Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA Transcripción in vitro y de purificación de ARNm
- Linealizar el H2B-PSmOrange contiene pCS2 + plásmido usando la enzima de restricción NotI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Nota: Realice los siguientes pasos utilizando protecciones apropiadas, tales como guantes y bata de laboratorio para evitar la contaminación y la degradación del ARNm. - Se purifica el ADN linealizado utilizando un kit de purificación de los métodos basados en fenol-cloroformo o PCR de acuerdo con protocolos de los fabricantes.
- Usar 1 mg de ADN plantilla linealizado para Sp6-mRNA transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Eliminar el ADN mediante la adición de 1,0 U de RNasa libre de DNasa I durante 10-20 min a 37 ° C.
- Limpiar el ARNm utilizando una ARN kit de limpieza de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Para aumentar la pureza y la concentración de ARNm, precipitar el ARNm mediante la adición de acetato de 6 l de sodio (3,0 M, pH 5,2) y 150 l 96% de etanol. Incubar la msolución ixed a -20 ° C durante al menos 30 min y hasta 24 hr.
- Recoger el mRNA haciendo girar la solución a 18.407 xg durante 45 min a 4 ° C. Desechar el líquido y resuspender el ARNm en 150 l de 70% de etanol. Mezclar y centrifugar la solución para un 15 minutos adicionales a 4 ° C. Desechar el líquido, secar el sedimento durante 5 minutos en hielo y volver a suspender el ARNm en 20 ultrapura l RNasa libre de agua.
- Evaluar la concentración y la pureza del mRNA por medición fotométrica de una dilución 1: 100 de ARNm (ARNm 1 l en 99 l ultrapura RNasa libre de agua).
- Para el almacenamiento a corto plazo, mantener la solución de ARNm a -20 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener el ARNm a -80 ° C.
2.-H2B PSmOrange ARNm microinyección en embriones de pez cebra
- Configurar el apareamiento pares de la noche antes de la inyección utilizando tg (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) de pescado transgénico doble (o cualquier otro pez transgénico GFP). Deja a los peces separados por colocar un espaciadorentre ellos para controlar el tiempo de apareamiento.
- Retire el separador de la mañana de la inyección y dejar que el compañero de pescado durante 20 minutos.
- Durante el tiempo de apareamiento, diluir el ARNm H2B-PSmOrange a la concentración final de 130 pg / nl (en RNasa libre de agua) y la transferencia de 6 l de solución inyectable en un capilar de microinyección con una punta de microloader. Compruebe el volumen de inyección con un portaobjetos de vidrio calibrado. Ajustar la presión de inyección para inyectar solución 2 mRNA nl (260 pg).
- Recoger los huevos en una placa de Petri de plástico esterilizada que contiene embriones 1x (E3) medio.
- Transferir 20 a 30 embriones a un plato de inyección usando una pipeta de plástico pasteur.
- Inyectar 2 mRNA nl solución en la célula o justo por debajo de la celda que contiene en la yema en el estadio de una célula 11.
- Transferencia de embriones inyectados en una placa de Petri que contiene medio 1x E3, eliminan embriones fertilizados se desarrollan con normalidad o no crecen y ellos a 28 ° C.
Nota: Protección contra la luz of los embriones no se requiere durante todo el experimento. - Elevar embriones de pez cebra en medio 1x E3 y añadir PTU 0,2 mM (1-fenil-2 tiourea) después de la gastrulación para inhibir la pigmentación. Cambiar el medio dos veces por día para reducir al mínimo el peligro de contaminaciones bacterianas.
3. Incorporación de embriones
- Seleccione la GFP (verde) y PSmOrange co-expresión de los embriones (naranja / rojo) usando un microscopio binocular equipado con una lámpara de fluorescencia y filtros de emisión adecuadas. La transferencia de los embriones positivos en una placa de Petri estéril que contiene el medio 1x E3.
- Embriones Dechorionate bajo un microscopio estereoscópico con fórceps 12.
- Transferencia de un embrión en un tubo de 1,5 ml que contiene 1,0 ml de pre-calentado 1,0% de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) preparada en agua ultrapura mediante el uso de una pipeta de punta de corte (P200). Nota: Se calienta la LMA a 80 ° C y enfriar durante 3-5 minutos a temperatura ambiente antes de clavarse el embrión.
- Transferir el embrión en 150 l MLA en unacámaras cubreobjetos y ajustar la orientación del embrión, por ejemplo, el lado dorsal hacia abajo en el experimento descrito para la invertida láser confocal de barrido microscopio A1R + (o cualquier otro microscopio adecuado), usando una punta de plástico fino. Cuando la MLA se polimeriza, llenar la cámara con agua que contiene el pescado PTU 0,2 mM y 0,02% de acetato de 3-aminobenzoato metanosulfonato (Tricaína) para la anestesia.
- Antes de obtener imágenes de la muestra, esperar 15 minutos para determinar el efecto de Tricaína. La anestesia evita los movimientos de embriones, que pueden ser monitorizados mediante un microscopio estereoscópico equipado con iluminación de campo claro.
Nota: Las cámaras se pueden reutilizar dos veces.
4. PSmOrange Fotoconversión
- Colocar la muestra bajo el microscopio confocal y escanear la muestra para identificar el área a photoconvert usando 488 nm y 561 nm láser para la formación de imágenes GFP y PSmOrange respectivamente.
Nota: Utilice la invertida microscopio confocal de barrido láser A1R + de la sta invertidage TiEcontrolled por el software de imágenes de microscopio y equipada con 488 nm, 561 nm y 640 nm para los láseres de fotoconversión y de imagen. Sin embargo, la aplicación es, sin duda no se limita a este microscopio siempre que las líneas de láser para la conversión y de formación de imágenes están disponibles.- Ponga el objetivo 20X de aire en su lugar (NA: 0,75; WD: 1,0 mm; FOV: 0,64 x 0,64 mm).
- Utilice los siguientes ajustes del microscopio para detectar la proteína PSmOrange antes de fotoconversión: 561 nm láser, 0,74 mW medida en el plano de enfoque por encima del objetivo.
Nota: Esto corresponde a 40% en este sistema (medición en el plano de enfoque es la única manera de determinar la potencia efectiva). Ajustar la potencia del láser de acuerdo con las necesidades experimentales como la eficacia de las inyecciones de H2B-PSmOrange puede variar. - Añadir un factor de zoom para resaltar el área de interés. ampliaciones más altas reducen el tiempo de adquisición de imágenes y, por tanto, la fototoxicidad.
- Adquirir un z-pila que cubre la estructuras de interés utilizando 488 nm y 561 nm láseres en modo secuencial (modo de línea 1-> 4). Z fijar el paso entre 1,0 y 2,0 micras. promedio de la línea y la frecuencia de exploración se pueden utilizar para optimizar la calidad de la imagen.
- Analiza la muestra y seleccionar la región de la herramienta de interés (ROI) para resaltar el área de photoconvert. Fijar el retorno de la inversión como zona de estimulación. Seleccione el módulo de fotos de activación / Blanqueamiento, activar el láser de 488 nm marcando la casilla respectiva y ajustar el láser de 488 nm a 80% (potencia del láser 1 mW medida en el objetivo). Ajuste la velocidad de barrido a 0,5 seg / marco.
- Abra la utilidad de fotoconversión (ND estimulación) y especificar la configuración de fotoconversión.
- Haga clic en el comando "Añadir" para especificar el protocolo de fotoconversión.
- Set "Fase" 1 en el menú "Adquisición / Estimulación" a la "adquisición" e indicar el número de imágenes que se adquirió antes de fotoconversión en el menú de "bucles".
- Ajuste "Fase" 2 a "St.imulation "e introduzca el número de eventos de estimulación a realizar.
- Ajuste "Fase" 3 como se describe para la "Fase" 1. Si lo desea, introduzca una espera "Fase" después de "Fase" 2 se introduce el tiempo de espera antes de la última ronda de adquisición de imágenes.
- Una vez establecidos todos los parámetros, aplicar el ajuste de la estimulación y ejecutar la fotoconversión.
Nota: la potencia del láser, la frecuencia de exploración y el número de iteraciones para cada ronda de fotoconversión puede variar y diferir de embrión a embrión. Un entorno para empezar se muestra en la Tabla 1.
- Adquirir una pila Z final utilizando 488 nm, 561 nm y 640 nm láseres que aplican los ajustes que el anterior. Ajuste el láser de 640 nm para la visualización del PSmOrange convertido mediante láser de potencia alta (hasta 4,5 mW).
5. Desmontar el embrión a partir de LMA
- Extraer el embrión que contiene la cámara del microscopio. Retirar con cuidado el embrión de la U de agarosacantar fórceps.
- Transferir el embrión en un nuevo plástico esterilizada placa de Petri o en una de 6 pocillos de la placa esterilizada que contiene 1x E3 y PTU 0,2 mM. Incubar el embrión a 28 ° C hasta la etapa de desarrollo deseado.
6. Analizar el destino de Photoconverted PSmOrange células que expresan la proteína
- Vuelva a insertar el embrión como se describe en los puntos 3.3 y 3.4.
- Colocar la muestra bajo el microscopio confocal y escanear la muestra para identificar células photoconverted (640 nm) en la estructura transgénico GFP de interés (488 nm).
- Adquirir un z-pila que cubre las estructuras de interés usando 488 nm, 561 nm y 640 nm láseres en modo secuencial (modo de línea 1-> 4). Z fijar el paso entre 1,0 y 2,0 micras. promedio de la línea y la frecuencia de exploración se pueden utilizar para optimizar la calidad de la imagen.
- Utilice uno de los siguientes métodos para identificar células que co-expresan GFP y la proteína photoconverted.
- automática por encargo Fiji ImagenJ 3 Macro
- Convolve la pila original usando el plugin "desenfoque gaussiano" (Proceso → → → Filtros desenfoque gaussiano) y restar las pilas lisas de la original utilizando el plug-in "Calculadora de imagen" (→ Proceso → Calculadora de imagen). Utilice este paso para visualizar las estructuras de interés y reducir el tiempo de cálculo para el análisis.
- Aplicar umbrales específicos a los canales verde y rojo lejano con el fin de resaltar las células photoconverted (→ Imagen → Ajustar → Umbral). Utilice la herramienta de "Analizar Partículas" para detectar las zonas de umbral con un ajuste adecuado (→ → Analizar Analizar Partículas).
- Abrir el plugin "Calculadora de imagen" y mostrar las regiones de interés se superponen en el canal verde y rojo lejano en (→ Proceso → Calculadora de imagen) de color amarillo.
- software de imágenes del microscopio para la evaluación de datos 3D
- Mostrar la pila de3D utilizando la opción de vista show de volumen (3D → Menú de visualización → Mostrar vista de volumen). Utilice la interfaz gráfica para seleccionar los canales verde, rojo y rojo lejano, ajustar el brillo y el contraste y recortar la pila 3D para resaltar el área photoconverted (Figura 1).
Nota: métodos similares para analizar los datos están disponibles en la mayor parte del software común para el análisis de imágenes.
- Mostrar la pila de3D utilizando la opción de vista show de volumen (3D → Menú de visualización → Mostrar vista de volumen). Utilice la interfaz gráfica para seleccionar los canales verde, rojo y rojo lejano, ajustar el brillo y el contraste y recortar la pila 3D para resaltar el área photoconverted (Figura 1).
- automática por encargo Fiji ImagenJ 3 Macro
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Representative Results
La Figura 1 ilustra un ejemplo del sistema de PSmOrange fotoconversión. El complejo pineal es una estructura conservada en el diencéfalo dorsal de los vertebrados. Como en muchos otros vertebrados, este complejo formado por el órgano pineal en el centro del diencéfalo y las células parapineal del lado izquierdo. Elegantes, pero que consumen mucho tiempo uncaging experimentos mostraron que las células parapineal se originan en la parte anterior del órgano pineal 13. En tg (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) embriones transgénicos, tanto las células pineales y parapineal están etiquetados durante el desarrollo. Para evaluar la idoneidad del sistema PSmOrange utilizamos estos embriones para reproducir el reportado el desarrollo complejo pineal. 260 pg mRNA que codifica la forma nuclear de PSmOrange, H2B-PSmOrange, se inyectaron en una etapa de células de embriones transgénicos dobles para expresar la proteína en todos los núcleos de las células. embriones inyectados se incubaron a 28 ° C hasta 24 horas después de la fertilization (HPF), seleccionado para GFP y fuerte expresión H2B-PSmOrange y embebidos en LMA en un sistema de cámara cubreobjetos con el lado dorsal orientado hacia la parte inferior. La muestra se colocó bajo un láser confocal de barrido microscopio invertido controlado por software de formación de imágenes de microscopio y equipado con 488 nm, 561 nm y 640 nm láser y un objetivo 20X de aire para fotoconversión y seguimiento. Dos grupos de células en la parte anterior de la glándula pineal se photoconverted e inmediatamente la imagen (Figura 1 A - F). Las células photoconverted podrían ser visualizadas utilizando el láser 640 nm (rojo lejano - Figura 1C), pero no con el láser de 561 nm (naranja / rojo - la Figura 1B). Expresión de GFP en estas células fue inicialmente también reduce debido a photobleaching (Figura 1A, 1D, 1F). A los 52 HPF se detectó GFP y H2B-PSmOrange en las células que expresan la proteína H2B-PSmOrange photoconverted (Figura 1A '- F'). De hecho, algunas de estas células formaron la parapineal en el lado izquierdo del cerebro (puntas de flecha en la Figura 1A '- F'). Este resultado es consistente con los informes anteriores sobre el origen celular parapineal y muestra la aplicabilidad de la técnica PSmOrange en el embrión vertebrado vivo.
. Figura 1. Identificar el origen celular parapineal usando el sistema PSmOrange fotoconversión en embriones de pez cebra viva (A - F ') con vistas dorsales anterior al principio se centró en el diencéfalo dorsal de un tg (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) embrión transgénico destacando la pineal (P) y las células parapineal (pp) en (A - F) 26 hpf inmediatamente después de fotoconversión y (A '- F & # 39;) 26 horas más tarde a los 52 HPF. El embrión se le inyectó ARNm que codifica H2B-PSmOrange. Las imágenes muestran reconstrucciones en 3D. La expresión de (A, A ') GFP transgénicos, (B, B') no convierte H2B-PSmOrange (canal rojo) y (C, C ') después de fotoconversión (canal rojo lejano). círculos de puntos blancos resaltan el área de fotoconversión, que carece de la fluorescencia naranja / rojo. (D, D ') de mezcla de los tres canales (verde, rojo, rojo lejano), (E, E') canales rojo y rojo lejano y canales verde y rojo lejano (F, F '). (A'-F ') puntas de flecha blancas destacan la localización de las células parapineal, que muestran fluorescencia verde de naranja, / rojo y rojo lejano. (AF) La barra de escala se muestra en la esquina inferior derecha de cada imagen.pload / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fase | Número de Loop | Los láseres activos |
| Adquisición | 1 ciclo | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Estímulo | 15 a 30 ciclos | 488 nm |
| Maduración | 1 minuto | # |
| Adquisición | 1 ciclo | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tabla 1: Condiciones para H2B-PSmOrange fotoconversión.
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Discussion
embriones transgénicos portadores de reporteros fluorescentes han contribuido fundamentalmente para entender el desarrollo embrionario. Sin embargo, todavía existe la necesidad esencial de promotores para facilitar la visualización específica de estructuras particulares. En su ausencia, los investigadores se basan en técnicas tales como la fotoconversión de las proteínas fluorescentes para obtener información sobre el origen y desarrollo de su estructura de interés. Esto a su vez es un requisito previo fundamental para identificar los mecanismos moleculares implicados en su desarrollo. Los avances técnicos en el campo de pez cebra permiten ahora para reemplazar la FP en las líneas transgénicas con, por ejemplo, proteínas fotoconvertible utilizando un golpe mediada CRISPR-Cas9 en el enfoque 14,15. Sin embargo, esta técnica es relativamente mucho tiempo y no siempre con éxito. Por el contrario, la aplicación de ubicuamente expresado H2B-PSmOrange en GFP y posiblemente otros fondos transgénico es una técnica sencilla para seguir células a través de emdesarrollo embrionaria.
Por ejemplo, el origen de la habenulae ventral pez cebra, una parte de un sistema de conducción neural conservada en el diencéfalo dorsal de los vertebrados, ha sido difícil de alcanzar hasta hace poco y por lo tanto no se descubrió en cascada genética subyacente su desarrollo. Utilizando el sistema de PSmOrange y análisis de lapso de tiempo a largo plazo para seguir células que migran, hemos podido demostrar que a diferencia de los núcleos habenulares dorsales, que se originan a izquierda y derecha junto a la epífisis, las neuronas habenulares ventrales desarrollan posterior a esta región en el tálamo 3. Este conocimiento nos ha permitido a continuación para identificar la función crucial de la señalización canónica gen abajo TCF7L2 para el desarrollo de las neuronas ventrales habenular Wnt.
La aplicación del sistema de PSmOrange fotoconvertible es simple, rápido y tiene la ventaja sobre las proteínas fotoactivable que los embriones se pueden seleccionar para una fuerte expresión de la proteína antes de la iluminación. sintética mRNA codificación para H2B-PSmOrange se inyecta en el embrión GFP-transgénico para expresar la proteína fluorescente de forma ubicua en todos los núcleos de naranja. No hemos encontrado efectos secundarios tras la inyección y la proteína es estable durante al menos 96 h. La proteína se photoconverted después en células GFP-transgénico en el retorno de la inversión mediante un láser de excitación de 488 nm y el embrión puede ser analizada para la proteína fluorescente roja lejana ahora que contiene células dentro de los siguientes 48 horas aproximadamente. Es crítico para controlar la fotoconversión éxito como las condiciones pueden variar dependiendo de la etapa de desarrollo del embrión y el tejido diana. El software de imágenes de microscopio adquiere una imagen de cada canal (verde, rojo y rojo lejano) antes y después de fotoconversión. La eficiencia de fotoconversión se puede evaluar midiendo la intensidad de fluorescencia media en el retorno de la inversión entre los diferentes canales antes y después de fotoconversión. Si no se detecta la fluorescencia roja lejana inmediatamente después del anuncio de fotoconversiónrondas condicional de fotoconversión tienen que aplicarse. blanqueo GFP es común después de fotoconversión. Sin embargo, la traducción continua de la proteína fluorescente transgénico supera este problema dentro de aproximadamente 2 horas.
Una macro por encargo para Fiji ImageJ para facilitar la identificación de células co-expresan la proteína photoconverted y la GFP transgénica es disponible 3. futuro establecimiento de líneas transgénicas estables que expresan el H2B-PSmOrange simplificará aún más este procedimiento. También facilitará el análisis de eventos de desarrollo después de 4 días después de la fecundación, lo que podría tener un valor intrigante para áreas de investigación como la regeneración de tejidos. Además, la combinación de la madre que expresan los transgénicos PSmOrange y time-lapse de 16 será una herramienta poderosa para la investigación de células migratorias eventos que comienzan antes de la gastrulación en un solo nivel celular. Otras aplicaciones pueden incluir el intercambio de la etiqueta nuclear con H2B, fo instancia, GAP43 para visualizar las membranas celulares y, potencialmente, los axones en el embrión en desarrollo.
Una limitación de esta técnica es que la proteína cigóticos solamente empieza a ser expresada después de la gastrulación y por lo tanto no es aplicable al análisis de los procesos de gastrulación. También se tiene que considerar que es más bien difícil de photoconvert la proteína en las células situadas profundamente en el embrión. fotoconversión ajustes deben ser adaptados como el alto poder de láser y tiempo de estimulación relativamente largo necesario para fotoconversión puede dar lugar a daños en los tejidos, lo que requiere un control cuidadoso.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
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