Introduction
Uppdraget för National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) Integrated Research Facility vid Fort Detrick i Frederick MD (IRF-Frederick) är att utföra växande forsknings infektionssjukdom att förstå de kliniska sjukdomsprocesser som korrelerar med svårighetsgraden av mikrobiellt inducerad sjukdom. IRF-Fredrik har en unik förmåga att utföra medicinsk avbildning i djurmodeller med hög konsekvens patogener i en ABSL-4 laboratorium 1. De avbildningsmetoder som finns tillgängliga för utredare inkluderar: datortomografi (CT), magnetisk resonanstomografi (MRI), positronemissionstomografi (PET), enkelfoton datortomografi (SPECT), ultraljud, röntgen, och fluoroskopi. Forskare använda tillgängliga avbildningsfunktioner för att övervaka sjukdomsförloppet och utvärdera effekten av insatserna, såsom läkemedelsbehandling och vaccination, i longitudinella studier.
De avbildningsmetoder på IRF-Frederick var specifiktutformade för att hålla de centrala delarna av utrustningen utanför hög inneslutning 2,3 och åtkomliga för underhåll och reparation. Denna konstruktion skiljer bildsvit i "heta" (innehållande patogen) och "kalla sidan." För att uppnå denna separation, var särskilt utformade rören för att sträcka sig med hög inneslutningsutrymmet i hålen på varje avbildningsmodalitet (Figur 1). Förutom att ge biologisk inneslutning, dessa rör skyddar bildutrustning från gaser och kemikalier som används för att sanera hög inneslutningslaboratorium. Imaging forskare och tekniker driva scanners från "kalla sidan" medan jämförande medicin (CM) personal handtag och övervaka djur på "varma sidan". Eftersom CM personalen måste arbeta i nära samarbete med avbildnings forskare att samordna dessa experiment, kan denna separation leda till kommunikationsutmaningar.
Efter att ha utvärderat alternativ, CM personal var uteutrustad med Bluetooth öron bitar som sänder korta våglängdsultra högfrekventa radiovågor till telefoner som används för att ringa bild personal utanför inneslutningen. På grund av utformningen av anläggningen, måste installeras i varje rum för att övervinna signal störningar som orsakas av lager av cement och stål mellan den "heta" och "kalla sidan" trådlösa åtkomstpunkter. Således är nu tillförlitlig kommunikation mellan CM personal bär bullriga positivt tryckdräkter och bildbehandling personal utanför hög inneslutning. Kameror har också installerats på den varma sidan av bild rum för avbildning personal att se aktivitet på "varma sidan". Med kamerorna kan bild personal vägleda CM tekniker med djur positionering eller eventuella ändringar i sista minuten till bild protokollet.
Allt arbete i IRF-Frederick ABSL-4 kostym laboratorium kräver personal att bära positivt tryck inkapslande passar 4. Bära dessa dräkter nedsatt rörlighet, och den tunga sentx handskar knutna till dräkten plus ytterligare upp till tre lager av handskar kompromisser fingerfärdighet. Resultatet är att förfarandena tar längre tid att slutföra och uppgifter som kräver fingerfärdighet är mycket svårare. Som biosäkerhetsnivån ökar, djurhantering och manipulationer blir mer krävande och tidskrävande, i synnerhet med små djur. Förfaranden i en ABSL-4 laboratorium kan ta upp till 2-3 gånger längre än en ABSL-2 laboratorium.
Syftet med denna artikel är att visuellt visa de utmaningar som är förknippade med avbildning djurmodeller i en ABSL-4 miljö med datortomografi förfarande ett marsvin som ett exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer följande riktlinjer djurskötsel. Djuren inhystes i en anläggning godkänd av Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International. Alla experimentella procedurer har godkänts av National Institute of Allergy och infektionssjukdomar, Avdelningen för klinisk forskning, Animal Care och användning kommittén och var i enlighet med djurskyddslagen bestämmelser, Public Health Service politik, och vägledningen för vård och användning av försöksdjur rekommendationer.
1. Bered CT Scanner (på "kalla sidan")
- Konditionera X-Ray Tube
- Kontrollera att ingen anställd är i skanningsrummet och motivet tabellen är tom.
- Köra röret konditioneringsförfarande i enlighet med skannern tillverkarens specifikationer.
- Utföra Air Kalibrering
- Se till att inga föremål är i skanningsområdet. Utför luftkalibreringen förfarande i enlighet med skannern tillverkarens specifikationer. På många plattformar, är denna kalibrering auto- eller halvautomatiskt.
- Utför Kvalitetskontroll Scan (på "varma sidan")
- Slutföra inreseförfarandena ABSL-4 kostym laboratorium (beskrivs i detalj med hänvisning 5) med tillägg av ett extra steg. Om förfaranden innebär exponering för radioaktivt material, klippa en dosimeter till scrubs under skyddsdräkt. Vrid i dosimetern var 2 månader för beräkning av strålningsexponeringen.
- Placera CT huvudet och kroppen fantom, som är gjord av luft, vatten och teflon, i lämplig hållare på skanningsbordet.
- Utför Kvalitetskontroll Scan (på "kalla sidan")
- Från den kalla sidan, avancera fantom i mitten av hålet 6.
- Skaffa en skanning med laboratorium standardiserade kvalitetskontroll (QC) parametrar ENSure skannern är inom tillverkarens specifikationer.
- Utför QC datoriserad analys av bilder för att beräkna medelvärden och standardavvikelser av signalintensiteten inom områden av intresse centrerat över varje materialtyp (luft, vatten eller teflon) enligt tillverkarens protokoll.
- Meddela CM personal som CT-scannern är klar för användning.
- Verifiera informationen djur (identifikationsnummer, vikt, födelsedatum) med CM personal.
- Registrera ämnesinformation i patientdatabasen.
- Vid CT-scannern konsolen (på "kalla sidan"), tillgång till scannerns Radiology Information System (RIS). Kontrollera att RIS fylls med information om skannings schema.
- Välj det aktuella ämnet och demografi såsom identifikationsnummer, ålder, födelsedatum, och examen datum; då bör typen examen automatiskt fylla.
- ange föremål vikt manuellt.
- Välj korrekt subject orientering i CT gantry (t.ex. huvudet först, fötter första, liggande, liggande).
2. Förbered Arbets områden i ABSL-4 Suit Laboratory
- Förbered klass II biosäkerhet skåp (BSC) eller utsugsbord i djurordningen rummet. Slå på BSC (eller utsugsbord) minst 10 min före användning.
- Rengör och desinficera inre ytorna av BSC eller den övre ytan av den utsugsbordet med hjälp av ett godkänt desinfektionsmedel, såsom 5% dual kvartärt ammonium (n-alkyl- dimetylbensyl-ammoniumklorid, n-alkyl-dimetyl etyl bensyl-ammoniumklorid) desinfektionslösning. Spraya inre ytorna av BSC eller den övre ytan av den utsugsbordet och torka ytorna torra efter 10 min kontakttid. Spraya och torka ytor med 70% etanol för att avlägsna återstående desinfektionsmedel.
- Plats utrustning och förnödenheter som behövs i BSC eller utsugsbord, inklusive anestesi induktions rutan och djurhantering handskar. ol>
- Förbered CT Scanner säng.
- Ställt upp djuret hållaranordningen på CT-säng.
- Ställ upp vitala övervaka att upptäcka hjärtfrekvens och syremättnad. Om skanning session är längre än 10 minuter, kontrollera temperaturen.
- Förbered anestesiapparaten.
- Kontrollera isofluran volymen i förångaren och tillsätt mer isofluran om det behövs.
- Utför en täthetskontroll av tryckanestesiandningskretsen med syre, kontroll av flytt gas, och visuellt inspektera anestesiapparaten för läckage 1.
- Om en läcka upptäcks, bestämma källan, rätta till problemet, och utför en uppföljande läckagetest för att kontrollera rättelser korrekt sätt.
- Väg engångs rensning kapsel som fångar avfall narkosgas. Om kapseln är ≥50 g över den ursprungliga vikten av kapseln, byt behållare 7.
- Överför Cage Housing Guinea Pig från en av de Gnagare Holding rum intill Imaging Suite i klass II BSC.
- Kontrollera djurets ID.
- Ta buren kort och hålla med djuret.
- Öppna locket till buren och don djur skyddande läderhandskar under de positiva tryck kostym handskar. plocka försiktigt upp marsvin, placera djur i anestesi induktion rutan och täcka lådan med locket.
- Ta bort anestesi induktions låda som innehåller djuret från klass II BSC och placera den på en transportvagn.
- Med användning av vagnen, ta djuret till CT-scannern rummet.
- I CT-scanner rummet, omedelbart ansluta eliminerings kapseln och anestesiapparaten till induktions rutan. Slå på syrgasen till induktions rutan och ställa förångaren till leveer 4% isofluran för initial induktion av anestesi 8.
- Övervaka djuret under anestesi induktion för adekvat anestesidjup (t.ex. svarar på yttre stimuli, muskeltonus, stabil andnings och hjärtfrekvens) 8.
- Stäng av anestesi till induktions rutan när marsvin helt bedövad.
4. Ordna förbehåll på Imaging säng i CT Scanner (på "varma sidan")
- Ta sövd Guinea Pig från induktions Box och Placera på Imaging säng.
- Placera marsvin på anläggningen kudde i en liggande ställning.
- Applicera oftalmologiska salva i båda ögonen för att skydda hornhinnans epitel från att torka ut.
- Administrera Underhåll isoflurananestesi.
- Placera noskonen på marsvin och slå på gas för att leverera ett L / min av syre till noskonen 8.
- Ställ förångaren för att leverera 2-3% avisofluran till marsvin via noskonen.
- När ämnet har nått den önskade plan av anestesi (ingen rörelse, ~ 60 andetag per minut), minska förångaren inställning att leverera 1,0-1,5% av isofluran för underhåll av anestesi.
- Övervaka vitala tecken, inklusive kroppstemperatur, puls och andningsfrekvens. Om andningsfrekvensen börjar accelerera eller bromsa, öka eller minska procent av isofluran, respektive 9.
- Tillhandahålla en ytterligare värmekälla för att upprätthålla marsvinskroppstemperatur mellan 37 och 39 ° C, om så är nödvändigt, beroende på den förväntade längden av datainsamling och anestesidjupet bibehållas 8,9.
- Fäst ett plasthölje över toppen av innehavet kudden.
- Avancera imaging bädden in inneslutningsröret.
5. Ställa in bild synfält
- Aktivera lasersystemet (imaging personal) på "kalla sidan" av CT scAnner utrymme att placera marsvin för datortomografi. Använd tabellen "i" och "ut" för att täcka anatomin av intresse under laser hårkorset.
- För att ställa in synfältet använder laser för att ställa in startpunkten över anatomin av intresse.
- Kontakta CM personal på "varma sidan" för att placera en ledande skärm mellan sig och CT-scannern.
6. få bilder
- Förvärva undersökning scan för skiva placering för CT studiebilder enligt tillverkarens protokoll.
- Föreskriv slice placering för CT studiebilder på undersökningsbilder.
- Samordna med "hot-side" personal om kontrastinjektion ska användas.
- Förvärva studie skanningen enligt tillverkarens protokoll.
- Rekonstruera CT-bilder på skannern konsolen enligt tillverkarens protokoll.
- Skicka bilder till en PACS. Utför ytterligare kvalitativa och quantitative analyser från denna arkiveringssystem enligt tillverkarens protokoll.
7. Post-scan Recovery
- Överför marsvin från skannern till en ren microisolator bur med mat och godsaker.
- Med hjälp av vagnen, transportera bur med djur tillbaka till sitt bostadsområde.
- Övervaka djuret tills den är helt återhämtat sig från anestesi.
- När återhämtat sig helt tillbaka buren till den högeffektiva partiklar luft (HEPA) filtrerat ventilerade ställningar.
8. Desinficering av Scanner Bay och utrustning
- Desinficera skannern bay area (t.ex. ytor som var i direkt kontakt med djuret, skannern, scanner rummet golvet, dörrhandtag) med en 5% dubbel kvartar ammonium lösning under en kontakttid av 10 minuter.
- Sköljytorna med en 70% etanollösning efter en 10 min exponering för dubbla kvartar ammonium-lösning.
- Torka objekt som inte kan sprutas direktmed dubbla kvartärt ammonium-lösning (känslig elektronisk utrustning) med en dual-kvatemär-ammonium-mättad trasa följt av en etanol-mättad duk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strikt följa alla säkerhetsföreskrifter och standardrutiner för djurhantering är viktigt för att arbeta på ett säkert sätt i en ABSL-4 laboratorium. Överföra smittade djur inom induktions rutan från djuret förfarande rummet till bildsvit minimerar risken för kontaminering av gemensamma korridorer. Genom att följa de förfaranden som krävs har inga laboratorieförvärvade infektioner eller korskontaminering av djur ämnen noterats under utförande ABSL-4 forskning vid IRF-Fredrik.
ABSL-4 virala patogener kan inducera lungrelaterade sjukdomar 10,11, och CT är ett värdefullt verktyg för att övervaka sjukdomsprogression i djurmodeller av infektion. CT-bilder skapas från absorptionen av röntgenstrålning in i vävnader, och imaging experiment kan utföras relativt snabbt, vilket minimerar mängden av anestesi krävs. I CT, desto större Density av objektet avbildas, såsom ben, desto ljusare objektet visas (Figur 2). Densitet av vävnader organ tenderar att vara av mellan intensitet (grå), medan luftfyllda vävnader såsom friska lungor, visas svart. CT förvärvar flera röntgenbilder över en 360 ° vy som rekonstrueras i en 3-dimensionell bild av kroppen. För större avgränsning mellan organ och infektionssjukdomar relaterade sjukdomar, kan intravenösa kontrastmedel användas.
Figur 1:. Hög inneslutning utformning av avbildningsmetoder vid IRF-Frederick konstruktion separerar bildsvit i "heta" och "kalla" sidor. Speciellt utformad rören sträcker sig den höga inneslutningsutrymmet av "varma sidan" i hålen på varje skanner på "kalla sidan". Imaging forskare och tekniker driva skannrar från4;. Kalla sidan "medan jämförande medicin (CM) personal handtag och övervaka djur på" varma sidan " Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. CT bild av överkroppen av ett marsvin röntgen absorption är större i ben, därför ben (A) visas ljusstarkaste i bilden, och luft (B, lungvävnad) visas mörkaste och mjukvävnad (C: hjärta, D: lever). visas mellan i kontrast (a) BSL-4 virala patogener inducera lungrelaterade patologi, vilket gör CT ett värdefullt verktyg för att övervaka sjukdomsprogression i djurmodeller av infektion klicka hennee för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare artiklar i denna serie har betonat omfattande utbildning, uppmärksamhet på detaljer, säkerhetsrutiner, och ytterligare tekniska kontroller som krävs för att arbeta säkert i en maximal inneslutningslaboratorium 12,13. Utför arbete på ett säkert sätt är högsta prioritet i dessa laboratorier. Denna filosofi är ännu viktigare när man arbetar med levande djur på grund av ytterligare faror som risken för infekterade djur att orsaka bett eller repor eller för att generera aerosoler 7. Dessa procedurer betonar säker hantering och transport av djur från djurrummet till bild rum. Djur manipulationer och övervakning under narkos är visat sig ge betraktaren en realistisk skildring av uppmärksamhet på detaljer och säkerhetsöverväganden som krävs när du arbetar i en ABSL-4 laboratorium.
Vi beskriver ett protokoll för att utföra icke-invasiv medicinsk bildbehandling i en ABSL-4 laboratorium som använder en datortomografi av ett marsvinsom ett exempel. Flera steg är avgörande för framgångsrik avbildning i BSL-4 laboratorium. Den första kritiska steget innefattar att verifiera att säkerhets checklistor är klara att säkerställa att alla säkerhetssystem fungerar innan inträde i labbet 5. Personalen måste följa korrekta förfaranden infarts- och utfarts att säkerställa att de fungerar på ett säkert sätt i BSL-4 laboratorium. Den andra kritiska steget är att kontrollera att personalen är antingen inte i skanningsrummet eller om de är bakom en bärbar blyskydd under konditionering av röntgenröret och eventuella efterföljande genomsökningar. Det är viktigt att fastställa att CT-scannern är klar och fungerar ordentligt innan anesthetizing och förbereda djur för avbildning. Nästa viktiga steg är att utföra en kvalitetskontroll genomsökning med ett lämpligt fantom och meddela djurtekniker när CT-scannern är i drift och klar för användning. Tydlig och effektiv kommunikation är också viktigt att utföra avbildningsprotokoll som djurhantering personal är fysiskt separated från avbildnings tekniker som driver skannrar på "kalla sidan".
Medicinsk bildbehandling i en BSL-4 laboratorium är en utmanande procedur som samtliga djurhanteringsprocedurer måste göras samtidigt bär det positiva trycket kostym och flera par handskar, inklusive tunga kostym handskar. Grundläggande djur hanteringsrutiner modifieras för att passa säkerhetsöverväganden i BSL-4 laboratorium. Hantering av vakna djur minimeras och modifieras för att minska risken för bett eller repor. Till exempel, läder arbetshandskar är slitna att skydda passar handskar när plocka upp vakna marsvin och andra större gnagare. Möss endast hanteras med pincett och måste bedövas innan scruffing dem för intraperitoneala injektioner. Injektionsteknik kan behöva modifieras för att säkerställa en högre grad av säkerhet. Pincett och / eller fasthållningsanordningar används för att utföra injektioner i gnagare istället för att använda återhållsamhet handen ensam. Komplexiteten och tid som behövs för att Perform avbildning beror på flera faktorer, bland annat modalitet valda och de arter som används. Begränsningar för att utföra CT inkluderar svårigheten att administrera kontrastmedel för vissa laboratoriedjurarter. Marsvin, i synnerhet inte har lättillgängliga vener för att administrera ett kontrastmedel intravenöst. Svårighet med denna administration förvärras av svårigheten att finmotorik manipulation iklädd personlig skyddsutrustning. Dessutom måste tidpunkten för kontrastmedlet injektioner samordnas med personal på "kalla sidan" som arbetar skannern.
Den unika designen av bildanläggningen skapar utmaningar som kräver ändringar av avbildningstekniker. En utmaning var svårigheten med kommunikation på grund av den fysiska separationen av avbildnings tekniker som kör scanning utrustning och djurtekniker som hanterar och övervakar djuren. Bluetooth-telefoner med headsets bärs inutikostym används för att kommunicera med avbildnings tekniker för att samordna och utföra genomsökningar. Om denna kommunikationsmetod misslyckas, kan handskrivna meddelande på whiteboardtavlor visas genom laboratoriefönster. Utformningen av varje avbildningsmodalitet innehåller en särskild rör som sträcker sig den höga inneslutningsanläggning in i hålet i varje scanner. Efter varje avbildnings ämne är placerad på ett avbildnings säng, ämnena är ett större avstånd från och mindre synliga för de tekniker som övervakar dem medan under anestesi. Längre anestesi kretsar, övervakning kablar och infusionsledningar krävs i denna design.
IRF-Frederick har förmågan att utföra biomedicinsk avbildning i en mängd av försöksdjur från möss till icke-humana primater. CT kan användas för att övervaka sjukdomsförloppet i en mängd olika djurmodeller av infektionssjukdomar. Utvärdering av effekten av potentiella terapeutiska ingrepp, inklusive vacciner, och identifiera biomarkörer för diseaSE processer är framtida tillämpningar av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| CT scanner | Philips Healthcare | ||
| CT phantom | Philips Healthcare | ||
| Isovue-300 (CT contrast reagent) | Bracco Diagnostics | NDC 0270-1315-30 | |
| Ventilated rack | Lab Products | ||
| Micro-isolator cage | Lab Products | ||
| Biosafety cabinet | Nuaire | ||
| Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
| Anesthesia induction box | VetEquip | ||
| Anesthesia mask | Henry Schein | ||
| Isoflurane | Henry Schein | ||
| Waste gas scavenging canister | Fisher | F/AIR | |
| Holding cushion | |||
| Ophthalmic ointment | |||
| Vital signs monitor | Bionet | BM3Vet | |
| Mobile phone | Spectralink | 8440 | |
| Blue Tooth ear piece | |||
| Wireless access points | |||
| Sperian positive-pressure suit | Honeywell Safety Products | BSL 4-2 | |
| Outer suit gloves (latex, Ansell Canners and Handlers) | Fisher | 19-019-601 | |
| Outer suit gloves (nitrile/rubber, MAPA) | Fisher | 2MYU1 | |
| Scrubs | Cintas | 60975/60976 | |
| Socks | Cintas | 944 | |
| Duct tape | Pack-N-Tape | 51131069695 | |
| Towels | Cintas | 2720 | |
| Zip lube | Amazon | B000GKBEJA |
References
- Jahrling, P. B., et al. The NIAID Integrated Research Facility at Frederick, Maryland: a unique international resource to facilitate medical countermeasure development for BSL-4 pathogens. Pathog Dis. , (2014).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. , Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. . Accessed Sept. 4, 2014 (2009) http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/. (2009).
- Janosko, K., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 1. Laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. , (2016).
- Diagnostic Radiology Committee Task Force on CT Scanner Phantoms. Phantoms for evaluation and quality assurance of CT scanners. , American Association of Physicists in Medicine. Chicago, IL. (1977).
- Collins, B. ACUP 712.01 Waste anesthetic gas scavenging systems. Institutional Animal Care and Use Committee. , Cornell University. Ithaca, NY. Available from: http://www.research.cornell.edu/care/documents/ACUPs/ACUP712.pdf (2013).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
- Office of the Press Secretary. Executive order 13546. Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. The White House. , Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
- Escaffre, O., Borisevich, V., Rockx, B. Pathogenesis of Hendra and Nipah virus infection in humans. J Infect Dev Ctries. 7, 308-311 (2013).
- Sueblinvong, V., et al. Critical care for multiple organ failure secondary to Ebola virus disease in the United States. Crit Care Med. , (2015).
- Mazur, S., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 2. General practices. J Vis Exp. , (2016).
- Bohannon, J. K., et al. Safety precautions and operating procedures in an (A)BSL-4 laboratory: 3. Aerobiology. J Vis Exp. , (2016).
