Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

Published: February 5, 2016 doi: 10.3791/53604
Automatic Translation
1,2,3, 2, 2, 1
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

Protocol

1. H2B-PSmOrange مرنا في المختبر النسخ ومرنا تنقية

  1. خطي H2B-PSmOrange تحتوي على pCS2 + البلازميد باستخدام انزيم التقييد نوتي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية باستخدام الحماية المناسبة مثل القفازات ومعطف المختبر لمنع التلوث مرنا والتدهور.
  2. تنقية الحمض النووي خطي باستخدام PCR عدة تنقية أو الفينول كلوروفورم الأساليب القائمة وفقا لبروتوكولات الصانعين.
  3. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي القالب خطي لSP6 مرنا النسخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. إزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 1.0 U ريبونوكلياز مجانا DNaseI لمدة 10-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. تنظيف مرنا باستخدام الحمض النووي الريبي تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. لزيادة نقاء مرنا والتركيز، ويعجل مرنا عن طريق إضافة 6 ميكرولتر خلات الصوديوم (3.0 M، ودرجة الحموضة 5.2) و 150 ميكرولتر 96٪ من الإيثانول. احتضان محل ixed في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 24 ساعة.
  7. جمع مرنا من خلال الدوران الحل في 18.407 x ج لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل السائل و resuspend مرنا في 150 ميكرولتر الايثانول 70٪. خلط وأجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية. تجاهل السائل، تجفيف بيليه لمدة 5 دقائق على الجليد و resuspend مرنا في 20 عالى النقاء ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا.
  8. تقييم التركيز والنقاء من مرنا من قبل قياس الضوئية من التخفيف 1: مرنا 100 (1 ميكرولتر مرنا في 99 ميكرولتر عالى النقاء ريبونوكلياز المياه مجانا).
  9. للتخزين على المدى القصير، والحفاظ على حل مرنا في -20 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على مرنا في -80 درجة مئوية.

2. H2B-PSmOrange مرنا حقن مكروي في الزرد الأجنة

  1. إعداد التزاوج أزواج الليلة قبل الحقن باستخدام TG (foxD3: GFP)؛ TG (FLH: GFP) الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة (أو أي GFP الأسماك المعدلة وراثيا أخرى). ترك الأسماك مفصولة وضع فاصلبينهما للسيطرة على وقت التزاوج.
  2. إزالة فاصل في الصباح الحقن وترك زميله الأسماك لمدة 20 دقيقة.
  3. أثناء التزاوج الوقت، يخفف من H2B-PSmOrange مرنا إلى تركيز النهائي من 130 جزء من الغرام / NL (في ريبونوكلياز المياه مجانا) ونقل 6 ميكرولتر حل الحقن في شعري حقن مكروي باستخدام طرف microloader. تحقق من حجم الحقن مع شريحة زجاجية معايرة. ضبط ضغط الحقن لحقن 2 حل مرنا نيكولا لانغ (260 خريج).
  4. جمع البيض في والبلاستيك طبق بتري معقمة تحتوي على 1X الأجنة (E3) متوسطة.
  5. نقل 20-30 الأجنة إلى طبق الحقن باستخدام ماصة باستور البلاستيك.
  6. حقن 2 مرنا نيكولا لانغ تحتوي على حل في الخلية أو أقل بقليل من الخلايا في صفار البيض في مرحلة خلية واحدة (11).
  7. نقل الأجنة المحقونة في طبق بتري تحتوي على 1X E3 المتوسطة، وإزالة الأجنة عادة وضع غير مخصبة أو لا، وتنمو لهم عند 28 درجة مئوية.
    ملاحظة: حماية ضوء سو الأجنة غير مطلوب في كافة مراحل التجربة.
  8. رفع الأجنة الزرد في 1X E3 المتوسطة وإضافة 0.2 ملي PTU (1-فينيل-2 ثيوريا) بعد المعيدة لمنع تصبغ. تغيير متوسطة مرتين في اليوم الواحد للحد من خطر التلوث الجرثومي.

3. الأجنة تضمين

  1. حدد GFP (الخضراء) وPSmOrange (البرتقالي / الأحمر) الأجنة، معربا عن المشترك باستخدام مجهر مجهر مجهزة مصباح مضان والمرشحات الانبعاثات المناسبة. نقل الأجنة الإيجابية في العقيمة طبق بتري تحتوي على 1X E3 المتوسطة.
  2. الأجنة Dechorionate تحت مجهر تشريحي باستخدام ملقط 12.
  3. نقل جنين واحد في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1.0 مل من قبل تحسنت 1.0٪ انصهار منخفضة الاغاروز (LMA) التي أعدت في الماء عالى النقاء باستخدام ماصة قطع رأس (P200). ملاحظة: قم بتدفئة LMA إلى 80 درجة مئوية ويبرد لمدة 3-5 دقيقة في RT قبل تضمين الجنين.
  4. نقل الأجنة في 150 ميكرولتر LMA إلىغرف ساترة وضبط التوجه الجنين، مثل الجانب الظهري أسفل في تجربة وصفها ليزر متحد البؤر مجهر المسح A1R مقلوب + (أو أي المجهر مناسبة أخرى)، وذلك باستخدام معلومات سرية البلاستيك على ما يرام. عندما LMA هو بلمرة، وملء الغرفة مع أسماك المياه التي تحتوي على 0.2 ملي PTU و 0.02٪ إيثيل 3-أمينوبنزوات methansulfonate (تريكين) للتخدير.
  5. قبل التصوير العينة، وانتظر 15 دقيقة للتأكد من تأثير تريكين. التخدير يمنع حركات الجنين، والتي يمكن رصدها باستخدام مجهر تشريحي مجهزة مع إضاءة brightfield.
    ملاحظة: غرف يمكن إعادة استخدامها مرتين.

4. PSmOrange Photoconversion

  1. وضع العينة تحت المجهر متحد البؤر ومسح العينة لتحديد المنطقة لphotoconvert باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر لتصوير GFP وPSmOrange على التوالي.
    ملاحظة: استخدم مقلوب ليزر متحد البؤر مجهر المسح A1R + على ستا مقلوبجنرال الكتريك TiEcontrolled بواسطة برنامج المجهر التصوير ومجهزة 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر لphotoconversion والتصوير. ومع ذلك، بالتأكيد لا يقتصر التطبيق لهذا المجهر طالما هي خطوط ليزر للتحويل والتصوير المتاحة.
    1. وضع هدف الهواء 20X في مكانه (NA: 0.75، WD: 1.0 مم؛ فوف: 0.64 X 0.64 مم).
    2. استخدام الإعدادات المجهر التالية للكشف عن البروتين PSmOrange قبل photoconversion: 561 الليزر نانومتر، 0.74 ميغاواط قياس في الطائرة التركيز فوق الهدف.
      ملاحظة: هذا يتوافق مع 40٪ على هذا النظام (قياس في الطائرة التركيز هو السبيل الوحيد لتحديد قوة فعالة). ضبط قوة الليزر وفقا لاحتياجات التجريبية كما كفاءة الحقن H2B-PSmOrange يمكن أن تختلف.
    3. إضافة عوامل التكبير لتسليط الضوء على مجال الاهتمام. أعلى تكبير تقليل الوقت الحصول على الصور، وبالتالي الضيائية.
  2. الحصول على كومة ض تغطي هيكلالصورة ذات الاهتمام باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر في وضع تسلسلي (وضع خط 1-> 4). إصلاح خطوة ض بين 1.0 و 2.0 ميكرون. متوسط ​​خط وتردد المسح يمكن استخدامها لتحسين جودة الصورة.
  3. مسح العينة وتحديد منطقة (ROI) أداة الفائدة لتسليط الضوء على المنطقة لphotoconvert. إصلاح العائد على الاستثمار مع منطقة التحفيز. حدد الوحدة النمطية صور التنشيط / التبييض، وتفعيل ليزر 488 نانومتر عن طريق التحقق من مربع منها، وتعيين ليزر 488 نانومتر إلى 80٪ (قوة الليزر 1 ميغاواط قياس في الهدف). ضبط سرعة المسح الضوئي إلى 0.5 ثانية / الإطار.
  4. فتح الأداة المساعدة photoconversion (ND تحفيز) وتحديد الإعدادات photoconversion.
    1. انقر على الأمر "إضافة" لتحديد بروتوكول photoconversion.
    2. ضبط "المرحلة" 1 في "اكتساب / تحفيز" القائمة على "شراء" وتشير إلى أن اكتسب عدد من الصور قبل photoconversion في القائمة "الحلقات".
    3. ضبط "المرحلة" 2 "لسانimulation "وأدخل عدد من الأحداث التحفيز التي يتعين القيام بها.
    4. ضبط "المرحلة" 3 كما هو موضح ل "المرحلة" 1. اختياريا، اضافة الى وجود الانتظار "المرحلة" بعد "المرحلة" 2 عن طريق إدخال وقت للانتظار قبل الجولة الأخيرة من التقاط صور.
    5. مرة واحدة يتم تعيين كافة المعلمات، تطبيق الإعداد التحفيز وتشغيل photoconversion.
      ملاحظة: قوة الليزر، وتواتر المسح الضوئي وعدد التكرارات لكل جولة من photoconversion يمكن أن تختلف وتختلف من جنين إلى الجنين. إعداد لبدء مع هو مبين في الجدول رقم 1.
  5. الحصول على ض المكدس النهائي باستخدام 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر تطبيق الإعدادات على النحو الوارد أعلاه. تعيين ليزر 640 نانومتر لتصور PSmOrange تحويلها باستخدام قوة الليزر عالية (تصل إلى 4.5 ميغاواط).

5. إلغاء التحميل الأجنة من LMA

  1. إزالة الجنين تحتوي على غرفة من المجهر. بعناية إزالة الجنين من ش الاغاروزالغناء ملقط.
  2. نقل الجنين الى بلاستيكية معقمة طبق بتري جديد أو إلى تعقيم 6 جيدا لوحة تحتوي على 1X E3 و 0.2 ملي PTU. احتضان الجنين عند 28 درجة مئوية حتى المرحلة المطلوبة للتنمية.

6. تحليل مصير Photoconverted PSmOrange البروتين معربا عن الخلايا

  1. إعادة تضمين الجنين كما هو موضح تحت نقاط 3.3 و 3.4.
  2. وضع العينة تحت المجهر متحد البؤر ومسح العينة لتحديد الخلايا photoconverted (640 نانومتر) في بنية GFP المعدلة وراثيا من الفائدة (488 نانومتر).
  3. الحصول على كومة ض تغطي الهياكل ذات الاهتمام باستخدام 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر في وضع تسلسلي (وضع خط 1-> 4). إصلاح خطوة ض بين 1.0 و 2.0 ميكرون. متوسط ​​خط وتردد المسح يمكن استخدامها لتحسين جودة الصورة.
  4. استخدم إحدى الطرق التالية لتحديد الخلايا التي GFP شارك السريع والبروتين photoconverted.
    1. حسب الطلب التلقائي فيجي صورةJ 3 ماكرو
      1. لف كومة الأصلي باستخدام "GaussianBlur" المساعد (→ عملية → مرشحات → GaussianBlur) وطرح رزمة سلسة من الأصل باستخدام "صورة حاسبة" المساعد (→ عملية → صورة حاسبة). استخدم هذه الخطوة لتصور هياكل الفائدة وتقليل الوقت الحسابية للتحليل.
      2. تطبيق عتبات محددة لقنوات خضراء وبعيدة الحمراء من أجل تسليط الضوء على الخلايا photoconverted (→ صورة → ضبط → عتبة). استخدام أداة "تحليل الجزيئات" للكشف عن المناطق عتبة مع إعداد مناسب (→ تحليل → تحليل الجزيئات).
      3. فتح "صورة حاسبة" المساعد وعرض رويس تداخل في القناة الخضراء وحتى الحمراء في الصفراء (→ عملية → حاسبة صورة).
    2. برامج التصوير المجهر لتقييم بيانات 3D
      1. عرض المكدس في3D باستخدام الخيار إظهار حجم (→ 3D التصور القائمة → مشاهدة حجم عرض). استخدام واجهة رسومية لتحديد قنوات خضراء وحمراء وبعيدا الحمراء، وضبط السطوع والتباين واقتصاص كومة 3D لتسليط الضوء على منطقة photoconverted (الشكل 1).
        ملاحظة: أساليب مماثلة لتحليل هي البيانات المتاحة في معظم البرامج المشتركة لتحليل الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويوضح الشكل 1 مثالا للنظام PSmOrange photoconversion. مجمع الصنوبرية هو هيكل محفوظ في الدماغ البيني الظهرية الفقاريات. كما هو الحال في كثير من الفقاريات الأخرى، ويتكون هذا المجمع من الجهاز الصنوبرية في وسط الدماغ البيني والخلايا صنيبري اليسرى جانب واحد. وأظهرت التجارب uncaging أنيقة ولكن تستغرق وقتا طويلا أن الخلايا صنيبري تنشأ في الجزء الأمامي من الجهاز الصنوبرية (13). في TG (foxD3: GFP)؛ TG (FLH: GFP) الأجنة وراثيا، وصفت الخلايا على حد سواء الصنوبرية وصنيبري خلال التنمية. لتقييم مدى ملاءمة النظام PSmOrange استخدمنا هذه الأجنة لإنتاج التنمية المعقدة الصنوبرية عنها. 260 مرنا خريج ترميز شكل النووي PSmOrange، H2B-PSmOrange، تم حقنه في مرحلة واحدة الخلية الأجنة وراثيا مزدوجة للتعبير عن البروتين في كل نواة الخلية. حضنت الأجنة المحقونة عند 28 درجة مئوية حتى 24 ساعة بعد fertilizatأيون (HPF)، التي اختيرت لGFP وقوية التعبير H2B-PSmOrange وجزءا لا يتجزأ من LMA في نظام ساترة تشامبيريد مع الجانب الظهري الموجهة نحو القاع. وضعت العينة تحت ليزر متحد البؤر المجهر المقلوب التي تسيطر عليها البرنامج المجهر التصوير ومجهزة 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر الليزر وهدف الهواء 20X لphotoconversion والتتبع. تم photoconverted اثنين من مجموعات الخلايا في الجزء الأمامي من الغدة الصنوبرية وتصويرها على الفور (الشكل 1A - F). يمكن تصور الخلايا photoconverted باستخدام الليزر 640 نانومتر (أحمر بعيد - الشكل 1C)، ولكن ليس مع نانومتر ليزر 561 (برتقالي / أحمر - 1B الشكل). كان في البداية تخفيض التعبير GFP في هذه الخلايا أيضا بسبب photobleaching من (الشكل 1A، 1D، 1F). في 52 HPF تم الكشف عن GFP وH2B-PSmOrange في خلايا البروتين معربا عن photoconverted H2B-PSmOrange (الشكل 1A '- F'). في الواقع، وعدد قليل من هذه الخلايا شكلت صنيبري على الجانب الأيسر من الدماغ (النصال في الشكل 1A '- F'). هذه النتيجة تتفق مع التقارير السابقة عن أصل خلية مجاور للصنوبرية ويظهر انطباق تقنية PSmOrange في جنين الفقاريات الحية.

الشكل 1
. الشكل 1. تحديد أصل الخلية مجاور للصنوبرية باستخدام نظام PSmOrange photoconversion في العيش الأجنة الزرد (A - F ') وجهات النظر الظهرية مع الأمامية إلى الأعلى تركز على الدماغ البيني الظهرية من TG (foxD3: GFP)؛ TG (FLH: GFP) الجنين وراثيا تسليط الضوء على الصنوبرية (P) والخلايا صنيبري (ص) في (A - F) 26 HPF مباشرة بعد photoconversion و(A '- F & # 39؛) 26 ساعة في وقت لاحق في 52 HPF. تم حقن الجنين مع مرنا ترميز H2B-PSmOrange. وتظهر الصور اعادة البناء 3D. تعبير (A، A ') GFP المعدلة وراثيا، (B، B') لا يتم تحويل H2B-PSmOrange (القناة الحمراء) و (C، C ') بعد photoconversion (قناة الآن الحمراء). وتبرز الدوائر منقط أبيض مجال photoconversion، الذي يخلو من البرتقال / أحمر مضان. (D، D ') دمج جميع القنوات الثلاث (الأخضر والأحمر، وبعيدا الحمراء)، (E، E') قنوات الأحمر وبعيدة الحمراء و (F، F ') قنوات خضراء وبعيدة الحمراء. (A'-F ') السهام البيضاء تسليط الضوء على موقع خلايا صنيبري، والتي تظهر الأخضر والبرتقالي / مضان أحمر وبعيدة الحمراء. يتم عرض (AF ') شريط النطاق في الزاوية السفلية اليمنى من كل صورة.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مرحلة عدد من حلقة الليزر النشطة
اكساب 1 دورة 488 نانومتر، 561 نانومتر، 640 نانومتر
تنبيه 15-30 دورات 488 نانومتر
إنضاج 1 دقيقة #
اكساب 1 دورة 488 نانومتر، 561 نانومتر، 640 نانومتر

الجدول 1: شروط H2B-PSmOrange photoconversion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد ساعدت الأجنة وراثيا تحمل صحفيين الفلورسنت أساسا لفهم التطور الجنيني. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة ضرورية لالمروجين لتسهيل التصور محدد هياكل معينة. في غيابهم، يعتمد الباحثون على تقنيات مثل photoconversion من البروتينات الفلورية لمعرفة المزيد عن أصل وتطور هيكلها من الفائدة. وهذا بدوره هو شرط أساسي لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في تنميتها. التقدم التقني في مجال الزرد يسمح الآن لتحل محل FP في خطوط المعدلة وراثيا مع، على سبيل المثال، والبروتينات photoconvertible باستخدام كريسبر-Cas9 تدق توسط في نهج 14،15. ومع ذلك، هذه التقنية تستغرق وقتا طويلا نسبيا وغير ناجحة دائما. في المقابل، فإن تطبيق بتواجد مطلق أعرب H2B-PSmOrange في GFP وربما غيرها من الخلفيات المعدلة وراثيا هو أسلوب مستقيم إلى الأمام لمتابعة الخلايا من خلال متطوير bryonic.

على سبيل المثال، أصل العناني بطني الزرد، جزء واحد من نظام التوصيل العصبي محفوظ في الدماغ البيني الظهرية من الفقاريات، وكان بعيد المنال حتى وقت قريب، وبالتالي تم الكشف عن أي سلسلة الوراثية الكامنة وراء تطورها. باستخدام نظام PSmOrange وتحليل الوقت الفاصل على المدى الطويل لمتابعة الخلايا المهاجرة، ونحن يمكن أن تظهر أنه على عكس النوى العنانية الظهرية، التي تنشأ اليسار واليمين المتاخمة للالكردوس، الخلايا العصبية العنانية بطني تطوير الخلفي لهذه المنطقة في المهاد 3. سمحت هذه المعرفة لنا بعد ذلك للتعرف على وظيفة حاسمة من WNT الكنسي يشير الجين المصب Tcf7l2 للتنمية الخلايا العصبية العنانية البطنية.

تطبيق نظام PSmOrange photoconvertible بسيط وسريع ولديه ميزة على البروتينات photoactivatible أن الأجنة يمكن اختيار للتعبير البروتين قوي قبل الإضاءة. الاصطناعية السيديتم حقن NA الترميز لH2B-PSmOrange في الجنين-GFP المعدلة وراثيا للتعبير عن بتواجد مطلق البروتين الفلوري البرتقال في كل نواة. ونحن لم تواجه أي آثار جانبية على حقن والبروتين هو مستقر لمدة 96 ساعة على الأقل. ثم يتم photoconverted البروتين في الخلايا GFP المعدلة وراثيا في العائد على الاستثمار باستخدام 488 نانومتر الإثارة الليزر ويمكن تحليل الجنين للبروتين فلوري الآن بعيدة الحمراء التي تحتوي على الخلايا داخل اللاحقة ما يقرب من 48 ساعة. فمن الأهمية بمكان لمراقبة photoconversion ناجحة كشروط يمكن أن تختلف تبعا لمرحلة النمو من الجنين والأنسجة المستهدفة. البرنامج المجهر التصوير يكتسب صورة من كل قناة (الأخضر والأحمر وبعيدة الحمراء) قبل وبعد photoconversion. يمكن تقييم كفاءة photoconversion قياس مضان كثافة متوسط ​​في العائد على الاستثمار بين قنوات مختلفة قبل وبعد photoconversion. إذا لم يتم الكشف عن مضان بعيدة الحمراء مباشرة بعد إعلان photoconversionجولات المشروط من photoconversion يجب تطبيقها. تبيض GFP هو شائع بعد photoconversion. ومع ذلك، فإن الترجمة المستمرة للبروتين فلوري المعدلة وراثيا يتغلب على هذه المشكلة في حوالي 2 ساعة.

ماكرو العرف بالنسبة فيجي يماغيج للتخفيف من تحديد خلايا شارك في التعبير عن بروتين photoconverted وGFP المعدلة وراثيا هو متاح 3. إنشاء المستقبلي للخطوط المعدلة وراثيا مستقرة معربا عن H2B-PSmOrange وتبسيط هذا الإجراء. كما أنه سيسهل تحليل الأحداث التنموية بعد 4 أيام بعد الإخصاب، والتي قد يكون لها قيمة فضول للبحث عن مجالات مثل تجديد الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع بين التعبير عن أمهات المعدلة وراثيا PSmOrange والوقت الفاصل بين التصوير 16 أن تكون أداة قوية للتحقيق في أحداث الهجرة خلية البداية قبل تكون المعيدة على مستوى خلية واحدة. ويمكن أن تشمل تطبيقات مزيد من تبادل للعلامة النووية H2B مع، وأو مثيل، GAP43 لتصور أغشية الخلايا ويحتمل أن تكون محاور في الجنين النامي.

واحد الحد من هذه التقنية هو أن البروتين اقحي يبدأ إلا أن أعرب عن بعد تكون المعيدة وبالتالي فهو لا ينطبق على تحليل العمليات تكون المعيدة. كما أن لديها للنظر أنه من الصعب إلى حد ما photoconvert البروتين في الخلايا الموجودة في عمق الجنين. يجب أن تتكيف إعدادات Photoconversion كقوة ليزر عالية ووقت التحفيز طويلة نسبيا اللازمة لphotoconversion قد يؤدي إلى تلف الأنسجة، الأمر الذي يتطلب رصد دقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR Purification Kit Qiagen 28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit Ambion AM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kit Qiagen 74204
Plastic Pasteur alpha laboratories LW4000
Original H2B-PSmOrange Plasmid Addgene 31920 The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet Microinjector Eppendorf 5247 000.013
Forceps (5 Inox) NeoLab 2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System  Nunc 155382
Nikon A1R+ Nikon GmbH Germany No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective  Nikon GmbH Germany No Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging No Number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
  12. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
  13. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  15. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 108، الزرد، الصنوبرية، photoconversion، وتتبع الخلية، PSmOrange، مضان، والتصوير، وCLSM،
تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beretta, C. A., Dross, N., Engel,… More

Beretta, C. A., Dross, N., Engel, U., Carl, M. Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System. J. Vis. Exp. (108), e53604, doi:10.3791/53604 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter