Introduction
Humant immunsviktvirus 1 (HIV-1) invaderer hjernen under den akutte fasen av virusinfeksjon, og produktivt infiserer både mikroglia og hjernen bosatt makrofager, som fører til aktivering deres - og utgivelsen av både vert-avledet inflammatoriske mediatorer og løselig HIV-1 virotoxins som Tat og gp120 (anmeldt i 1,2). Som en konsekvens av dette, blir en kronisk neuroinflammatoriske tilstand etableres i CNS, som antas å bidra til patogenesen av HIV-1-Associated nevropsykologiske forstyrrelser (for hånd) 3-5.
Kronisk overekspresjon av HIV-1 Tat eller interleukin (IL) -17A i CNS hos mus har vist seg å resultere i mikrovaskulær vakuum, 6,7. Dette øker muligheten for at kronisk nevroinflammasjon kan bidra til patogenesen av HAND gjennom effekter på hjernens blodforsyning. For ytterligere å undersøke dette spørsmålet, har vi utviklet metoder for å kvantifisere cerebral vaskulær struksteder.
Dette dokumentet beskriver en fremgangsmåte for å kvantifisere antall kapillære noder, kapillar-segmenter, betyr segmentlengde, total segmentlengde, betyr kapillær diameter, og total kapillær volum ved hjelp av in vivo avbildning av kapillære nettverk gjennom en tynn skull kortikal vindu (modifisert fra tidligere beskrevne protokoller) 8,9, samt ex vivo avbildning av hjernen seksjoner, ved hjelp av to-foton mikroskopi. Denne kombinerte metode gir en helhetlig kvantifisering av cerebrale vaskulære parametere, ettersom in vivo tynne skalle cortical vindu gjør det mulig for bevaring av cerebral miljø, mens ex vivo avbildning av kapillære nettverk i hjerneskiver muliggjør rekonstruksjon av fullstendige, tredimensjonale kapillær nettverk - som deretter kan kvantifiseres ved hjelp av kommersielt tilgjengelig programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of Rochester University Committee on Animal Resources godkjent alle prosedyrer utført i dette papiret.
1. Pre-kirurgisk Forberedelse (og mus)
- Klargjør den kirurgiske området med alt nødvendig utstyr. Sterilisere alle verktøy som brukes under prosedyren på forhånd ved hjelp av 70% etanol. Eventuelt bruke et glass-perle sterilisator eller autoklav å sterilisere verktøyene.
- Plassere musen i en isofluran induksjonsskammer forbundet med en fordamper isofluran. Satt isofluran nivåene til 4% ved en hastighet på 1 liter / min.
Merk: for eksperimentene som presenteres her, mus med doksycyklin (DOX) induserbar HIV-1 Tat transgen drevet av astrocyte spesifikke glial fibrillary protein (GFAP) promoter (HIV Tat-Tg mus) 10 ble brukt for å undersøke effekten av HIV -1 indusert nevroinflammasjon på cerebral vaskulær struktur, som tidligere beskrevet 7,10. - Forsiktig spissen induksjonskammeret for å observere mus &# 39; s rettende refleks. Når rettende refleks har blitt undertrykt, setter isofluran nivå til 2% og omdirigere luftstrømmen fra induksjonskammeret til nesen membran på operasjonsbenken.
- Raskt flytte musen fra induksjonskammeret til vannet tilført varmeputen. Fortsette å gjelde isofluran (1,5-2%) gjennom nesen membran. Juster anestesi henhold til individuell muse toleranse vurderes gjennom respirasjonsfrekvens (RR) overvåking.
Merk: depresjon av RR kan forurolige fysiologiske gass parametere som endrer cerebral blodstrøm og fartøy diameter vurdering. Forsøk å holde RR mellom 55-65 pust per minutt. Hjertefrekvens (HR) kan også brukes vurdere dybden av anestesi; holde HR mellom 300-450 slag per minutt for å hindre fysiologiske endringer i fartøy diameter. Vanligvis vil anestesi være tilstrekkelig mellom 1,5 til 2,0% isofluran ved en l / min for en gitt mus. - Utføre en tå klype for å kontrollere dybden av anestesi ytterligere. Hvis musen ikke reagerer, commhet de kirurgiske prosedyrer.
2. Utarbeidelse av Thin-skallen Kranio Window
- Påfør kunstig tåre gel for øynene til musen. Helt fjerne hår fra hodebunnen av musen ved hjelp av saks eller en elektrisk barbermaskin.
- Sterilhodebunnen ved å bruke povidonjodid løsning; la den tørke. Så, under et lysmikroskop, fjern skinnet fra hodebunnen av musen, helt utsette parietalbena, caudal frontal bein, og Bregma merking.
- Anvende en liten mengde av en 10% jern-III-kloridløsning til skallen for å tørke membranene for enkel fjerning. Fjern de tørkede membraner med # 5/45 tang ved å forsiktig skrape skallen.
- Påføre et tynt lag med lim rundt headplate vinduet. Trykk forsiktig headplate mot skallen av musen, holde området av interesse i sentrum av vinduet. Påfør en dråpe av dental sement til headplate å polymerisere limet.
- Påfør et tynt lagav lim langs kanten av headplate vinduet for å skape et reservoar for å holde saltløsning. Når limet har tørket, skru headplate i musen headplate sele.
Merk: musa headplate selen som brukes i denne fremgangsmåten er en struktur med en metallbase, og to metall kolonner. På hver søyle er det en fjær og en vingemutter. Den headplate er plassert på toppen av våren, og vingemutteren strammes inntil hodet er nivå og beveger seg ikke. - Fjern eventuelle lim fra headplate vinduet ved hjelp av en borekrone festet til en microtorque drill satt til 6000 rpm. Stoppe hver 10-15 sek for å hindre overoppheting av mus kraniet som kan føre til strukturelle skader på fartøy.
- Ved hjelp av en ny borkrone, plasserer microtorque bore 1,5 mm sideveis ut fra midtlinjen (en tredjedel av diameteren på headplate vinduet). Begynn å tynne skallen rundt dette stedet ved 4000 rpm. Flytt drill forsiktig over skallen uten direkte press.
- Slutt drilling hvert 10-15 sek for å hindre overoppheting musen kraniet. I løpet av denne tiden, fjerne akkumulert skallen støv med en trykkluftbeholderen.
- Bruk dråper RT saltvann for å kjøle kraniet for 5-10 sek. Fjern forsiktig all væske med en myk klut for å fortsette skallen tynning.
- For den endelige tynning av skallen, plasserer et lite volum av saltvann i headplate reservoaret og lett feie en tannlege mikro over området av interesse til små fartøy er klart synlig.
3. Overvåking av fysiologiske parametre
- Når skallen er helt tynnet, løsner musen fra holderen og legg den på ryggen. Forsiktig tape ned begge bakbena å tydelig eksponere de mediale lår.
- Fjerne hår over begge mediale lår med saks eller en barbermaskin. Desinfisere operasjonsstedet ved å dekke lårene med povidonjodid.
- Knip huden på den mediale høyre lår ovenfor lårvenenog arterie med # 5 tang. Dra forsiktig huden oppover og bruke saks til å klippe og fjerne huden.
Merk: venstre lår er reservert i tilfelle av kirurgiske komplikasjoner (vaskulære anomalier, sprukket skip). - Påfør ca 3-5 dråper 0,9% saltvann til operasjonsstedet. Dette gir større forstørrelse av fartøy, samt å holde området fuktes og hindre uttørking av fartøyene. Separer lårvenen fra arterie ved omsvøp dissekere inn lårbens neurovascular bunt med to # 5/45 tang.
- Plasser to, tre cm biter av kirurgisk sutur under femoralarterien ca 1 cm fra hverandre. Vri den øvre sutur klokken for å skape en vaskulær tourniquet som vil bidra til å hindre overdreven blodtap under kateterisering.
- Lag et lite snitt i lårarterie hjelp av våren saks. Kateteret i arterien gjennom innsnitt og forhånds inntil kateteret er på en sikker måte i arterien.
- Injiser 10 ul av heparin (100 IU / ml) gjennom kateteret for å forhindre blodkoagulering. Deretter kirurgisk lukke høyre lår ved å sy huden sammen med en 4-0 sutur på en enkel avbrutt mønster.
- Injisere 50 mL av uretan (1,2 mg / g) intraperitonealt i høyre nedre kvadrant. Fem minutter senere gjentas med ytterligere 50 ul injeksjon til venstre nedre kvadrant for totalt 100 ul av intraperitoneal uretan. Sakte redusere isofluran nivåer til ca 0,25%, mens samtidig rechecking musen for anestesidybden.
Merk: Hold nålen overfladisk i bukhulen langs bakre bukvegg, slik at den ikke perforere tarmen. Dette kan oppnås ved å knipe mage rectus muscles bort fra innvoller og deretter injisere. - Ved hjelp av et kapillarrør, samle en 40 pl prøve av arterielt blod fra kateteret. Feste kateteret til blodet trykktransduser utstyrt med en saltfylt fire-veis stoppekran og heparin fylt sprøyte.
- Tape blodtrykket svinger til den kirurgiske anordning for å hindre utilsiktet fjerning av kateteret. Begynn overvåking av gjennomsnittlig arterietrykk.
- Sett blodet fylt kapillarrør inn en blod gass analysator oppføring port. Når alt blodet har blitt trukket ut, fjern kapillarrør fra oppføringen port. O 2 og CO 2 blodgassnivåer vil vises på et papir skrevet ut fra blodet gass analysator.
4. Injeksjon av Fluorescent Dye
- Knip huden på den mediale venstre lår med # 5 tang. Dra forsiktig huden oppover og bruke saks til å klippe og fjerne huden. Forbered dekstran konjugert rød emitting rhodamin fargestoff(70 kDa) (10 mg / kg oppløst i saltvann).
- Lokaliser femoral vein.Using en 1 ml sprøyte med en 30 G nål festet, trekke en på forhånd fremstilt løsning av et fluorescerende fargestoff egnet for avbildning av 130 ul linje av sprøyten. Fjern alle luftbobler ved å tegne fargestoffet helt inn i sprøyten og fast flicking sprøyten veggen.
- Bøy 30 G nål på en ca 30 graders vinkel ved å trykke det mot en hard overflate skråsiden opp. Fyll kanylen med fargestoff og forkaste overflødig væske, og etterlater en 100 mL prøve.
- Injisere 100 ul prøve av fargestoff langsomt i lårvenen. Når nålen er fjernet, gjelder jevn, forsiktig press på injeksjonsstedet for å stoppe blødninger. Tillat fargestoff for å sirkulere i 5 min.
Merk: alternativt kan den høyre femorale vene brukes i stedet for det fluorescerende fargestoff injeksjon for å hindre ytterligere blodtap gjennom dannelsen av en annen operasjonsstedet. I tillegg, hvisdyret blør ukontrollert fra operasjonsstedet, kan dette være en indikasjon på at for mye heparin ble gitt til skylle kateteret. Hvis det ikke er noen koagulering i 10-15 min, og musen er fortsatt blødning, anser å starte forsøket med en ny mus. - Lukk venstre lår ved å sy huden sammen med en 4-0 sutur, deretter forsiktig snu musen på magen sin, og plassere den i musen headplate sele.
5. I Vivo To-Photon Imaging
- Flytt kirurgisk apparat til to-foton mikroskop, og pass på å opprettholde kontinuerlig anestesi nivåer. Plasser en liten mengde av 0,9% saltløsning inn i headplate reservoaret og senke mikroskopobjektiv slik at den kommer i kontakt med saltvann. Finn området av interesse å bruke lysfelt-visning målet
- Angi at to-foton laser eksitasjon til en bølgelengde som passer for det fluorescerende fargestoff. Begynn to-foton bildebehandling med 25x objective.
Legg merke til at i disse forsøkene benyttet vi et dekstran konjugert til et rødt emitterende rhodamin fargestoff som var spent på en bølgelengde på 780 nm. Et båndpass 607/36 utslipp filter for å detektere fluorescens fra fargestoffet, og et båndpass 480/20 utslipp filter ble anvendt for å detektere arteriell autofluorescence - Finn en kapillær seng på visning skjermen, og foredle dette området ved hjelp av optiske zoom 2. hente bilder av kapillærene ved hjelp av to-foton bildebehandlingsprogrammer.
- Etter bildebehandling er fullført, ofre musen ved halshugging fulgt av halshogging.
6. Ex Vivo To-Photon Imaging
- Ved hjelp av de ekstra gode saks, gjør et snitt i hodebunnen fra interparietal bein til frontal bein av musen. Fest huden til sidene av skallen med pekeren finger og tommel.
- Plasser de ekstra gode saks under mediale interparietal bein og kutt i skallen langs sagittal sutur. Slutte å klippe skallen ca 3 mm etter bregma merking.
Merk: Påfør press oppover når du skjærer i skallen for å unngå å kutte hjernen. - Ved hjelp av # 5 tang, skiller skallen fra hjernen og forsiktig fjerne eventuelle meninges fra overflaten av hjernen. Gjenværende hjernehinnene kan uhell rift i hjernen; ekstrem forsiktighet bør tas for å unngå dette. Forsiktig skyve # 5 tang under hjernen marsj sakte fremover til hjernen er fri fra skallen.
Merk: at trykket nedover bør benyttes for å unngå punktering av hjernen. - Sett hjernen i en hjerne seksjonering verktøy spesifikt for mus. Vask hjernen ved å anvende dråper av kunstig cerebrospinalvæske over hjernen.
- Fjern en 2 mm koronale delen av hjernen fra bregma 0 til bregma -2. Plasser den koronale delen på en konkav glass lysbilde som inneholder kunstig cerebrospinalvæsken med 0 bregma (mest kranie del av seksjonen) vendt oppover. Forsiktig dekke hjernen slis med et glass dekkglass.
Merk: Unngå å trykke glasset en gang plassert på hjernen delen da dette kan deformere vaskulær arkitektur. - Overfør lysbildet til mikroskopet scenen og plassere en liten mengde av 0,9% saltvann på dekkglass. Senk mikroskopobjektiv inntil den kommer i kontakt med saltvann. Finn midtlinjen av hjernen ved hjelp av lysfelt målet.
- Begynn to-foton bildebehandling og finne midtlinjen igjen med 25x objektiv. Oppnå dette ved å se etter den langsgående sprekk på kortikale overflaten av koronale delen. Plasser den høyre kanten på bildeskjermen på midtlinjen og flytte betrakteren skjermen over lateralt tre komplette rammer (ca. 1,5 mm fra midtlinjen).
Merk at i disse eksperimentene, imaging parametere var identiske med de som er nevnt i notatet i trinn 5.2. - Finn dybde hvor kapillærene er knapt synlig på visning skjermen. Senk fokusplanet ytterligere 20um for å bestemme toppen av z-stabelen.
- Still inn bilde tykkelsen til 1 mikrometer. Senk view skjermen for 100 mikrometer og justere laser makt gjennom slik at mindre enn 1% av pikslene er overeksponert.
Merk: z-stack bildene er hentet fra en serie av 100 sammenhengende 500x500x1 um bilder. Jo større z-stack de mer nøyaktige etterbehandlings beregninger vil det være. Vanligvis forsøker å samle en z-stabel på 100 pm eller større. - Trykk på XY Repeter-symbol etterfulgt av den tilstøtende XY-ikonet. Når z-stack er ferdig, trykker du på serien Ferdig ikonet og lagre filen.
7. Data Processing
- Åpne en in vivo kapillar bildet i ImageJ programvaren. Manuelt sette pixel avstand grad basert på verdier hentet fra de to-foton programvare.
- Velg * rett * ikon fra verktøymenyen. Tegn en linje som strekker seg fra den ene kapillær vegg til opponettstedet kapillær veggen, og registrere lengden levert av ImageJ.
Legg merke til at det kan være nødvendig for å zoome inn i bildet for å visual klart kantene av kapillære vegg. - Gjenta trinn 7.1.1 ved forskjellige steder langs den kapillære, så vel som for flere blodkar i bildet.
- Velg * rett * ikon fra verktøymenyen. Tegn en linje som strekker seg fra den ene kapillær vegg til opponettstedet kapillær veggen, og registrere lengden levert av ImageJ.
- Åpne z-stack fil i analyseprogramvare som Amira. Velg Filament Editor ikonet fra sub-applikasjon verktøylinje
- Still betrakteren tykkelse til ca 20. Flytt betrakteren til enten toppen eller bunnen av z-stack.
- Velg Trace ikonet og flytter markøren over lastet bildet. Plasser noder på kapillarene på de stedene som er beskrevet i figur 2C; segmenter vises automatisk mellom tilstøtende noder. Spore kapillærer i hele z-stack.
Merk: det vil være nødvendig å plassere noder i mellom endepunktene og grenpunkter for å spore kapillærene thrOughout z-stack. - For å fjerne disse nodene, klikker du på Fjern Intermediate ikonet.
Merk: Dette kan skape feilaktige løkker segmenter som må fjernes manuelt ved å velge sløyfen med markerings Singel-ikonet, og deretter velge Fjern valgte ikonet. Hvis looper fortsette å dukke opp i samme område under sporing, er det sannsynlig at nodene ble plassert på ulike kapillærer. - Når sporing er fullført, velg Graf Info-ikonet for å åpne et regneark med automatisk hentet vaskulære parametere. Antall noder og segmenter er tilgjengelige på hovedvisningen skjermen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tynne skalle cortical vindu gjør det mulig for in vivo to-foton avbildning av kortikale kapillarer (figur 1). Et egnet område til bilde viser mange, forskjellige kapillærer (Figur 1a). I samme synsfelt, er det ingen arterial celleveggen autofluorescens, og det kan være andre fluorescerende signaler, slik som kollagen, fluorescens som induseres av andre harmonisk generering 11 (figur 1B).
Når fremstillingen av hjernen skive er fullført, en avbildning område omtrent 1,5 mm fra midtlinjen er plassert (figur 2A). En 100 um z-stack bringer et tre-dimensjonalt bilde som brukes for analyse i Amira analyseprogramvare (figur 2B). Den kapillære nettverk blir deretter manuelt spores ved å plassere noder ved begynnelsen og slutten av en kapillær, eller hvilket som helst sted hvor en kapillar brancher i en annen (Figur 2C). Dette gir et fullstendig bilde skeletonized hvorfra morfologiske parametere blir automatisk trukket ut (figur 2D). Antall kapillære noder, segmenter, betyr segmentlengde, total segmentlengde, og total kapillær volum kan ekstraheres ved hjelp av to-foton ex vivo avbildning av musehjernesnitt (figur 2).
Figur 3 viser representative resultater som er oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten som presenteres i denne artikkelen. I dette forsøk ble en transgen musemodell for HIV nevroinflammasjon anvendt 10. Produksjon av HIV virotoxin Tat ble indusert i Tat + mus ved doksycyklin-tilført mat i 12 uker. Kontrollgruppen bestod av Tat- littermates matet den samme maten. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom Tat + Tat- og mus i en hvilken som helst av de kapillære målte parametrene. Dermed 12 ukers eksponering av hjernen tissaksøke til HIV-1 Tat er tilstrekkelig til å forårsake vakuum, av hjernen microvasculature. I motsetning til våre tidligere publiserte data viser at mer langvarig (20 uker) kronisk CNS uttrykk for Tat resultater i vakuum, av cerebrale kar 7. Således er de data som er vist her (Figur 3), gir verdifull ny informasjon i forhold til kinetikken av Tat-indusert vaskulær remodellering innenfor CNS hos mus.
Figur 1. Kjøp av cortical kapillær diameter. (A) Etter en tynn-skalle cortical vindu forberedelse og intravenøs fluorescerende fargestoff injeksjon, to-foton mikroskopi ble brukt til bilde cerebrale kar. I våre forsøk har vi brukt et dekstran konjugert til et rødt emitterende rhodamin fargestoff som var spent på 780 nm og fluorescens ble visualisert gjennom et båndpass 607/36 utslipp filter.
Figur 2. generasjon av skeletonized kapillær nettverk. (A) Mus ble injisert intravenøst med et fluorescerende fargestoff og ofret. En 2 mm koronale delen av hjernen ble tatt mellom bregma 0 og bregma -2, og bildebehandling ble utført på 0 bregma omtrent 1,5 mm fra midtlinjen. EN representativt bilde av kortikale stedet valgt for imaging (black box) fra en C57BL / 6 mus er vist. Denne regionen, SOMatosensory cortex, ble valgt fordi vi tidligere har vist at feilregulering av cerebral blod kan oppstå på dette området i Tat + mus 12. (B) representasjon tredimensjonale z-stack bilder av kapillær nettverk. (C) Diagram av metoden som brukes til å spore manuelt kapillærer under fartøyet kvantifisering. (D) Representant bilde av skeletonized z-stack bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kvantifisering av cerebral vaskulær arkitektur i Tat- mus versus mus eksponert for kandidaten HIV virotoxin Tat for 12 uker. Mus med en doksycyklin (DOX) induserbar HIV-1 Tat transgen drevet av astrocytt-spesifikke glial fibrillært protein (GFAP) promoter (HIV Tat-Tg-mus) ble brukt for å undersøke effekten av HIV-1-indusert nevroinflammasjon videre cerebral vaskulær struktur, som beskrevet 7. Disse mus (Tat +, n = 3) ble utsatt for en kronisk (12 uke) diett av Tat induksjon (ie., 12 uker av DOX). Tat- mus (n = 4) ble anvendt som alders-tilpassede kontroller (disse mus svarer til ikke-transgene kullsøsken av Tat + mus, og derfor ikke uttrykker HIV-1 Tat). I likhet med de Tat + mus, de Tat- musene fikk også 12 uker DOX eksponering. I mus eksponert for Tat i 12 uker (Tat +), i motsetning til de ikke utsettes for Tat (Tat-), var det ingen statistisk signifikant forskjell i antall noder (A), antallet segmenter (B), var gjennomsnittlig segmentlengden (C), eller total kapillær lengde (D), kapillær diameter (ettertat + mus, vi analysert 14 kapillærene i 6 bilde områder; for Tat- mus, vi analysert 7 kapillærene i 4 bildeområder) (E), eller total kapillær volum (F). Siden dataene ikke var normalfordelt (som bestemmes av Shapiro-Wilk test), ble den nøyaktige Wilcoxon rank sum test som brukes til å beregne statistisk signifikans (bestemt i dette tilfellet som P <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som beskrives her kan brukes til å analysere hjernen mikrovaskulære strukturer i et bredt spekter av eksperimentelle modeller / innstillinger. For å lykkes med denne metoden, må mestres tre kritiske trinn. For det første må den tynne skallen vinduet ikke skade kraniet eller underliggende hjernen. Det er lett å punktere skallen under tynning, eller føre til varme indusert vaskulær lekkasje. Dette kan forstyrre avbildning som det fluorescerende fargestoff vil lekke inn i fokusplanet og overskygge de kapillærer. Hvis skallen ofte bryter under tynne skallen forberedelser, er det mest sannsynlig forårsaket av for stor press nedover. Holder microtorque boret så nær som mulig til graden gir større taktil kontroll som vil redusere den nedadgående press på skallen.
For det andre bør arteriell kateterisering skje så raskt som mulig etter at arterien har blitt kuttet. Unnlatelse av å sette inn kateteret raskt kan føre til overdreven blodtap som vil compromise den fysiologiske integriteten til mus. Vanskeligheter med å sette inn kateteret er vanligvis på grunn av den relativt store størrelsen av kateteret i forhold til lårarterien. Det kan være nødvendig å strekke kateteret for å redusere dens diameter. I tillegg kan tuppen av # 5 tang brukes til å fange og forstørre åpningen gjort i arterien til å lette i plassering av kateteret.
For det tredje, bør varigheten av in vivo-kirurgiske prosedyrer bli minimalisert, slik at uretananestesi kan administreres så snart som mulig. Den isoflurananestesi kan føre til vasodilatasjon av cerebral blodårer 13, og dermed forvrenger kapillær diameter data.
Det bør erkjent at Amira analytisk programvare kan automatisk trekke radiene manuelt spores fartøyer; Men når du bruker denne funksjonen til å analysere z-stack bilder fra ex vivo hjerner, er verdien unøyaktig. Dette er fordi, after fjerning av hjernen, de cerebrale blodkar ikke lenger er under trykk, og kan bli morfologisk forvrengt. In vivo kapillær diameter måling omgår dette problemet fordi kapillærene er under trykk under normale, fysiologiske forhold.
Det må også bemerkes at denne metoden er ikke uten begrensninger. For det første kreves betydelig trening for å mestre den in vivo avbildning forberedelse. En forsker må lære å effektivt utføre to teknisk utfordrende teknikker (tynn skallen kortikal vindu og arteriell kateterisering); en feil i enten teknikken kan kompromittere eksperiment og ugyldig dataene. For det andre, er analyse av den ex vivo-z-stabler tidskrevende. Den skjelettisering av ett z-stack bilde kan ta opptil 2,5 timer. Videre anbefales det at denne analysen være ferdig innen en erfaren forsker for å sikre konsistens i skjelettisering prosessen (som involverer forsiktig manuell tracing av blodkar).
Når alle aspekter av denne protokollen er mestret, data innhentet gi en mer inngående og fysiologisk nøyaktig kvantifisering av vaskulære parametre i forhold til andre som tradisjonelt brukes metoder som viser kapillær tetthet som kapillærer per volumenhet, eller kapillærer per synsfelt. Den in vivo avbildningsteknikk gjør det mulig for studier av andre parametere, inkludert, men ikke begrenset til, røde blodlegemer hastighet, arterioler dilatasjon, og røde blodceller fluks 7,12, som også kan være i stand til å bli undersøkt i langsgående studier. Videre kan det lett bli tilpasset og modifisert for å studere problemstillinger knyttet til hjernen microvascular struktur. Slike studier kan inkludere kvantifisering patogene endringer i kapillær morfologi i andre nevrokognitive sykdommer, eller måle aldersrelaterte endringer i kapillær tetthet. Derfor metoden presentert i denne artikkelen er en allsidig og kraftig verktøy for Quantitätive analyse av cerebral vaskulær arkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica Microscope | Leica Inc. | MZ8 | |
| High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner | 180 | |
| Heating Pad | Stryker | TP3E | |
| T/PUMP | Gaymar Industries, Inc. | TP-500 | |
| TEC-4 Isoflurane Vaporizer | Datex Ohmeda | 447 | |
| Artificial Tear Gel | Butler AHS | 7312 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 52380-1855-9 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Ferric Chloride Solution | Ricca Chemical Company | 3120-16 | |
| Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel | Henkel | 45404 | |
| Dental Cement | Stoelting | 51459 | |
| Microtoruqe II Handpiece Kit | Pearson Dental | R14-0002 | |
| 005 Burr for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Norland Blade (Dental Microblade) | Salvin Dental | 6900 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Group 2B Carcinogen |
| Braided Suture | Ethicon | 735G | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Arterial Catheter | SAI Infusion Technologies | MAC-01 | The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. |
| Blood Pressure Moniter | World Precision Intruments | SYS-BP1 | |
| Blood Pressure Transducer and Cable | World Precision Intruments | BLPR2 | |
| RAPIDLab Blood Gas Analyzer | Siemens | 248 | |
| 40 μl Capillary Tube | VWR | 15401-413 | |
| Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) | Invitrogen | D-1830 | |
| Adult Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope | Olypmus | FV-1000 MPE | |
| MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Spectra-Physics | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health (NIH) | Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Amira Software | Visage Imaging |
References
- Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
- Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28 (2006).
- Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).
- Clifford, D. B., Ances, B. M.
- Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).
- Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8 (2), e57307 (2013).
- Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).
- Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).
