Summary
De mekanismer som styr den interstitiella motilitet av CD4 T-celler vid inflammationsställen är relativt okänd. Vi presenterar en icke-invasiv metod för att visualisera och manipulera in vitro -primed CD4 T-celler i de inflammerade öron dermis, vilket möjliggör studier av dynamiska beteendet hos dessa celler in situ.
Abstract
Förmågan hos CD4-T-celler för att utföra effektorfunktioner är beroende av en snabb och effektiv migrering av dessa celler i inflammerade perifera vävnader genom en än så länge odefinierad mekanism. Tillämpningen av multifotonmikroskop till studiet av immunsystemet ger ett verktyg för att mäta dynamiken i immunresponser inom intakta vävnader. Här presenterar vi ett protokoll för icke-invasiv intravital multifoton avbildning av CD4 T-celler i de inflammerade mus öron dermis. Användning av en anpassad avbildning plattform och en venkateter möjliggör visualisering av CD4 T-cells dynamik i huden interstitium, med möjlighet att förhöra dessa celler i realtid via tillsats av blockerande antikroppar till viktiga molekylära komponenter som motilitet. Detta system ger fördelar gentemot både in vitro modeller och kirurgiska invasiva avbildningsförfaranden. Förstå banorna används av CD4 T-celler för rörlighet i slutändan kan ge insikt i de basic funktionen hos CD4-T-celler såväl som vid patogenesen av både autoimmuna sjukdomar och patologi från kroniska infektioner.
Protocol
Alla procedurer som involverar möss godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Rochester, och genomförs i strikt överensstämmelse med djurskyddslagen och Public Health Service Policy för mänsklig omsorg och användning av försöksdjur administreras av National Institutes för hälsa, Office of Laboratory Animal Welfare.
1. Framställning av Effector CD4 T-celler
OBS: BALB / c-TCR-transgena DO11.10 möss som specifikt känner igen en peptid från hönsägg ovalbumin (Pova: ISQAVHAAHAEINEAGR). Andra TCR-transgena system kan vara substituerad, med användning av lämplig cognate peptiden i stället för Pova där så anges.
- Rena naiva CD4 T-celler
- Avliva en 6-8 veckor gammal kvinnlig DO11.10 BALB / c-mus genom att exponera till 2 L / min CO 2 tills musen visar inga tecken på rörelse eller andning under 1 min, följt av cervikal dislokation, eller, beroende påriktlinjerna för lokala Institutional Animal Care och användning kommittén. Spraya musen med en 70% etanollösning och göra en ca 7 cm snitt i huden från hakan på musen för att 2/3 av vägen ner buken. Göra 2-3 cm hud snitt från änden av snittet i buken mot bakfötterna. Var noga med att inte skära in i bukhinnan.
- Försiktigt separera huden från bukhinnan genom att dra med pincett. De inguinala lymfkörtlar är belägna på huden nära korsningen av bakbenen med kroppen. Ta bort genom att greppa och dra med pincett och placera i 8 ml HBSS supplementerat med 2% serum från nyfödd kah (NCS).
- Skörda armhålan och brachial lymfkörtlar från musen genom att greppa och dra försiktigt med pincett. Placera i HBSS + 2% NCS med inguinal lymfkörtlar.
- Skörda djupa och ytliga cervikala lymfkörtlar belägna i halsen på musen med pincett och placera i HBSS + 2% NCS med othennes lymfkörtlar.
- skär försiktigt i bukhinnan, noga med att inte skära i tarmarna. Ta tag i blindtarmen och tjocktarmen med pincett och exponera kröslymfknutor som ligger bara längs kolon. Ta försiktigt bort kröslymfknutor med pincett och placera de andra lymfkörtlarna.
- Leta mjälten i bukhålan och försiktigt bort det, hålla med pincett och skär den bindväv bort med ett par av kirurgiska saxar. Placera mjälten med lymfkörtlarna.
- Förbereda en enkelcellsuspension genom att hälla HBSS + 2% NCS innehåller mjälten och lymfkörtlar i en metall sil placerades i ett 60 x 15 mm odlingsskål. mosa försiktigt mjälte och lymfkörtlar genom metall sil med kolven från ett 10 ml spruta i HBSS + 2% NCS.
- Med hjälp av en pipett, flytta cellsuspensionen i ett rent 50 ml centrifugrör. Skölj metall sil och odlingsskål med ytterligare 10 ml HBSS + 2% NCS, usjunga en pipett, och placera denna lösning i samma 50 ml centrifugrör som cellsuspension.
- Snurra cellerna vid 600 xg under 5 min för att pelletera cellerna och återsuspendera i 10 ml HBSS + 2% NCS genom att försiktigt pipettera. Om inte annat anges, bör alla centrifugering utföras vid 600 xg under 5 min.
- Späd 10 | il av cellsuspensionen i 90 pl av 0,1% trypanblått i PBS under en 1:10 spädning. Placera 10 | il av cellerna i trypanblått på en hemocytometer genom att pipettera lösningen in i spåret vid kanten av den hemocytometer. Räkna de vita blodkropparna i centrum rutnät av hemocytometer, ignorerar erytrocyter som visas som något mindre, runda, röda-färgade celler och de blå döda / döende celler. Multiplicera antalet celler som räknats av 10 4, med utspädningsfaktorn (10), och genom att volymen av cellerna (10 ml) för att fastställa det totala antalet celler som samlats in i 50 ml centrifugrör.
- Att anrika CD4-T-celler, centrifugeraceller för att pelletera, och återsuspendera cellerna vid 2x10 7 celler / ml i en lösning innehållande ca 1 | j, g / ml anti-CD8 (klon 3,155), 1 pg / ml anti-MHC klass II (klon M5 / 114), och en ^ g / ml anti-CD24 (klon J11d) antikroppar i HBSS + 2% NCS genom att försiktigt pipettera.
OBS: De antikroppar som används i detta steg är härledda internt från hybridomcellinjer och koncentrationer approximeras. Koncentrationen och volymen av dessa antikroppar perfekt för komplement lys bestämdes empiriskt och kommer att variera mellan laboratorier. Alternativt flera kommersiellt tillgängliga kit är tillgängliga för rening av naiva CD4 T-celler och kan användas i stället för komplement lys och CD62L + reningsprocess representerade här. Om du använder en annan metod för att rena naiva CD4 T-celler, kan detta protokoll fortsätta från steg 1,2. - Inkubera på is under 30 min. Vid slutet av denna inkubation, snabbt tina marsvinskomplement genom att placeras i en 37 ° C vatten bath under ca 2 min. Tillsätt 100 pl av komplement för varje 1 ml av celler i antikroppslösningen genom att pipettera komplementet direkt in i cellsuspension. Inkubera celler i ett 37 ° C vattenbad i 30 min.
- Lägga HBSS + 2% NCS att bringa cellerna till en total volym av 20 ml i centrifugröret. Skikt i 8 ml RT-densitetscentrifugering media (densitet 1,086 g / ml) under cellerna. centrifugera omedelbart cellerna vid 1400 xg vid RT i 15 min med centrifugbroms avstängd.
- Samla upp celler vid gränsytan med hjälp av en serologisk pipett och överföra cellerna till ett nytt 50 ml centrifugrör. Tvätta cellerna genom att bringa volymen i centrifugröret till 50 ml med HBSS + 2% NCS och centrifugering.
- Resuspendera cellerna i MACS-buffert (PBS kompletterat med 2% NCS och 2 mM EDTA) genom att försiktigt pipettera och räknas som tidigare, i steg 1.1.10.
- För anrikning av naiva CD4 T-celler, återsuspendera cellerna vid 2x10 7 celler / ml i en lösningav 2,5 | j, g / ml biotin-konjugerat anti-CD62L-antikropp i MACS-buffert, baserat på antalet räknade i steg 1.1.16. Inkubera i 30 minuter på is.
- Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml MACS-buffert, därefter centrifugering av cellerna. Resuspendera cellerna vid 10 7 celler / 100 | il i MACS-buffert och tillsätt streptavidin-konjugerade magnetiska separationspärlor vid en 1:10 spädning direkt till cellerna. Inkubera på is under 20 min.
- Tvätta cellerna som tidigare, i steg 1.1.17, och återsuspendera cellerna vid 2x10 8 celler / ml i MACS-buffert, i en minimal volym av 500 | il.
- Placera en magnetisk separation kolumn i magnethållaren och tvätta kolonnen genom att låta 3 ml MACS buffert passera. Applicera cellerna till kolonnen med en pipett.
- Tvätta kolonnen för att avlägsna celler som inte är bundna av den magnetiska kolonnen genom att pipettera 3 ml MACS-buffert på kolonnen och tillåta MACS-buffert för att flöda genom, och upprepa 3 gånger. Kassera genomflödesfraktionen.
- Avtagbare kolonnen från den magnetiska stå och hålla över en ny 50 ml centrifugrör. Pipet 5 ml MACS-buffert på kolonnen och använda kolven bifogas kolonnen för att pressa de MACS-buffert genom kolonnen för att frigöra kolumnbundna cellerna och samla flödet genom som innehåller de anrikade naiva CD4 T-celler.
- Centrifugera cellerna och återsuspendera i 10 ml RPMI kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS), 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 50 | aM 2-merkaptoetanol (RPMI-10). Räkna cellerna som tidigare, i steg 1.1.10.
- Justera den slutliga koncentrationen av de naiva CD4 T-celler till 6x10 5 / ml i RPMI-10.
- Rena T-cell-utarmade mjält APC
- Avliva en 6-8 veckor gamla kvinnliga vilda-typ BALB / c-mus som i steg 1.1.1.
- Spraya musen med en 70% etanollösning och exponera mjälten genom att göra en ca 3 cm snitt på den vänstra sidan av musens abdomen. Skär öppna peritoneal lager och ta bort mjälten genom att försiktigt ta tag den med pincett och skär bort från den underliggande bindväv med kirurgiska saxar.
- Placera mjälten i 8 ml HBSS + 2% NCS.
- Förbereda en enkelcellsuspension genom att mosa mjälten, tvätta och räkna cellerna, som tidigare, i steg 1.1.7-1.1.10
- Utarma T-celler genom att snurra på cellerna vid 600 xg under 5 min till pellets, och återsuspendera cellerna vid 2x10 7 i en lösning av ca 1 | j, g / ml anti-Thy1.2 antikropp (J1J klon) genom att försiktigt pipettera. Inkubera cellerna på is under 30 min.
OBS: Denna antikropp härleddes internt från en hybridomcellinje och concentraton approximeras. Koncentrationen och volymen av denna antikropp idealisk för komplementlys bestämdes empiriskt och kommer att variera mellan laboratorier. Andra metoder för rening av APC från splenocyter kan vara substituerade om så önskas. Naiva T-celler och APC bör förberedas i kulture från steg 1,3. - Lägg marsvinskomplement, inkubera och separera cellerna på en densitetscentrifugering media gradient som tidigare, i steg 1.1.13-1.1.14.
- Resuspendera cellerna i 10 ml av RPMI-10 och bestråla APC genom att placera cellerna i ett 50 ml centrifugrör i en gammabestrålare för en tidslängd som kommer att utsätta cellerna för 25 Gy strålning. Denna tidslängd varierar beroende på den bestrålare och kommer att behöva beräknas varje gång celler bestrålas.
- Räkna cellerna på en hemocytometer som tidigare, i steg 1.1.10, och justera APC-celler till en slutlig koncentration av 2.4x10 6 celler / ml i RPMI-10.
- Stimulera celler och differentiera CD4 T-celler till en Th1-fenotyp i en 5-dagars odling.
OBS: Även om vi presenterar här ett protokoll för att förbereda och avbildning Th1 effektenheter som genereras från naiva CD4 T-celler, kan detta protokoll justeras för att differentiera naiva celler till en annan fenotyp, eller to använda andra celltyper, såsom CD8 T-celler. Villkor för priming och differentiering måste bestämmas empiriskt.- I varje brunn i en 24-brunnars odlingsskål, kombinera 500 pl av de naiva CD4 T-celler och 500 | il av de bestrålade APC i varje brunn, för totalt 3x10 5 T-celler och 1.2x10 6 APC per brunn.
- En lösning framställdes i RPMI-10 innehållande 2 | iM cognate OVA-peptid, 20 U / ml rekombinant IL-2, 80 pg / ml anti-IL-4 (klon 11B11) och 40 ng / ml rekombinant IL-12 och filter med användning av en 0,2 xm sprutfilter. Tillsätt 1 ml av denna lösning till varje brunn av celler, för en total volym av 2 ml i varje brunn.
- Inkubera cellerna i en 37 ° C inkubator vid 5% CO2 under 3 dagar.
- På dag 3, delbart kulturerna genom att försiktigt pipettera att resuspendera cellerna och flytta 1 ml från varje brunn i en ny odlingsbrunn. Föra varje brunn till en slutlig volym av 2 ml genom tillsättning av 1 ml / brunn av RPMI-10 + 20 U / ml rekombinant IL-2. </ Li>
- Återgå plattorna till inkubatorn och tillåta cellerna att expandera till dag fem.
2. Överföring av celler och induktion av inflammation
OBS: För optimala cellantal för avbildning, bör 5x10 6 fluorescerande Th1 celler överföras till varje mus i en total volym av 200 pl PBS. Celler här är märkta med det gröna färgämnet CFSE eller nära röda färgämnet CMTMR, även om andra cell tracker färgämnen kan användas. CFSE och CMTMR-märkta celler kan användas samtidigt överföras för att möjliggöra spårning av två distinkta effektor CD4 populationer.
- Etikett effektor T-celler med CFSE
- Skörda cellerna från odlingsskålarna genom kraftig pipettering av cellerna i varje brunn och överföring till ett sterilt 50 ml centrifugrör med en pipett. Räkna cellerna som i steg 1.1.10, centrifugera sedan och återsuspendera cellerna vid 10 7 celler / ml i PBS + 5% NCS.
- Späd 5 mM stam CFSE lösning 1: 100 iPBS. Lägg 110 pl CFSE lösning för varje 1 ml celler genom att placera en droppe av CFSE lösningen på sidan av röret och sedan snabbt gungande röret fram och tillbaka för att grundligt blanda.
- Inkubera cellerna i 5 minuter vid RT, sedan släcka CFSE genom att tillsätta 5 ml fetalt kalvserum (FCS) direkt till röret av celler. Bringa volymen till 50 ml med PBS + 5% NCS.
- Centrifugera cellerna och återsuspendera pelleten i 20 ml PBS + 5% NCS. Upprepa denna process två gånger för att tvätta cellerna 3 gånger totalt. Räkna cellerna på en hemocytometer, som tidigare, i steg 1.1.10, och återsuspendera cellerna i steril PBS vid 2,5 x 10 7 celler / ml för överföring till möss.
- Etikett effektor T-celler med CMTMR
- Skörda cellerna som ovan i steg 2.1.1, då räknas, centrifug och återsuspendera cellerna vid 10 7 celler / ml i RPMI-10.
- Lägg 10 mM CMTMR stamlösningen direkt till cellerna för en slutlig koncentration av 10 ^ M. Snabbt pipet the celler för att grundligt blanda i CMTMR och förhindra utfällning av färgämnet.
- Inkubera 30 min i en 37 ° C vattenbad. Tvätta cellerna 3x i PBS + 5% NCS som tidigare, i steg 2.1.3-2.1.4. Räkna och återsuspendera cellerna i steril PBS vid 2,5x10 7 celler / ml för överföring till möss.
- Överförings effektor-T-celler till naiva 6-8 veckor gamla BALB / c-möss.
- Rita cellsuspensionen (steg 2.1.4 eller 2.2.3) i en spruta, var noga med att ta bort alla bubblor genom att hålla injektionsnålen sidan upp, försiktigt vicka den sida av sprutan och flytta kolven upp och ned, om det är nödvändigt .
- Placera möss i en ren bur och värm försiktigt under en värmelampa tills svansvenen visas vasodilated. Placera musen i en återhållande anordning och torka svansen med en tuss. Långsamt injicera 200 | il av cellsuspensionen i den laterala svansvenen. Det bör finnas något motstånd injektion eller synlig bubblande under huden.
- Framkalla dermal inflammation genom immunisering med fullständigt Freunds adjuvans (CFA)
OBS: I detta protokoll är inflammation induceras genom intradermal injektion av CFA emulgerat med antingen besläktade eller icke-besläktat antigen. Andra inflammatoriska modeller kan vara substituerad, även om antalet celler som krävs för överföring och tidpunkten för avbildning kommer att behöva justeras empiriskt.- Bered en 200 pM lösning av OVA-peptid i steril PBS i ett mikrocentrifugrör. Pipett en ekvivalent volym CFA ovanpå peptidlösningen.
- Emulgera lösningen genom att dra den i en spruta / 2 insulin 28 G1 och sedan störta lösningen tillbaka in i mikrocentrifugrör, sedan upprepa denna åtgärd cirka 20 gånger. När helt emulgerade kommer CFA och peptidlösning bildar en tjock och opak blandning.
OBS: Det är viktigt att använda en spruta med fast nål insulin för att bilda emulsionen, eftersom emulsionen kommer att försvinna i det döda utrymmet i en icke-fast needle spruta. - Testa emulsionen genom att släppa en liten mängd på vatten placeras i en petriskål. Emulsionen bör förbli intakt och inte sprida i vattnet.
- Rita emulsionen i en spruta 300 l 28 G1 / 2 insulin och tryck ned kraftigt på kolven för att avlägsna stora luftbubblor.
- Omedelbart efter överföringen av fluorescensmärkt effektor-T-celler, söva möss genom ip-injektion av 2,2,2-tribromoethanol vid 240 mg / kg. Bedöma anestesi genom en mild tå nypa, administrera mer 2,2,2-tribromoethanol i steg om 1 mg, om det behövs.
OBS! Andra godkända anestetika kan användas istället för 2,2,2-tribromoethanol. - Placera en fingerborg på vänster pekfinger och försiktigt tag i musens öra mellan vänster tumme och pekfinger med den ventrala örat uppåt. Se till att inte utöva överdrivet tryck på örat, vilket kan orsaka mekaniska skador på huden.
- Skjut nålen innehåller CFA emulsion in i dermis, koniska uppåt, och långsamt injicera 10 | il av emulsionen i örat. Placering av injektionen bör vara i den yttre tredjedel av ytterörat, något off-center för att medge optimal avbildning.
- Övervaka möss tills bedövningen har avklingat och möss kan till höger sig och är ambulatorisk. Bild möss 3 dagar efter immunisering, vilket ger tid för inflammation för att utveckla och de överförda T-celler att trafiken till öron dermis.
OBS: Möss kan inte lämnas utan uppsikt när som helst under anestesi.
3. Förbered musen för Imaging
- Förbered en kateter
- Försiktigt bort metall nålen från en 30 G1 / 2 Tuberculin (TB) sprutnål med tång och rensa bort överflödigt lim med hjälp av en dissekera omfattning att visualisera att limmet är helt bort.
- Skär av spetsen på en annan 30 G1 / 2 TB sprutnål, se till att den återstående nålen är fortfarande patent genom visuell inspektion. Slip ett 18 cm stycke av PE-10 medicinsk slang på den trimmade nålen och placera försiktigt ren metall nålen ca 5 mm in i den andra änden av slangen, vilket skapar en kateter.
- Spola katetern genom att fylla en 1 ml TB spruta med steril PBS, avlägsnande av eventuella luftbubblor. Placera försiktigt katetern på spetsen av sprutan och tryck PBS försiktigt om katetern för att avlägsna eventuella bubblor i slangen.
OBS: när man trycker fluid genom katetern, är det viktigt att hålla katetern på sprutan för att förhindra fluidtrycket från att trycka katetern bort av sprutan. - Placera möss i en ren bur och värm försiktigt under en värmelampa tills svansvenen visas vasodilated. Söva musen med en blandning av rumsluft och isofluran (1-2% underhåll 5% induktion, vid två L / min flödeshastighet), levereras via noskonen enheten som har kopplats till isofluran förångare. Se till att musen är sövda with en mild tå nypa. Stegvis öka isofluran flöde med 0,1% om rörelse observeras. Täck ögonen med oftalmologiska salva för att förhindra uttorkning och skada medan musen är sövd.
OBS: Det är viktigt att möss aldrig lämnas obevakad när sövd. Möss bör ofta kontrolleras tillräckliga anestesi genom försiktig tå nypa. - Immobilisera svans vid basen med en pincett, och torka sedan svansen med en tuss. Skjut försiktigt katetern i den laterala svansvenen och kontrollera öppenhet genom att försiktigt trycka på sprutkolven. Det bör finnas något motstånd mot rörelse och ingen synlig bubblande PBS under huden om det är lämpligt placerad. Anbringa katetern till svansen genom att anbringa 1-2 droppar av cyanoakrylat vävnadsadhesiv till injektionsområdet och låt torka, ca 30 sek.
- trimma försiktigt håret från ryggen och sidorna av örat med en sax, noga med att inte skada ski. Trimma whiskers också. Med hjälp av en bomullspinne, fukta den inre ytan av örat med PBS.
- Rotera musen och örat på en 24 x 50 mm Antal 1,5 täckglas. Använd pincett, försiktigt platta örat på locket glida, flytta musen om det behövs för att säkerställa att örat är i jämnhöjd med glaset. Ta bort överflödigt PBS från örat genom läsk försiktigt med en vävnad torka.
OBS: Se till att inte trycka för hårt på örat, som den tunna huden kan lätt skadas med överdrivet tryck. - Med hjälp av två par böjda pincett, ta tag en cirka 20 mm lång bit tyg tejp på längden på de övre hörnen. Placera botten av tejp på täckglas på toppen av musens öra och rulla tejpen över resten av örat, trycka överflödigt hår ur vägen med pincetten, om nödvändigt att anbringa en örat till täckglas. Tryck försiktigt på bandet runt örat med en torr bomullspinne för att säkerställa en tät förslutning, noga med att inte trycka på örat själv.
- Fäst avbildning plattform för en 37 ° C värmeblock med tejp. Applicera vakuum fett på vardera sidan av örat området av avbildnings plattformen. Rotera musen för att placera täck på bildplattform, var noga med att rikta in örat i mitten av filten.
OBS: Undvik att få vakuum fett på bandet, eftersom detta kommer att få den att komma loss från täckglas. - Snäpp isofluran noskonen i hållaren på bild plattform och se till att noskonen är säker och helt täcker musens nos. Sprid vakuum fett under täck genom hårt men försiktigt trycka täck på avbildning plattform med en ren och torr bomullspinne.
- Anbringa täckglas till plattformen med två 20 mm tejpbitar och två längre tejpbitar lindade runt den övre delen av plattformen. Om några luftbubblor är närvarande mellan örat och täckglaset, kan de försiktigt bort genom att trycka på örat underifrån with en bit vikt papper.
OBS: Det är viktigt att inte använda papper som är för tjockt eller för att trycka fast, eftersom detta kan orsaka vävnadsblanche och skador, vilket komplicerar resultat. - Flytta musen till mikroskop scenen och säkra plattform med tejp. Rör ett dubbelt lager av vakuum fett på täck runt örat för att tjäna som en reservoar för vattenimmersionsobjektiv.
- Wrap en vattenfylld värmefilt runt musen genom avbildning plattformen. Fyll behållaren med 37 ° C destillerat vatten. Se till att allt är fastsatt i scenen med tejp och att sprutan av katetern är lättillgänglig.
4. In vivo time-lapse avbildning och Intravenös Antibody Administration
OBS: Detta protokoll kräver användning av en multifotonmikroskop utrustat med en Ti: Sa lasersystem. Målet som används är en 25x förstoring lins med 1,05 NA, fäst med ett objektive värmare satt till 40 ° C. Den optimala temperaturen för denna värmare bestämdes empiriskt att vara lämplig temperatur för att bibehålla öron dermis vid 37 ° C, och kan behöva justeras för att användas i andra bildsystem. Förvärvs programvara som används kan variera mellan instrument och justeringar av protokoll kan behöva göras för att arbeta på ett annat sätt konfigurerade system. Se till att bilderna kan sparas i ett format som är kompatibel med alla önskade analysprogram.
- Lokalisera dermis genom okularen genom att placera målet över mitten av örat och sänkning av målet bara tills det kommer i kontakt med ytan av vattnet i behållaren. Med användning av en yttre ljuskälla, titta genom okularen och fortsätter att långsamt sänka målet tills ytan av örat kommer i fokus. Sänka de inre och yttre Gardiner runt mikroskop scenen.
- Bestäm mikroskop inställningar och lokalisera ett område för avbildning
- innan imaging, konfigurera laser för maximal excitation och detektion av de önskade fluoroforer genom att justera laservåglängden till 900 nm i MP Laser Controller fönster, lasereffekten i Förvärvs Inställning: Laser fönster, och PMT spänningar i Image Acquisition kontrollfönstret .
OBS: Denna procedur använder en excitationsvåglängd av 900 nm med filter för att upptäcka andra harmoniska generationen (420-460 nm), CFSE (495-540 nm), och CMTMR (575-630 nm). Andra konfigurationer kan användas för att detektera olika fluoroforer såsom önskas. - Ställ in mikroskop till 512 x 512 bildpunkters upplösning, med en 2 ps / pixel uppehållstid i Förvärvs Inställning: Storlek och läge fönster. Aktivera en levande bildläget för att medge avsökning genom vävnaden för ett område på bilden genom att klicka på "XY upprepa". Helst ska området vara relativt jämn, utan luftbubblor, och undvika områden med tät hårsäckar.
OBS: CFA-emulsion är ljust autofluorescerande i det gröna och near-röd kanaler och bör undvikas. En optimal fält kan vanligtvis hittas ungefär 3 mm från kanten av emulsionen. Cirka 10 - 100 celler kan spåras i en enda bild. Om alltför många celler är närvarande, kommer spårningsprogram i allmänhet stöter på fel i ett försök att separera närbelägna celler, vilket leder till kortare och / eller felaktiga cell spår. - När en lämplig bildfältet har lokaliserats, bestämma Z-regionen som ska avbildas genom att placera cellen "högsta" i dermis, inställning av Z-positionen till 0 genom att klicka på knappen "Set 0", och rulla ner i Z riktning för att mäta omfattningen av celldjup. En bilddjup 35-75 um är typisk. Ställ in start- och slutpositioner i Förvärvs Inställning: mikroskop fönster. Justera instrument PMT-spänningar och lasereffekt i "ljusa Z" fönstret för att optimera visualisering av celler i hela djupet av bildfältet.
OBS: Undvik att höja laser makt över 25 mW vid provet, kan så höga effektnivåer orsaka värmeskador och steril skada dermis. Den lämpliga maximala effektnivå för varje mikroskop kommer att variera och kommer att ha som skall mätas. Det bör noteras att öka lasereffekt eller PMT spänning med vävnadsdjup inte tillåter kvantitativ jämförelse av bildljusstyrkan på olika djup i post-förvärvsanalys. - Kontrollera "Djup" och "Time" knapparna under "Scan" -knappen i Image Acquisition kontrollfönstret. Ställ en Kalman filter för att skanna bilden 3 gånger per rad i Image Acquisition Control: Filterläge fönster och justera Z-slice djup i Image Acquisition: Mikroskop fönstret så att det tar ungefär en minut att fånga en komplett stack, som noterats i Timeview fönstret.
OBS: Intervallet mellan staplar bör inte ta längre tid än ca 1 minut, som längre intervall förhindrar spårning av snabbt migrerande celler. Beroende på the typ av celler som avbildas, kan detta intervall behöva justeras för att möjliggöra en ändamålsenlig cell spårning av analysprogram. Z-segment bör inte vara mer än 5 | im. Generellt 15-18 Z-skivor mellan 2-5 um tjocka är lämpliga för en 1 min avbildning intervall.
- innan imaging, konfigurera laser för maximal excitation och detektion av de önskade fluoroforer genom att justera laservåglängden till 900 nm i MP Laser Controller fönster, lasereffekten i Förvärvs Inställning: Laser fönster, och PMT spänningar i Image Acquisition kontrollfönstret .
- Fånga en pre-antikropp time-lapse bild
- Fånga en 5 minuters time-lapse bild av området för att bedöma stabiliteten i vävnaden genom att ställa in antalet upprepningar till "5" i Acquisition Inställning: TimeScan fönster och klicka på "Scan" -knappen.
OBS: Tissue "drift" kan orsakas av inte ger tillräckligt med tid för örat för att nå termisk jämvikt, dålig öra förberedelse, eller kan bero på lokala avvikelser i en region av örat. Om 5 min bild är inte stabil, avbildar en ny region i dermis. Om en andra bild i en ny region fortfarande instabil, är det bäst att noga upprepa örat förberedelse och bildbehandling från steg 3,6 med en färsk coverslip. - Om vävnaden är stabil i 5 min bild, samla en 30-45 min time-lapse bilden genom att ställa in antalet upprepningar till mellan 30 och 45 i Förvärvs Inställning: TimeScan fönster, övervakning för någon mindre vävnad drift eftersom bilden är samlade in. Spara filen i ett format som är kompatibelt med det analysprogram som ska användas.
OBS: Vid denna punkt i protokollet, steg 4.2.2 - 4.3.2 kan upprepas för att avbilda flera platser i samma öra. En enda mus bör inte hållas sövd under längre tid än fyra timmar, som döden är mer sannolikt att inträffa.
- Fånga en 5 minuters time-lapse bild av området för att bedöma stabiliteten i vävnaden genom att ställa in antalet upprepningar till "5" i Acquisition Inställning: TimeScan fönster och klicka på "Scan" -knappen.
- Injicera blockerande antikroppar och fånga en post-antikropps bild.
- Rita antikroppblandningen i en TB-spruta en ml och ta bort nålen, och se till att ta bort alla luftbubblor. Tryck på kolven så att antikroppen lösning bildar en "droppe" i slutet av sprutan.
- Lyft Gardiner runt scenen och lokalisera katetern. Ta bort den ursprungliga PBS-containing sprutan från katetern. Utan att katetern ner, noggrant fästa ny spruta innehållande antikropparna. Håll i änden av katetern på sprutan och långsamt injicera antikroppsblandning in i katetern. Se till att det inte finns något motstånd mot injektion.
- Ställ in katetern ner och sänka gardiner omger mikroskop scenen. Notera tiden för injektionen och omedelbart börja samla in en ny 20-40 min avbildningssekvens på samma plats med samma inställningar instrument som pre-antikropps bild. Spara filen i ett lämpligt format för analys programvara som ska användas.
OBS: Mellan tidsförlopp bilder, observera musen för tillräcklig anestesi och andning. Det rekommenderas inte att bilden mer än ett fält efter administrering av antikroppar, eftersom det kan vara rörlig ränta av clearance av antikroppen.
- Injicera fluorescerande-märkt dextran för att lokalisera blodkärlen, bedöma kateter patency, och mäta bLood kärl permeabilitet
- Bered en 2 mg / ml lösning av fluorescerande-konjugerade dextran (70.000 MW) i 100 pl steril PBS och dra i en spruta, avlägsna eventuella luftbubblor.
- Användning av samma teknik som i steg 4.4.1-4.4.2, placera sprutan på katetern och injicera dextranlösningen intravenöst.
- Fånga en enda stack på 1024 x 1024 bildpunkters upplösning genom att ändra upplösningen i Förvärvs Inställning: Läge fönster, med samma PMT och laser inställningar som för tidsförlopp bilder. För att samla bilden avmarkerar knappen "Tid" under "Scan" -knappen, och sedan klicka på "Scan" -knappen. Denna 3D-bild kommer att möjliggöra de uteslutnings T-celler i kärlsystemet och visar att katetern var patentet och korrekt isatt. Spridningen av fluorescerande dextran av fartygen kan också användas för att bedöma lokala vaskulär permeabilitet.
OBS: Detta med hög upplösning (1024 x 1024) statisk bild används för presentation ändamål och kan dessutom användas för att analysera vävnads arkitektur i samma område som de tidsförlopp bilder. Alternativt kan en 512 x 512 bild tas som kan slås samman med tidsförlopp bilder med hjälp av bildanalysmjukvara. Time lapse avbildning av dextran administration kan också vara önskvärt, beroende på forskningsbehov enskilda Labs. I detta fall bör bilden sättas upp som i steg 4.2.3-4.3.2.
- Efter bildbehandling är klar, försiktigt bort musen från under målet och packa upp vattnet filt. Ta bort täck från bildplattform genom att skära tejpen och försiktigt lyfta glaset tills den lossnar. Medan musen är fortfarande sövda, lossa örat från täckglas. Om detta är att vara en terminal förfarande, avliva musen genom cervikal dislokation. Om du sparar denna mus för upprepad avbildning, returnera den till en ren bur separat från andra möss och observera tills musen kan räta upp sig och ärambulatorisk. När återhämtat sig från anestesi, kan musen återföras till en bur med andra djur.
- Importera bildfiler till ett bildanalysprogram och utföra önskade korrigeringar. Undvikande av icke-linjära förbättringar och automatiserade stryk- eller buller program och algoritmer reduktions rekommenderas. Vanligtvis bilder behöver bara en liten bakgrundskorrigering genom att manuellt öka den svarta punkten i bilden innan analys. Analysera data avbildnings med hjälp av en automatiserad cell tracking-program med manuell korrigering, som i Overstreet, Gaylo et al 30.
OBS: Det finns många bildanalys sviter, både egenutvecklade och öppen källkod, som kan användas för att kvantifiera cell dynamiken från multifoton bilder som härrör från detta protokoll. Den exakta metoden för bildanalys och de optimala programvarupaket som ska användas kommer att bero på forskningsbehov enskilda laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan att studera immunsvar in situ utan att förändra den immun miljö är en förutsättning för att studera realtid interaktioner av T-effektorceller med en inflammerad vävnad. Avbildning av intakta öron dermis av detta protokoll, som beskrivs i Figur 1A och B, möjliggör visualisering av överförda fluorescerande T effektorceller i huden interstitium. Detta möjliggör både hög upplösning (figur 1C) och time-lapse (figur 1D, Film 1) bilder av effektor T-cell dynamik i de inflammerade dermis.
Figur 1. Hög upplösning och 4D avbildning av T-effektorceller i den intakta huden interstitium. (A) Försöks kontur. (B) Ett fotografi av ett öra prepared för avbildning med platsen för emulsionen (svart streckad linje) och optimal område för avbildning (röd linje) anges. (C) Maximal 3D-projektion av en hög upplösning stack visar CFSE-märkta Th1-celler (grön), andra harmoniska signalen från fibrillärt kollagen (blå) och Texas Red-dextran märkt kärl (röd). Den vita pilen visar ett av flera autofluorescerande hårsäckar. Skalstrecken representerar 50 pm (D) vandrande vägar Th1 celler spåras under 30 minuter i CFA-inflammerade dermis. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Denna avbildning protokoll kräver användning av en specialiserad imaging plattform som konstruerades i egen regi, samt en anpassad noskonen för leverans av inhalerad anestesi medan avbildning. Avbildning plattformen (figur 2A-B) består of en aluminium basplatta med en upphöjd mittsektion. Detta gav upphov till avsnitt har en infälld del kantas av akryl kände att ge stöd till örat utan att komprimera och potentiellt skadliga den tunna vävnaden. Geometrin hos vår installation krävs konstruktionen av en flexibel och justerbar nosecone att leverera inandad anestesi under avbildning. Denna noskon, som består av en modifierad mikrocentrifugrör ansluten till en 50 mm sektion av flexibel slang (figur 2C), är fäst på plats med en hållare som består av modifierade mikrocentrifugrör (figur 2D) och fäst på den bildgivande plattformen via kardborrefäste . Användningen av krok- och öglefästorgan möjliggör ompositionering av noskonen aggregatet så att antingen örat på en mus kan avbildas, och kan vara optimalt positionerad för enskilda möss.
Figur 2. Equipment för intravital avbildning. Skräddarsydda avbildning plattform i toppen (A) och sido (B) vyer. Noskon för isofluran administration (C) och noskon hållaren (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kateterisering av svansvenen möjliggör kontinuerlig tillgång till cirkulationen att administrera antikroppar och andra små molekyler som kan diffundera ut ur kärl, eller större fluorescerande molekyler såsom hög molekylvikt dextran att märka blodkärl. Efter administrering av 100 | j, g av anti-β 1 och anti-β 3 grin blockerande antikroppar genom katetern, som tidigare rörliga celler stillestånd i dermis (film 2). Dessa celler har en minskad medelhastighet efter antikropp administration (figur 3A), såväl som en signifikant minskning av slingrande index, förhållandet mellan den totala förskjutningen till den totala spårlängd (figur 3B).
Figur 3. Administrering av anti-β 1 och anti-β 3-antikroppar inhiberar Th1-celler migration i CFA-inflammerad hud. (A) Genomsnittlig hastighet på Th1-celler före och efter administrering av 100 | ig anti-β 1 och anti-β 3 grin blockerande antikroppar. (B) Slingrande index för Th1-celler före och efter antikropps blockad. Cirka 100 spårade celler är från bilder före och efter antikropps blockad från en enda mus i ett representativt experiment. Statistik efter Mann Whitney.es / ftp_upload / 53.585 / 53585fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Eftersom håret inte tas bort från ytan av örat, imaging artefakter från håret är vanliga. Autofluorescens från hårsäckar (Figur 4A) och skuggning och autofluorescens från liggande hår (Figur 4B) bör undvikas om möjligt eftersom de kan skymma T-celler och störa automatiserad bildanalys programvara. På samma sätt kan luftbubblor fastnar mellan örat ytan och täck leda till avbildningsartefakter (Figur 4C). Korrekt beredning av örat bör minimera antalet och storleken på eventuella återstående bubblor.
Figur 4. Gemensamma artefakter från hår autofluorescens och dålig öra preSeparation. (A) autofluorescent hårsäckar. (B) autofluorescent hår och hårsäckar (grön) och kollagen (vit) med överliggande hår skuggor, orsakar mörka linjer i bilden. (C) artefakt från en luftbubbla, som visar kanten av fördrivna, autofluorescerande keratiniserade epidermis (streckad linje). Skalstrecken representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessutom, kan användningen av multipla värmekällor leda till problem med stabiliteten av vävnaden beroende på termisk expansion och kontraktion. Felaktiga inställningar termostat, till exempel, kan leda till stora svängningar under avbildning som kan göra tolkningen av resultaten svåra (Film 3). Det är viktigt att fastställa de optimala inställningarna för alla system som ger en konstant temperatur och maximerar stabilitet. Ultimately, är en temperaturstyrd avbildning kammare det bästa sättet att ta bort variation från förändringar i temperatur.
Film 1. Th1-celler som migrerar i CFA-inflammerade dermis (Högerklicka för att ladda ner). 30 min tidsförlopp bild som visar Th1-celler (grön) migrerar i huden kollagen nätet (andra harmoniska generation, blå).
Film 2. Th1 celler gripandet vid blockad av β 1 och p 3 integriner (högerklicka för att ladda ner). Celler (grön) avbildades för 30 minuter före administranson av blockerande antikroppar och sedan avbildas under ytterligare 20 min i samma plats.
Film 3. Svängningar från en dåligt kontrollerad värmeplatta (Högerklicka för att ladda ner). 30 min time-lapse bilden av Th1-celler (grön) och andra harmoniska generationen (blå). Efter detta avbildar uppsamlades, var värmeplattan används visar sig ha en felaktig termostat, vilket orsakar svängningar i temperaturen hos den bildgivande plattformen och efterföljande termisk expansion och kontraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydelse
Här presenterar vi en komplett protokoll för 4D visualisering av överförda, antigenspecifika effektor Th1 celler i intakta mus öron dermis. Denna metod ger fördelar över några aktuella avbildningsmetoder av flera skäl. Genom avbildning av ventrala örat dermis, har vi möjlighet att avstå hårborttagning som krävs för avbildningsprotokoll som involverar andra hudytor. Även hårborttagningsmedel är vanligtvis milda, har de visat sig orsaka störningar i hudbarriären 42, en process som kan stimulera ett immunsvar 43,44. Genom att också undvika kirurgiska ingrepp för att exponera dermis eller hypodermis, förhindrar detta protokoll skada-inducerad inflammation och den snabba rekryteringen av neutrofiler 37 och andra immunceller in i dermis. Användning av en venkateter i detta system för att leverera blockerande antikroppar mot nyckelmolekyler möjliggör realtid förhör av den dynamic beteende av CD4 T-celler. Användningen av denna bildprotokoll har visat kritiska krav för CD4 T-cell interstitiell rörlighet 30 som inte upptäcktes i in vitro-system 8.
Kritiska steg i förfarandet
Ett viktigt steg i någon avbildningsprotokoll är att säkerställa en stabil vävnadspreparat för avbildning. Det är viktigt att se till att det finns tillräckligt med PBS mellan örat och täckglaset att det inte finns några luftbubblor och örat är i kontakt med glaset, men inte så mycket att det förorsakar bandet att bli de-vidhäftade från glaset. På samma sätt undvika kontakt mellan bandet håller täck till plattformen och alla vakuum fett förhindrar bandet från att lossna med tiden. Temperaturen måste också hållas konstant för att undvika svängningar och drift av termisk kontraktion eller expansion av plattformsmaterial.
Begränsningar och modifikationer
45. Dock är bosatt immun population av örat skiljer sig från huden på flanken eller trampdynan 46, och musen örat har distinkta vaskulära egenskaper jämfört med andra platser 47. Således, för vissa tillämpningar kan jämförelse av örat bilddata till andra hudställen vara svårt.
Detta protokoll kräver också en effektiv migrering av överförda T effektorceller ur blodet och in i dermis. Detta begränsar möjligheten att använda celler som har defekter i homing eller extravasering eftersom de inte kommer att kunna komma in i mellanrummet. extravaseringkan kringgås genom att injicera celler direkt in i örat dermis 37,48, även om detta kommer att orsaka några mekaniska skador och leverans av celler på detta sätt kan inte rekapitulera lokalisering eller beteendet hos celler som genomgår in vivo extravasering.
Det är också viktigt att överväga att använda icke-pigmenterade mottagande möss för avbildning experiment, såsom BALB / c-stammen som används här eller Albino C57BL / 6- Tyr c-2J möss. Melanin i pigmenterade möss, förutom att vara mycket autofluorescent, värmer upp även under relativt låg effekt excitering från en multifoton laser 37. Detta kan orsaka termisk skada på huden och efterföljande inflammation 36 eller fluorescerande fläck 31, vilket komplicerar resultat. Detta kan begränsa fluoroforer som kan användas i en flerparameter imaging experiment. Emellertid kan vissa mycket ljusa eller höggradigt uttryckta fluorescerande molekyler vara effektivt exciteras vid låg lasereffekt, alltgrund för effektiv visualisering i pigmenterade möss.
framtida tillämpningar
Eftersom detta är en icke-invasiv procedur, kan det enkelt anpassas för longitudinella studier på möss med sekventiell avbildning över längre tidsperioder. Medan fluorescensmärkning som beskrivs här skulle blekna med tidsperioder som är större än 3-4 dagar, användning av endogent fluorescerande celler eller fluorescerande reporterceller eliminerar detta problem. I själva verket har vi tidigare använt detta protokoll för att spåra i vivo- genererade antigenspecifika effektorer bär cytokin reportrar, inklusive IFNy reporter Yeti 30,49 och IL-4 reporter 4get 50. Vi har dessutom visualiseras endogena CD4-celler i CD4-Cre ROSA26-stop-floxed EYFP fluorescerande reporter möss 30. Som de fluorescerande egenskaperna hos EYFP och andra fluorescerande proteiner skiljer sig från kemiska färgämnen såsom CFSE, kan modifieringar av avbildningsparametrar behövasför effektiv visualisering. Förändringar såsom ökad uppehållstid pixel kan förbättra fluorescenssignal av vissa dim fluoroforer, och minska den tid förlopp bilder kan mildra eventuella fotoblekning som kan observeras. Vid 900 nm excitation, har vi inte tidigare observerats betydande fotoblekning av CFSE, CMTMR eller EYFP över korta avbildnings mellanrum.
Även om detta förfarande är inriktat på mätning av dynamiken i CD4 effektor T-cell motilitet, är den inte begränsad till denna tillämpning. Arbete pågår för närvarande för att mäta de dynamiska interaktioner av effektor-T-celler med antigenpresenterande celler genom användning av fluorescerande reporter möss och injektion av fluorescerande konjugerade antikroppar in i dermis för att märka celler eller vävnadsstrukturer före avbildning 51,52. Dessutom, medan detta protokoll visar användningen av katetem för att leverera blockerande antikroppar medan avbildning, andra föreningar, innefattande småmolekylinhibitorer, kanskall administreras. I slutändan ger detta protokoll en flexibel plattform för att mäta immun dynamik över tiden, in vivo, i ett icke-invasivt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar University of Rochester multifotonmikroskop Kärn anläggning för hjälp med levande avbildning. Med stöd av NIH AI072690 och AI02851 till DJF; AI114036 till AG och AI089079 till MGO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mice | Jackson Laboratories | 000651 | Mice used were bred in-house |
| DO11.10 mice | Jackson Laboratories | 003303 | Mice used were bred in-house |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | Multiple Equivalent |
| Newborn Calf Serum (NCS) | Thermo/HyClone | SH30118.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| Guinea Pig Complement | Cedarlane | CL-5000 | |
| anti-CD8 antibody | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-MHC Class II antibody | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-CD24 antibody | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | Antibodies derived from this hybridoma |
| anti-Thy1.2 antibody | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | Antibodies derived from this hybridoma |
| Ficoll (Fico/Lite-LM) | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | Multiple Equivalent |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| biotinylated anti-CD62L antibody (clone MEL-14) | BD | 553149 | |
| streptavidin magnetic separation beads | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| recombinant human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| recombinant mouse IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| recombinant mouse IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| anti-IFNg antibody (clone XMG 1.2) | eBioscience | 16-7311-85 | |
| anti-IL-4 antibody (clone 11b11) | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | 15303641 | |
| L-glutamine | Fisher | 15323671 | |
| 2-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| ovalbumin peptide | Biopeptide | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH peptide | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo/HyClone | SV30014.03 | Heat inactivated at 56 °C for 30 minutes |
| 24-well culture plate | LPS | 3526 | Multiple Equivalent |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 1ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 insulin syringes, 300μl | BD | 309301 | |
| 27 G1/2 TB syringes, 1ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 needles | BD | 305106 | |
| PE-10 medical tubing | BD | 427400 | |
| cyanoacrylate veterinary adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| heating plate | WPI | 61830 | |
| Heating plate controller | WPI | ATC-2000 | |
| Water blanket controller | Gaymar | TP500 | No longer in production, newer equivalent available |
| water blanket | Kent Scientific | TP3E | |
| Isoflurane vaporizer | LEI Medical | Isotec 4 | No longer in production, newer equivalent available |
| isoflurane | Henry Schein | Ordered through Veterinary staff | |
| microcentrifuge tubes | VWR | 20170-038 | Multiple Equivalent |
| medical tape | 3M | 1538-0 | |
| isoflurane nosecone | Built In-house, see Fig 2 | ||
| imaging platform | Built In-house, see Fig 2 | ||
| curved forceps | WPI | 15915-G | Multiple Equivalent |
| scissors | Roboz | RS-6802 | Multiple Equivalent |
| glass coverslips | VWR | Multiple Equivalent | |
| high vacuum grease | Fisher | 146355D | |
| cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| delicate task wipes | Fisher | 34155 | Multiple Equivalent |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM upright microscope with Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Olympus | call for quote | |
| optical table with vibration control | Newport | call for quote | |
| 25x NA 1.05 water immersion objective for multiphoton imaging | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| objective heater | Bioptechs | PN 150815 | |
| Detection filter cube | Olympus | FV10-MRVGR/XR | Proprietary cube, can be approximated from individual filters/dichroics |
| anti-integrin β1 antibody (clone hMb1-1) | eBioscience | 16-0291-85 | Azide free, low endotoxin |
| anti-integrin β3 antibody (clone 2C9.G3) | eBioscience | 16-0611-82 | Azide free, low endotoxin |
| Texas Red Dextran (70,000 MW) | Life Technologies | D-1830 |
References
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al. Differing requirements for CCR4, E-selectin, and alpha4beta1 for the migration of memory CD4 and activated T cells to dermal inflammation. Journal of immunology. 189 (1), 337-346 (2012).
- Park, E. J., et al. Distinct roles for LFA-1 affinity regulation during T-cell adhesion, diapedesis, and interstitial migration in lymph nodes. Blood. 115 (8), 1572-1581 (2010).
- Masopust, D., Schenkel, J. M. The integration of T cell migration, differentiation and function. Nature reviews. Immunology. 13 (5), 309-320 (2013).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Schon, M. P., Ludwig, R. J. Lymphocyte trafficking to inflamed skin--molecular mechanisms and implications for therapeutic target molecules. Expert opinion on therapeutic targets. 9 (2), 225-243 (2005).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Friedl, P., Entschladen, F., Conrad, C., Niggemann, B., Zanker, K. S. CD4+ T lymphocytes migrating in three-dimensional collagen lattices lack focal adhesions and utilize beta1 integrin-independent strategies for polarization, interaction with collagen fibers and locomotion. European journal of immunology. 28 (8), 2331-2343 (1998).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102 (9), 3262-3269 (2003).
- Lammermann, T., et al. Cdc42-dependent leading edge coordination is essential for interstitial dendritic cell migration. Blood. 113 (23), 5703-5710 (2009).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nature immunology. 11 (10), 953-961 (2010).
- Jacobelli, J., Bennett, F. C., Pandurangi, P., Tooley, A. J., Krummel, M. F. Myosin-IIA and ICAM-1 regulate the interchange between two distinct modes of T cell migration. Journal of immunology. 182 (4), 2041-2050 (2009).
- von Andrian, U. H. Immunology. T cell activation in six dimensions. Science. 296 (5574), 1815-1817 (2002).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296 (5574), 1876-1880 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
- Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2604-2609 (2003).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nature immunology. 4 (6), 579-585 (2003).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 282-291 (2008).
- Bajenoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Kawakami, N., Flugel, A. Knocking at the brain's door: intravital two-photon imaging of autoreactive T cell interactions with CNS structures. Seminars in immunopathology. 32 (3), 275-287 (2010).
- Wilson, E. H., et al. Behavior of parasite-specific effector CD8+ T cells in the brain and visualization of a kinesis-associated system of reticular fibers. Immunity. 30 (2), 300-311 (2009).
- Schaeffer, M., et al. Dynamic imaging of T cell-parasite interactions in the brains of mice chronically infected with Toxoplasma gondii. Journal of immunology. 182 (10), 6379-6393 (2009).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nature medicine. 17 (6), 744-749 (2011).
- Matheu, M. P., et al. Imaging of effector memory T cells during a delayed-type hypersensitivity reaction and suppression by Kv1.3 channel block. Immunity. 29 (4), 602-614 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Teijeira, A., et al. Lymphatic endothelium forms integrin-engaging 3D structures during DC transit across inflamed lymphatic vessels. The Journal of investigative dermatology. 133 (9), 2276-2285 (2013).
- Sen, D., Forrest, L., Kepler, T. B., Parker, I., Cahalan, M. D. Selective and site-specific mobilization of dermal dendritic cells and Langerhans cells by Th1- and Th2-polarizing adjuvants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8334-8339 (2010).
- Gray, E. E., Suzuki, K., Cyster, J. G. Cutting edge: Identification of a motile IL-17-producing gammadelta T cell population in the dermis. Journal of immunology. 186 (11), 6091-6095 (2011).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of investigative dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PloS one. 8 (2), 57135 (2013).
- Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477 (7363), 216-219 (2011).
- Tozer, G. M., et al. Intravital imaging of tumour vascular networks using multi-photon fluorescence microscopy. Advanced drug delivery reviews. 57 (1), 135-152 (2005).
- Lee, J. N., et al. The effects of depilatory agents as penetration enhancers on human stratum corneum structures. The Journal of investigative dermatology. 128 (9), 2240-2247 (2008).
- Brandt, E. B., Sivaprasad, U. Th2 Cytokines and Atopic Dermatitis. Journal of clinical & cellular immunology. 2 (3), (2011).
- Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. European journal of immunology. 34 (8), 2100-2109 (2004).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular research. 19 (3), 374-379 (1980).
- Tong, P. L., et al. The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy. The Journal of investigative dermatology. 135 (1), 84-93 (2015).
- Barker, J. H., et al. The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation. Plastic and reconstructive surgery. 83 (6), 948-959 (1989).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Stetson, D. B., et al. Constitutive cytokine mRNAs mark natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function. The Journal of experimental medicine. 198 (7), 1069-1076 (2003).
- Mohrs, M., Shinkai, K., Mohrs, K., Locksley, R. M. Analysis of type 2 immunity in vivo with a bicistronic IL-4 reporter. Immunity. 15 (2), 303-311 (2001).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Cummings, R. J., Mitra, S., Lord, E. M., Foster, T. H. Antibody-labeled fluorescence imaging of dendritic cell populations in vivo. Journal of biomedical optics. 13 (4), 044041 (2008).
