Protocol
1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transkripsiyon ve mRNA Saflaştırma
- üreticinin talimatlarına uygun olarak Notl kısıtlama enzimi ile pCS2 plazmidi içeren H2B-PSmOrange linearize.
Not: mRNA kontaminasyonu ve bozulmasını önlemek için eldiven ve laboratuvar kat olarak uygun korumaları kullanarak bir sonraki adımları gerçekleştirin. - üreticinin protokollerine göre olan bir PCR Saflaştırma kiti ya da fenol-kloroform göre yöntemler kullanılarak Doğrusal hale getirilen DNA saflaştırılır.
- üreticinin talimatlarına göre Sp6-mRNA transkripsiyonu için doğrusallaştırılmış şablon DNA 1 ug kullanın.
- 37 ° C'de 10-20 dakika boyunca 1.0 U RNaz bilgilerini DNaseI eklenerek DNA çıkarın.
- Bir RNA üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak mRNA temizleyin.
- MRNA saflık ve konsantrasyon geliştirmek 6 ul sodyum asetat (3.0 M, pH 5.2) ve 150 ul% 96 etanol eklenerek mRNA çökeltildi. m inkübeEn az 30 dakika boyunca ve 24 saat kadar, -20 ° C'de ixed çözeltisi.
- 4 ° C'de 45 dakika boyunca 18,407 x g'de çözelti eğirme mRNA toplayın. sıvı atılır ve 150 ul% 70 etanol içinde mRNA tekrar süspansiyon. Karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta ilave bir 15 dakika boyunca çözeltiden santrifüjlenir. , Sıvı atın buz üzerinde 5 dakika boyunca pelet kurutulur ve 20 ul ultra-saf RNazsız su içinde mRNA tekrar süspansiyon.
- 100 mRNA seyreltme (99 ul ultra-saf RNazsız su içinde 1 ul mRNA) bir 1: fotometrik ölçümüyle mRNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek.
- Kısa süreli depolama için, -20 ° C'de mRNA çözüm tutun. Uzun süreli depolama için, -80 ° C mRNA tutun.
Zebra balığı Embriyolar içine 2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroenjeksiyon
- tg kullanarak enjeksiyon öncesi eşleyen gece çiftleşme kurmak (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) çift transgenik balık (ya da diğer herhangi bir GFP transgenik balık). Bir boşluk koyarak ayrılmış balık bırakınAralarında çiftleşme kontrol etmek.
- enjeksiyon sabah ayırıcı çıkarın ve 20 dakika süre ile balık eş sağlar.
- süresi çiftleşme sırasında, 130 ug son konsantrasyona H2B-PSmOrange mRNA seyreltik / nl ve Microloader ucunu kullanarak mikroenjeksiyon, tüpün içine transferi 6 ul enjeksiyon çözeltisi (RNazsız su içinde). kalibre cam slayt ile enjeksiyon hacmi kontrol edin. 2 nl mRNA çözeltisi (260 pg) enjekte etmek için enjeksiyon basıncını ayarlayın.
- 1x Embriyo (E3) orta içeren bir sterilize plastik petri kabına yumurta toplamak.
- Bir plastik pastör pipet kullanarak bir enjeksiyon çanak 20 30 embriyoların transferi.
- Tek hücreli aşamada 11'de sarısı içine hücreye hücreye ya da hemen altında solüsyon içeren 2 nl mRNA enjekte edilir.
- 1x E3 ortamı içeren bir petri-çanak içine Transferi enjekte embriyolar, döllenmemiş veya normal gelişim gösteren embriyolar kaldırmak ve 28 ° C'de onları büyümek.
Not: Işık koruma oembriyoların f deney boyunca gerekli değildir. - 1x E3 ortam içinde zebra balığı embriyolar kaldırın ve pigmentasyonu önlemek için gastrulasyon sonra 0.2 mM PTU (1-fenil-2 tiyoüre) ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon tehlikesini en aza indirmek için günde iki kez orta değiştirin.
3. Embriyo Gömme
- GFP (yeşil) ve PSmOrange bir floresan lamba ve uygun emisyon filtreleri ile donatılmış bir binoküler mikroskop kullanılarak (kırmızı / turuncu) birlikte ifade embriyolar seçin. 1x E3 ortamı içeren steril bir petri kabına pozitif embriyolar aktarın.
- Forseps 12 kullanarak bir stereomicroscope altında dechorionate embriyolar.
- 1.0 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde transferi bir embriyo, bir kesme ucu pipet (P200) kullanarak, ultra saf su içinde hazırlanmış% 1.0 düşük erimeli agaroz (LM) önceden ısıtılmış. Not: 80 ° C LMA ısıtın ve embriyo yerleştirmeden önce, oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca soğumaya.
- Bir içine 150 ul LMA embriyo transfercoverglass bölmeli ve ince bir plastik uç kullanılarak ters döndürülür konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + (ya da uygun olan herhangi bir mikroskop) için tarif edilen deneyde embriyonun yönünü örneğin dorsal tarafına ayarlayın. LMA polimerize olduğunda, anestezi için 0.2 mM propiltiourasil'in% 0.02 etil 3-aminobenzoat metansülfbnat (Tricaine) içeren balık su haznesi doldurun.
- örnek görüntüleme önce Tricaine etkisini tespit etmek için 15 dakika bekleyin. Anestezi aydınlık aydınlatma ile donatılmış bir stereomikroskop kullanılarak izlenebilir embriyo hareketleri önler.
Not: odaları iki kez tekrar edilebilir.
4. PSmOrange Fotoçevrim
- konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve 488 nm ve sırasıyla GFP ve PSmOrange görüntüleme için 561 nm lazerler kullanarak photoconvert için bölgeyi tanımlamak için örnek tarayın.
Not: ters sta üzerine ters konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + kullanınge mikroskop görüntüleme yazılımı ile TiEcontrolled ve 488 nm, 561 nm ve Fotoçevrim ve görüntüleme için 640 nm lazer ile donatılmış. Bununla birlikte, uygulama kesinlikle uzun dönüşüm ve görüntüleme için bir lazer hattı mevcuttur Bu mikroskop ile sınırlı değildir.- yerine 20X hava hedefi koydu (NA: 0.75; WD: 1,0 mm; FOV: 0.64 x 0.64 mm).
- Fotoçevrim önce PSmOrange proteini tespit etmek için aşağıdaki mikroskop ayarları kullanın: 561 nm lazer, objektif üzerindeki odak düzleminde ölçülen 0.74 mW.
Not: Bu, bu sistemde% 40 tekabül (Odak düzleminde ölçme etkili gücünü belirlemek için tek yoldur). değişebilir H2B-PSmOrange enjeksiyonları verimliliği gibi deneysel ihtiyaçlarına göre lazer gücünü ayarlayın. - ilgi alanı vurgulamak için yakınlaştırma faktörlerini ekleyin. Daha yüksek büyütme görüntü elde etme süresi ve bu nedenle fototoksisite azaltır.
- yapıyı kapsayan bir z-yığını Edinme488 nm ve sıralı mod (hat modu 1-> 4) 561 nm lazerler kullanarak ilgi s. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir.
- örnek Tarama ve photoconvert alanı vurgulamak için ilgi (ROI) aracı bölgeyi seçin. stimülasyon alanı olarak ROI sabitleyin. Fotoğraf Aktivasyon / Beyazlatma modülü seçin, ilgili kutucuğu işaretleyerek 488 nm lazer etkinleştirmek ve% 80 (objektif ölçülen 1 mW lazer gücü) için 488 nm lazer ayarlayın. 0.5 sn / Frame tarama hızını ayarlayabilirsiniz.
- Fotoçevrim programı (ND Uyarım) açın ve Fotoçevrim ayarlarını belirtin.
- Fotoçevrim protokolünü belirtmek için "Ekle" komutu üzerine tıklayın.
- "Toplama / Stimülasyon" menüsüne "Toplama" in "Faz" 1 Set ve görüntü sayısı "Döngüleri" menüsündeki Fotoçevrim önce elde edilecek göstermektedir.
- St "olarak ayarlayın" Faz "2imulation "ve stimülasyon olayların sayısını girmek yapılacak.
- Ayarı "Faz" 3 "Faz" 1. İsteğe bağlı için tarif edildiği gibi, görüntü alımı son turdan önce beklenecek süre girerek "Faz" 2 sonra bekleyen "Faz" takın.
- Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, uyarım ayarı uygulamak ve Fotoçevrim çalıştırın.
Lazer gücü, değişebilir Fotoçevrim her tur için tarama ve adım sayısı sıklığı ve embriyoya embriyo farklıdır: edin. Bir ayar Tablo 1'de gösterilmiştir ile başlayın.
- 488 nm, 561 nm ve yukarıdaki gibi ayarları uygulayarak 640 nm lazerler kullanarak nihai z-yığını edinin. (4.5 mW kadar) yüksek lazer gücünü kullanarak dönüştürülen PSmOrange görselleştirmek için 640 nm lazer ayarlayın.
LMA 5. Dismount Embriyo
- mikroskop bölmeyi içeren embriyo çıkarın. Dikkatle agaroz u embriyo kaldırmakforseps şarkı.
- Yeni bir steril plastik Petri-çanağı içine veya 1 x E3 ve 0.2 mM PTU içeren steril bir 6-yuvalı plaka içinde embriyo transferi. arzu edilen gelişme aşamasına kadar 28 ° C 'de embriyo inkübe edin.
6. Photoconverted PSmOrange proteini ifade eden hücrelerin kaderini analiz
- nokta 3.3 ve 3.4 bölümünde anlatıldığı gibi embriyo Yeniden embed.
- konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve ilgi (488 nm) GFP transgenik yapısında photoconverted hücreleri (640 nm) tanımlamak için örnek tarayın.
- 488 nm, 561 nm ve sıralı mod (hat modu 1-> 4) 640 nm lazerler kullanarak ilgi yapıları kapsayan bir z-yığını edinin. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir.
- , Burada ko-ifade GFP ve photoconverted protein hücreleri belirlemek için, aşağıdaki yöntemlerden birini kullanabilirsiniz.
- Özel yapım otomatik Fiji GörüntüJ Makro 3
- Convolve "GaussianBlur" eklentisi kullanarak orijinal yığın (→ Süreç → GaussianBlur → Filtreler) ve "Görüntü Hesaplama" eklentisi (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) kullanarak orijinal pürüzsüz yığınları çıkarmak. ilgi yapılarını görselleştirmek ve analiz için hesaplama süresini azaltmak için bu adımı kullanın.
- photoconverted hücreleri vurgulamak amacıyla yeşil ve uzak-kırmızı kanallara özgü eşikler uygulayın (→ Görüntü → → Eşiği ayarlayın). Uygun bir ayar ile eşik alanlarını tespit etmek için "Parçacıklar Analiz" aracını kullanın (→ Parçacıklar Analiz → Analiz).
- "Görüntü Hesaplama" eklentisi açın ve sarı (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) yeşil ve uzak-kırmızı kanalda örtüşen ROI'ları görüntüler.
- 3D veri değerlendirme için mikroskop görüntüleme yazılımı
- yığını görüntülemek(3D Görselleştirme Menü → göster Ses Görünüm →) göstermek hacmi görünümü seçeneğini kullanarak 3D. Yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları seçmek parlaklık ve kontrast ayarı ve photoconverted alanı (Şekil 1) vurgulamak için 3D yığını kırpmak için grafik arayüzü kullanın.
Not: Veri görüntü analizi için ortak yazılımların çoğu mevcuttur analiz etmek için benzer yöntemler.
- yığını görüntülemek(3D Görselleştirme Menü → göster Ses Görünüm →) göstermek hacmi görünümü seçeneğini kullanarak 3D. Yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları seçmek parlaklık ve kontrast ayarı ve photoconverted alanı (Şekil 1) vurgulamak için 3D yığını kırpmak için grafik arayüzü kullanın.
- Özel yapım otomatik Fiji GörüntüJ Makro 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, PSmOrange Fotoçevrim sisteminin bir örneğini göstermektedir. epifiz kompleks omurgalı dorsal diensefalon korunmuş bir yapıdır. diğer omurgalılarda olduğu gibi, bu karmaşık diensefalon ve sol parapineal hücrelerin merkezinde epifiz organı oluşur. Zarif ama zaman alıcı uncaging deneyler parapineal hücreler epifiz organı 13 ön kısmında menşeli olduğu görüldü. TG (Foxd3 GFP); tg (FLH: GFP) transgenik embriyolar, epifiz ve parapineal hem hücrelerin gelişimi sırasında etiketlenir. PSmOrange sisteminin uygunluğunu değerlendirmek için bildirilen pineal karmaşık gelişimini üretmek için bu embriyoları kullandı. PSmOrange, H2B-PSmOrange nükleer formunu kodlayan 260 fig mRNA, her hücre çekirdeğinde proteinini ifade etmek için tek hücreli aşamada, çift transgenik embriyoların içine enjekte edildi. Enjekte embriyolar 24 saat sonra fertilizat kadar 28 ° C'de inkübe edildiiyon (hpf), GFP ve güçlü H2B-PSmOrange ifadesi için seçilen ve alt yönelik sırt tarafında bir bölmeli lamel sisteminde LMA gömülü. numune mikroskobu görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir ve 488 nm, 561 nm ve 640 nm lazer ve Fotoçevrim ve izleme için 20X hava amacı ile donatılmış bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu altında yerleştirildi. Epifiz ön bölümünde iki hücre kümeleri photoconverted ve hemen (Şekil 1A - F) görüntülendi. Photoconverted hücreler 640 nm lazer (çok kırmızı - Şekil 1C) kullanılarak görüntülendi olabilir, ancak 561 nm lazer ile (kırmızı / turuncu - Şekil 1B). Bu hücrelerde GFP tanımı ilk olarak da bağlı (Şekil 1A, 1B, 1F) ışıkla ağartma indirgendi. 52 hpf GFP ve H2B-PSmOrange photoconverted H2B-PSmOrange proteini ifade eden hücrelerde tespit edilmiştir (Şekil 1A '- F'). Gerçekten de, bu hücrelerin birkaç beyin sol tarafında parapineal oluşturulmuş (Şekil 1A ok uçları '- f). Bu sonuç parapineal hücre kökenli önceki çalışmalarla uyumludur ve yaşam omurgalı embriyoda PSmOrange tekniğinin uygulanabilirliğini göstermektedir.
. Zebrafish embriyolar yaşayan PSmOrange Fotoçevrim sistemini kullanarak parapineal hücre orijinini belirlemek Şekil 1. (A - F ') bir tg dorsal diensefalon odaklanmış üstüne anterior Dorsal görünümleri (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) transgenik embriyo de epifiz bezleri (P) ve parapineal hücreleri (s) vurgulayarak (A - F) 26 hpf hemen sonra Fotoçevrim ve (A '- F & # 39;) 26 saat sonra 52 hpf. Embriyo mRNA H2B-PSmOrange kodlayan enjekte edildi. resimleri göstermek 3D rekonstrüksiyon. (A, A ') transgenik GFP (B, B') ifadesi değildir Fotoçevrim (uzak-kırmızı bir kanal) sonra H2B-PSmOrange (kırmızı kanal) ve (C, C ') dönüştürülür. Beyaz noktalı çevreler kırmızı / turuncu floresan yoksun Fotoçevrim alanı, vurgulayın. (D, D ') her üç kanal birleştirme (yeşil, uzak-kırmızı, kırmızı), (E, E') kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları ve (F, F ') yeşil ve uzak-kırmızı kanalları. (A'-F ') Beyaz ok başları yeşil, turuncu / kırmızı ve uzak-kırmızı floresan göstermek parapineal hücrelerin yerini vurgulayın. (AF ') ölçek çubuğu her resmin sağ alt köşesinde görüntülenir.Güncelle / 53604 / 53604fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Faz | Döngü Sayısı | aktif Lazerler |
| Toplama | 1 döngü | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
| Uyarım | 15-30 devir | 488 nm |
| olgunlaşma | 1 dakika | # |
| Toplama | 1 döngü | 488 nm, 561 nm, 640 nm |
Tablo 1: H2B-PSmOrange Fotoçevrim koşulları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
floresan gazetecilere taşıyan transgenik embriyolar embriyo gelişimini anlamak için temelde yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, özellikle yapıların belirli bir görselleştirme kolaylaştırmak için promotörler için gerekli ihtiyaç vardır. Onların yokluğunda, araştırmacılar kendi ilgi yapısının kökeni ve gelişimi hakkında bilgi edinmek için bu tür floresan proteinleri Fotoçevrim gibi teknikler güveniyor. Bu da onun gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaları tanımlamak için önemli bir ön koşuldur. Zebra balığı Alanında Teknik gelişmeler artık yaklaşımı 14,15 bir CRISPR-Cas9 aracılı vuruş kullanan örneğin transgenik, photoconvertible proteinlerde FP yerine izin verir. Ancak, bu teknik, nispeten zaman alan ve her zaman başarılı değildir. Buna karşılık, ubiquitously uygulama GFP H2B-PSmOrange ve muhtemelen diğer transgenik arka dile em yoluyla hücrelere takip etmek bir düz-İleri tekniktirbryonic gelişme.
Örneğin, Zebra balığı ventral habenulae kökeni, omurgalıların dorsal diensefalon korunmuş sinir iletim sisteminin bir parçası, son zamanlarda ve dolayısıyla gelişmenin ardındaki genetik kaskad ortaya çıkarılmıştır kadar zor olmuştur. Göç hücreleri takip PSmOrange sistemi ve uzun vadeli time-lapse analizi kullanarak, sol ve epifiz sağ bitişik Originate dorsal habenular çekirdekler, aksine, ventral habenular nöronlar talamus 3 bu bölgeye posterior geliştirmek olduğunu gösterebilir. Bu bilgi bize sonra ventral habenular nöron gelişimi için aşağı gen Tcf7l2 sinyalizasyon kanonik Wnt hayati işlevini tanımlamak için izin verdi.
photoconvertible PSmOrange sisteminin uygulanması hızlı, basit ve embriyolar aydınlatma önce kuvvetli protein ifadesi için seçilebilir photoactivatible protein üzerinde bir avantaja sahiptir. sentetik mRH2B-PSmOrange NA şifreleyen her yerde her zaman tüm çekirdeklerde turuncu flüoresan proteini ifade etmek üzere GFP transgenik embriyo enjekte edilir. Bu enjeksiyonu üzerine hiç bir yan etkisi bulunan olmamış ve protein, en az 96 saat boyunca stabildir. Protein daha sonra 488 nm eksitasyon lazer kullanarak ROI GFP transgenik hücrelerde photoconverted, embriyo daha sonra yaklaşık 48 saat içinde hücreleri ihtiva eden artık uzak-kırmızı flüoresan protein için analiz edilebilir. Koşullar embriyo gelişim evresi ve hedef dokuya bağlı olarak değişebilir başarılı Fotoçevrim izlemek için çok önemlidir. mikroskop görüntüleme yazılımı öncesi ve Fotoçevrim sonra (kırmızı ve uzak-kırmızı yeşil) her kanalın bir görüntü kazanır. Fotoçevrim etkinliği öncesi ve sonrası Fotoçevrim farklı kanallar arasında ROI ortalama yoğunluğu floresan ölçüm değerlendirilebilir. Hiçbir uzak-kırmızı floresan Fotoçevrim reklamın hemen sonra tespit edilirseFotoçevrim arasında ditional mermi tatbik edilmelidir. GFP ağartma Fotoçevrim sonra sık görülür. Bununla birlikte, transjenik floresan protein sürekli için yaklaşık 2 saat içinde, bu sorunun üstesinden gelmektedir.
Fiji ImageJ için özel yapılmış makro hücreleri photoconverted proteini birlikte sentezleyen ve transgenik GFP 3 kullanılabilir belirlenmesini kolaylaştırmak için. ayrıca bu prosedürü basitleştirecek H2B-PSmOrange ifade eden stabil transgenik hatlarının gelecek kurulması. Ayrıca doku rejenerasyonu gibi alanlarda araştırma ilginç bir değere sahip olabilir 4 gün sonra döllenme sonrası gelişimsel olayların analizini kolaylaştıracaktır. Buna ek olarak, maternal ifade PSmOrange transgenik ve zaman atlamalı görüntüleme 16 kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde gastrulasyon önce başlayan hücre göçmen olayları araştıran için güçlü bir araçtır olacak. Diğer uygulamalar f ile H2B nükleer etiketinin değişimini içerebilirveya örneği, GAP43 Gelişmekte olan embriyoda hücre zarlarını ve potansiyel aksonlar görselleştirmek için.
Bu tekniğin bir sınırlama zigotik proteinin, sadece gastrulasyon sonra ifade edilecek başlar ve bu nedenle Gastrulasyon süreçlerin analiz için geçerli değildir olmasıdır. Ayrıca, embriyo derin bulunduğu hücrelerdeki protein photoconvert oldukça zor olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Fotoçevrim ayarları yüksek lazer gücü ve dikkatle takip edilmesi gereken doku hasarı ile sonuçlanabilir Fotoçevrim için gerekli nispeten uzun bir uyarım süresi olarak uyarlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| Plastic Pasteur | alpha laboratories | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | The plasmid described in the paper is available in the Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X air objective | Nikon GmbH Germany | No Number | |
| NIS Elements AR Software (v. 4.30.02) | Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging | No Number |
References
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
- Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
- Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
- Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
