buis, verzamel een 40 ui monster van arterieel bloed uit de katheter. Bevestig de katheter om het bloed drukomvormer voorzien van een zoutoplossing gevulde vier-weg kraan en heparine-injectiespuit.
10. Tape de bloeddruk transducer op de chirurgische inrichting om de onbedoelde verwijdering van de katheter te voorkomen. Begin bewaking van de gemiddelde arteriële druk.
11. Steek het bloed gevulde capillair in een bloedgasanalysator ingangspoort. Zodra al het bloed is onttrokken, verwijder het capillair van de ingangspoort. De O _{2 en} CO ₂ bloed gas niveaus zal verschijnen op een papier afgedrukt uit het bloed gas analyzer.

4. Injectie van de fluorescerende kleurstof

1. Neem de huid aan de mediale linkerdij met de # 5 tang. Trek de huid naar boven en gebruik een schaar te knippen en verwijder de huid. Bereid dextran geconjugeerd rood uitstralende rhodamine kleurstof(70 kDa) (10 mg / kg opgelost in zoutoplossing).
2. Zoek het dijbeen vein.Using een 1 ml spuit met een 30 G naald bevestigd, trek een eerder bereide oplossing van een fluorescerende kleurstof die geschikt is voor beeldvorming van de 130 ul lijn van de spuit. Verwijder alle luchtbellen door het tekenen van de kleurstof volledig in de spuit en stevig vegen de spuit muur.
   1. Buig de 30 G-naald op een ongeveer 30 graden door het tegen een hard oppervlak schuine kant naar boven. Vul de naald met de kleurstof en geen vocht ontdoen, waardoor een 100 pl monster.
3. Injecteer 100 ui monster van kleurstof langzaam in de femorale ader. Na verwijdering van de naald, passen stevig vast en druk op de injectieplaats elke bloeden te stoppen. Laat het kleurstof circuleren gedurende 5 min.
   Opmerking: Als alternatief kan de rechter femorale ader plaats daarvan worden gebruikt voor de fluorescerende kleurstof injectie verdere bloedverlies te voorkomen door het creëren van een andere operatieplaats. Bovendien, als dedier ongecontroleerd bloeden uit de operatieplaats, kan dit een indicatie dat teveel heparine werd aan de katheter te spoelen. Als er geen stolling binnen 10-15 min en de muis blijft bloeden, eens het experiment opnieuw starten met een nieuwe muis.
4. Sluit de linker dij door het naaien van de huid samen met een 4-0 hechtdraad, dan voorzichtig flip de muis op zijn buik, en plaats deze in de muis headplate harnas.

5. In vivo twee-foton Imaging

1. Verplaats de chirurgische apparatuur om de twee-foton microscoop, en zorg ervoor dat continue anesthesie op peil te houden. Een kleine hoeveelheid van 0,9% zoutoplossing in de kopplaat reservoir en laat de microscoopobjectief zodat het in contact komt met de zoutoplossing. Zoek het gebied van belang met behulp van de helderveld bekijken van objectieve
2. Stel de twee-foton excitatie laser op een golflengte die geschikt is voor de fluorescente kleurstof. Begin twee-foton beeldvorming met behulp van de 25x oOEL.
   Merk op dat in deze experimenten gebruikten we een dextran geconjugeerd aan een rood uitstralende rhodamine kleurstof die opgewonden bij een golflengte van 780 nm. Een emissiefilter 607/36 bandpass de fluorescentie van de kleurstof te detecteren, en een 480/20 bandpass emissiefilter werd gebruikt om arteriële autofluorescentie detecteren
3. Zoek een capillair bed op het scherm bekijken, en vergroot dit gebied met behulp van optische zoom 2. Acquire beelden van de haarvaten met behulp van de twee-foton imaging software.
4. Na beeldvorming is voltooid, offeren de muizen door cervicale dislocatie waarna zij werden onthoofd.

6. ex vivo twee-foton Imaging

1. De extra fijne schaar, een insnijding in de hoofdhuid van de interparietal botten voorhoofdsbeenderen van de muis. Bevestig de huid aan de zijkant van de schedel met de wijsvinger en duim.
2. Plaats de extra fijne schaar onder de mediale interparietal bot en snijd de schedel langs de pijlnaad. Stoppen met het snijden van de schedel van ongeveer 3 mm na de bregma markering.
   Opmerking: Breng opwaartse druk bij het snijden van de schedel te voorkomen dat het snijden van de hersenen.
3. De # 5 tang, scheid de schedel de hersenen en eventueel aanwezig meninges van het oppervlak van de hersenen. Resterende hersenvliezen kan per ongeluk verscheuren de hersenen; extreme zorg moet worden genomen om dit te voorkomen. Schuif de # 5 tang onder de hersenen langzaam naar voren vooruit totdat de hersenen is vrij van de schedel.
   Merk op: dat neerwaartse druk moet worden gebruikt om te beschadigen de hersenen.
4. Plaats de hersenen in hersenen snijden instrument specifiek voor muizen. Was de hersenen door het aanbrengen van druppels van kunstmatige cerebrospinale vloeistof over de hersenen.
5. Verwijderen van een 2 mm coronale sectie van de hersenen van bregma 0 tot bregma -2. Plaats de coronale sectie op een holle glazen dia met kunstmatige cerebrospinale vloeistof met de 0 bregma (de meeste craniale deel van de sectie) naar boven. Bedekken voorzichtig de hersenen slijs met een glazen afdekplaat slip.
   Opmerking: Vermijd het indrukken van de glazen eenmaal geplaatst op het traject hersenen als dit de vasculaire architectuur kan vervormen.
6. Breng de schuif naar microscooptafel en plaats een kleine hoeveelheid 0,9% zoutoplossing op het dekglas. Laat de microscoopobjectief totdat deze in contact met de zoutoplossing. Zoek de middellijn van de hersenen met behulp van de helderveld doel.
7. Begin twee-foton beeldvorming en zoek de middellijn weer met behulp van de 25x doelstelling. Dit te bereiken door te zoeken naar de longitudinale spleet in de corticale oppervlak van de coronale sectie. Plaats de rechterrand van het afbeeldscherm van de middellijn en beweeg de kijker scherm over lateraal drie volledige frames (ongeveer 1,5 mm middellijn).
   Merk op dat in deze experimenten, de beeldvormende parameters waren identiek aan die in de nota vermeld in stap 5,2.
8. Zoek de diepte waarop haarvaten zijn nauwelijks zichtbaar op het scherm bekijken. Verlaag het vlak van aandacht een extra 20urn tot boven de z-stack bepalen.
9. Stel het beeld dikte tot 1 pm. Verlaag het scherm 100 urn uitzicht en pas laservermogen gedurende zodanig dat minder dan 1% van de pixels oververzadigde.
   Opmerking: de z-stack beelden zijn samengesteld uit een reeks van 100 opeenvolgende afbeeldingen 500x500x1 urn. Hoe groter de z-stack hoe nauwkeuriger de nabewerking berekeningen. In het algemeen proberen een z-stack van 100 micrometer of groter verzamelen.
10. Druk op de XY Repeat icoon gevolgd door het aangrenzende XY icoon. Zodra de z-stack compleet is, drukt u op het pictogram Series Gedaan en sla het bestand.

7. Data Processing

1. Open een afbeelding in vivo capillaire in de ImageJ software. Handmatig de pixel afstandsverhouding basis van de waarden verkregen van de twee-foton software.
   1. Selecteer de * recht * icoon uit het menu Extra. Trek een lijn die zich uitstrekt van de ene capillaire muur om de OPPOter capillairwand en noteer de lengte door ImageJ.
      Merk op dat het nodig kan zijn in het beeld te zoomen om duidelijk zichtbaar de randen van de capillaire wanden.
   2. Herhaal stap 7.1.1 op verschillende plaatsen langs het capillair, alsmede voor meerdere capillairen in het beeld.
2. Open de z-stack bestand in de analysesoftware zoals Amira. Selecteert u het pictogram Filament Editor op de werkbalk sub-applicatie
   1. Stel de kijker dikte tot ongeveer 20. Beweeg de kijker aan de boven- of onderzijde van de z-stack.
   2. Selecteer het pictogram Trace en beweeg de cursor over de geladen afbeelding. Plaats knooppunten op de capillairen in de in figuur 2C beschreven locaties; segmenten verschijnt automatisch tussen aangrenzende knooppunten. Trace haarvaten in het gehele z-stack.
      Opmerking: het zal noodzakelijk zijn om knooppunten te plaatsen tussen de eindpunten en vertakkingspunten teneinde de capillairen thr tracerenoughout de z-stack.
   3. Om deze knooppunten te verwijderen, klikt u op het verwijderen Intermediate icoon.
      Opmerking: Dit kan foutieve lus segmenten die handmatig moet worden verwijderd door het selecteren van de lus met behulp van de Select Single pictogram en vervolgens de Verwijder geselecteerde pictogram te creëren. Als loops steeds in hetzelfde gebied tijdens tracering, is het waarschijnlijk dat de knooppunten op verschillende capillairen werden geplaatst.
   4. Zodra de tracing is voltooid, selecteert u het pictogram Grafiek informatie naar een spreadsheet met het automatisch uitgepakt vasculaire parameters te openen. Het aantal knooppunten en segmenten zijn beschikbaar op de belangrijkste weergave scherm.

Representative Results

Het corticale window dunne schedel maakt in vivo twee-foton beeldvorming van corticale capillairen (figuur 1). Een geschikte ruimte om afbeelding toont vele, verschillende haarvaten (Figuur 1A). In hetzelfde gezichtsveld, is er geen arteriële celwand autofluorescentie en kunnen er andere fluorescentiesignalen, zoals collageen fluorescentie, geïnduceerd door frequentieverdubbeling ¹¹ (Figuur 1B).

Zodra de bereiding van de hersenen slice is voltooid, een opnamegebied van ongeveer 1,5 mm middellijn ligt (Figuur 2A). Een 100 um z-stack produceert een driedimensionaal beeld voor analyse in het Amira analytische software (Figuur 2B). Het capillair netwerk wordt vervolgens handmatig opgespoord door het plaatsen van knopen aan het begin en einde van een capillair of een plaats waar een capillair bboerderijen in een andere (figuur 2C). Dit levert een volledig skelet afbeelding waaruit morfologische parameters automatisch worden gehaald (Figuur 2D). Het aantal capillaire knooppunten segmenten gemiddelde segmentlengte, totale segmentlengte en totale capillaire volume kan worden geëxtraheerd met behulp van twee-foton ex vivo beeldvorming van muizenhersenen segmenten (Figuur 2).

Figuur 3 toont representatieve resultaten verkregen met de in dit document werkwijze. In dit experiment werd een transgeen muismodel van HIV zenuwontsteking gebruikt ^10. De productie van het HIV Tat virotoxin werd geïnduceerd in Tat + muizen door doxycycline toegediend stof tot 12 weken. De controlegroep bestond uit Tat- nestgenoten gevoed hetzelfde voedsel. Er was geen statistisch significant verschil tussen Tat + en Tat- muizen in elk van de capillaire parameters gemeten. Aldus blootstelling 12 weken van brain tissue aan HIV-1 Tat is onvoldoende om verdunning van de hersenen microvasculatuur veroorzaken. Daarentegen onze eerder gepubliceerde gegevens blijkt dat meer langdurige (20 weken) chronische CNS expressie van Tat leidt tot verdunning van cerebrale vasculatuur ^7. Dus de weergegeven data (figuur 3) waardevolle nieuwe informatie met betrekking tot de kinetiek van Tat geïnduceerde vasculaire remodellering in het CZS van muizen.

Figuur 1. Verwerving van corticale capillaire diameter. (A) Naar aanleiding van een dunne-schedel corticale venster voorbereiding en intraveneuze fluorescerende kleurstof injectie werd twee-foton microscopie gebruikt om het cerebrale vaatstelsel. In onze experimenten gebruikten we een dextran geconjugeerd aan een rood uitstralende rhodamine kleurstof die opgewekt was 780 nm en de fluorescentie werd gevisualiseerd door een 607/36 bandpass emissiefilter. 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Genereren van skeletonized capillaire netwerken. (A) Muizen werden intraveneus geïnjecteerd met een fluorescerende kleurstof en opgeofferd. Een 2 mm coronale deel van hersenen is gemaakt tussen 0 en bregma bregma -2 en beeldvorming werd uitgevoerd bij 0 bregma ongeveer 1,5 mm middellijn. EEN representatief beeld van de corticale locatie gekozen voor de beeldvorming (black box) uit een C57BL / 6 muis wordt getoond. Deze regio, de somatosensory cortex, werd gekozen omdat we eerder hebben aangetoond dat de ontregeling van cerebrale bloed kan optreden op deze site in Tat + muizen ^12. (B) Representational driedimensionale z-stack beelden van capillaire netwerken. (C) Schematische weergave van de methode die wordt gebruikt om handmatig op te sporen haarvaten tijdens vaartuig kwantificeren. (D) Vertegenwoordiger afbeelding skelet z-stapel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Kwantificering van cerebrale vasculaire architectuur in Tat- muizen versus muizen die zijn blootgesteld aan de kandidaat HIV virotoxin Tat for 12 weken. Muizen met doxycycline (DOX) induceerbaar HIV-1 Tat transgen gedreven door astrocyt specifieke gliale fibrillaire eiwit (GFAP) promoter (HIV Tat-Tg-muizen) werden gebruikt om het effect van HIV-1 geïnduceerde inflammatoire processen op onderzocht cerebrale vasculaire structuur, zoals beschreven ^7. Deze muizen (Tat +, n = 3) werden blootgesteld aan een chronische (12 weken) behandeling met Tat inductie (bijv., 12 weken van DOX). Tat- muizen (n = 4) werden als leeftijd gematchte controles (deze muizen overeen met niet-transgene nestgenoten van de Tat + muizen en derhalve niet tot expressie HIV-1 Tat). Zoals het Tat + muizen, de Tat- muizen ontvingen 12 weken van DOX blootstelling. In de muizen blootgesteld aan Tat gedurende 12 weken (Tat +) versus die niet blootgesteld aan Tat (Tat-), was er geen statistisch significant verschil in het aantal knooppunten (A), het aantal segmenten (B), gemiddelde segmentlengte (C) of totale capillaire lengte (D), capillair diameter (voorhet Tat + muizen, analyseerden we 14 capillairen 6 beeldvormende gebieden; voor Tat- muizen, analyseerden we 7 capillairen 4 beeldvormende gebieden) (E) of capillair totale volume (V). Aangezien de gegevens niet normaal verdeeld (zoals bepaald door de Shapiro-Wilk test), werd de exacte Wilcoxon rank sum-test wordt gebruikt om statistische significantie (bepaald in dit geval als P <0,05). Berekenen Klik hier om een grotere versie te bekijken dit cijfer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De hier beschreven methode kan worden toegepast op de hersenen microvasculaire te analyseren in een groot aantal experimentele modellen / instellingen. Voor het succes van deze werkwijze moet drie cruciale stappen worden beheerst. Ten eerste moet de dunne schedel raam schedel of onderliggende hersenen niet beschadigen. Het is gemakkelijk om de schedel te doorboren tijdens dunner, of ervoor zorgen dat de warmte-geïnduceerde vasculaire lekkage. Dit kan interfereren met beeldvorming als de fluorescerende kleurstof zal lekken in het vlak van focus en verdoezelen haarvaten. Als de schedel breekt regelmatig tijdens de dunne schedel voorbereiding, is het zeer waarschijnlijk veroorzaakt door een te grote neerwaartse druk. Houd de Microtorque boor zo dicht mogelijk bij de braam zorgt voor een grotere tactiele controle dat de neerwaartse druk op de schedel afnemen.

Ten tweede moet arteriële katheterisatie zo snel mogelijk na de slagader is gesneden optreden. Verzuim om de katheter snel invoegen kan overmatig bloedverlies, dat zal leiden tot compromise de fysiologische integriteit van de muis. Problemen bij het plaatsen van de katheter gewoonlijk door de relatief grote omvang van de katheter ten opzichte van de femorale slagader. Het kan nodig zijn de catheter om zijn diameter te verminderen rekken. Daarnaast kunnen de uiteinden van de # 5 tang worden gebruikt om de opening in de slagader te verlichten in de plaatsing van de katheter te grijpen en te vergroten.

Ten derde moet de duur van de in vivo chirurgische procedures worden geminimaliseerd zodat de verdoving met urethaan zo spoedig mogelijk kan worden toegediend. De isofluraananesthesie kan vaatverwijding van cerebrale bloedvaten ¹³ veroorzaken, waardoor vertekening van de gegevens capillaire diameter.

Het moet worden erkend dat de Amira analytische software automatisch de stralen van handmatig getraceerd schepen kan halen; Echter, bij het ​​gebruik van deze functie om z-stack beelden van ex vivo hersenen te analyseren, de waarde onnauwkeurig is. Dit is omdat, after verwijdering van de hersenen, de cerebrale capillairen niet meer druk gebracht, en kunnen morfologisch vervormd. De in vivo evaluatie diameter capillair omzeilt dit probleem omdat de capillairen onder druk onder normale fysiologische omstandigheden.

Ook moet worden opgemerkt dat deze methode niet onbeperkt. Ten eerste is aanzienlijke training vereist om de in vivo imaging voorbereiding beheersen. Een onderzoeker moet leren om twee technisch uitdagende technieken (dunne schedel corticale raam en arteriële catheterisatie) efficiënt uit te voeren; een fout in een van beide techniek kan het experiment kan beschadigen en vervalt de gegevens. Ten tweede, de analyse van de ex vivo z-stacks is tijdsintensief. De skeletvorming één afbeelding z-stapel kan tot 2,5 uur. Verder is het raadzaam dat deze analyse worden uitgevoerd door een ervaren onderzoeker aan de consistentie van de skeletvorming proces (dat een zorgvuldige handleiding tr gaat zorgenacing van de bloedvaten).

Zodra alle aspecten van dit protocol worden beheerst, de verkregen gegevens geven een meer diepgaande en fysiologisch accurate kwantificering van vasculaire parameters in vergelijking met andere traditioneel gebruikte methoden die capillaire dichtheid haarvaten per volume-eenheid, of haarvaten per gezichtsveld te tonen. De in vivo beeldvormende techniek maakt de studie van andere parameters waaronder, maar niet beperkt tot, rode bloedcel snelheid arteriole dilatatie en rode bloedcellen flux ^7,12, die ook in staat zijn in longitudinale studies worden onderzocht. Bovendien kan het gemakkelijk worden aangepast en gewijzigd om onderzoek te vragen met betrekking tot de hersenen microvasculaire structuur te bestuderen. Dergelijke studies kunnen onder kwantificeren pathogene veranderingen in de capillaire morfologie in andere neurocognitieve ziekten, of het meten van leeftijd gerelateerde veranderingen in de capillaire dichtheid. Daarom is het in dit document methode is een veelzijdig en krachtig instrument voor de quantitative analyse van cerebrale vasculaire architectuur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging