Summary
Exponering för teratogener kan orsaka fosterskador. Zebrafisk är användbara för att bestämma teratogena potential kemikalier. Vi visar användbarheten av zebrafisk genom att exponera embryon till olika nivåer av nitrit och även vid olika tider på exponering. Vi visar att nitrit kan vara giftiga och orsaka allvarliga utvecklingsdefekter.
Abstract
Höga nitrathalter i miljön kan leda till medfödda defekter eller missfall hos människor. Förmodligen beror detta på att omvandlingen av nitrat till nitrit av tarm och salivbakterier. Men i andra däggdjurs studier, hög nitritnivåer inte orsaka fosterskador, trots att de kan leda till dåliga reproduktiva utfall. Således är inte klart teratogena potential nitrit. Det skulle vara bra att ha ett ryggradsdjur modellsystem för att enkelt bedöma teratogena effekter av nitrit eller andra kemiska av intresse. Här visar vi nyttan av zebrafisk (Danio rerio) för att screena föreningar för toxicitet och embryonala defekter. Zebrafisk embryon befruktas externt och har en snabb utveckling, vilket gör dem en bra modell för teratogena studier. Vi visar att en ökning av exponeringstiden till nitrit negativt påverkar överlevnad. Ökning av koncentrationen av nitrit också negativt påverkar överlevnad, medan nitrat inte gör det. För embryon that överleva nitrit exponering, kan olika fel uppstå, inklusive hjärt och gulesäcken ödem, simblåsan noninflation och kraniofaciala missbildningar. Våra resultat visar att zebrafisk är ett bekvämt system för att studera den teratogena potentialen av nitrit. Detta tillvägagångssätt kan enkelt anpassas för att testa andra kemikalier för deras effekter på tidigt ryggradsdjur utveckling.
Introduction
Teratogenes är en process som stör den normala utvecklingen av ett embryo eller foster genom att orsaka permanenta strukturella och funktionella abnormiteter, tillväxthämning, eller missfall i svåra fall 1. Det kan orsakas av vissa naturliga ämnen (teratogener), som stör embryonal utveckling på flera olika sätt 2. Under människans fosterutveckling, har gemensam teratogener såsom strålning, smittämnen, giftiga metaller och organiska kemikalier har rapporterats orsaka defekter i epicanthic veck (hudvecket i det övre ögonlocket) och krökt (krökt finger eller tå) genom morfogenetiska fel 1.
Att förstå den molekylära mekanismen för teratogenes är det första steget mot att utveckla behandling och prevention. Flera ryggradsdjur modeller som Afrikanska klogroda (Xenopus laevis) och zebrafisk (Danio rerio) har använts för att bestämma de molekylära vägar som drabbats av terätogens. Tidigare studier har använt zebrafisk som en modell för epidemiologi, toxikologi och teratogenes 3-7. Scholz et al. anses zebrafisk som en "gold standard" för miljöbedömning toxicitet. Detta beror delvis på insyn i zebrafisk embryot, som gör det möjligt för forskarna att visualisera utvecklingsdefekt som den förekommer åtta. Cirka 70% av mänskliga gener har ortologer i zebrafisk, vilket gör zebrafisk en önskvärd ryggradsdjur modell för att studera mänskliga fel 9.
Vissa epidemiologiska studier har visat att nitrat och nitrit, vanligt förekommande i jordbruks livsmedel och vatten, är förknippade med missbildningar eller spontana aborter 10,11, medan andra studier inte stöder denna förening 12. Nitrat (NO 3 -) och nitrit (NO 2 -) förekommer naturligt i jord och vatten. De är en källa av kväve för växter och är en del av den nitrogen cykel 13. Livsmedel som gröna bönor, morötter, squash, spenat och rödbetor från gårdar som använder gödselmedel höga nitrat har väsentligt förstärkt nivåer av nitrat och nitrit 7. Mjölk från kor som utfodrats med höga nitrat livsmedel och fisk i höga nitrat vatten (främst från jord avrinning 30) kan leda till människor som konsumerar stora mängder nitrat och nitrit 14. Nitrat och nitrit används också ofta i livsmedel konservering, vilket dramatiskt ökar mängden förtäras av människor 12.
Optimala nivåer av nitrat och nitrit spela grundläggande roller i fysiologiska processer som vaskulär homeostas och funktion, neurotransmission och immunologiska värd försvarsmekanismer 13-15. Emellertid kan exponering för höga halter av nitrat och nitrit leda till negativa effekter, särskilt hos spädbarn och barn som är 16. Ingested nitrat omvandlas vidare till nitrit i munhålan genom mikroflora och i the mag-tarmkanalen av tarmfloran 17.
Nitrat sätter spädbarn med hög risk för blue baby syndrome genom oxidation av hemoglobin till methemoglobin, försämra hemoglobin från sin syrebärande förmåga 18. Detta resulterar i den blå färgen på huden som sträcker sig till perifera vävnader i mer allvarliga fall. Hämmade syresättning av vävnader resulterar i andra symptom, värst leda till koma och död 19,20. Liknande symptom observeras hos barn och vuxna vid högre koncentrationer av nitrat 21. Förhöjda nivåer av methemoglobin hos vuxna på grund av nitrit förgiftning resulterar i cyanos, huvudvärk, andningsstörningar 31 och död om den inte behandlas på grund av komplikationer i samband med vital vävnad hypoxi 32,33.
Nitrat intas på högre nivåer kan också leda till olika komplikationer. Barndiabetes, återkommande diarré och återkommande luftvägsinfektionerhos barn har kopplats med höga nitratintaget 11,17,22. Kronisk exponering för en hög nivå av nitrat är associerad med urinering och mjälte hemorrhaging. Akut hög dos exponering för nitrat kan leda till ett brett spektrum av medicinska tillstånd som buksmärtor, muskelsvaghet, blod i avföring och urin, svimning och död 11. Prenatal exponering för nitrat på höga nivåer har förknippats med neuralröret och muskuloskeletala defekt 11.
En färsk rapport visar att behandling av zebrafisk embryon med nitrit ledde till gulesäcken ödem, kraniofaciala och axiella missbildningar, och simblåsa noninflation 5. I denna studie visar vi en metod för behandling av zebrafiskembryon med nitrat och nitrit för att bestämma deras teratogen potential. Embryon exponerades för nitrit vid olika koncentrationer och olika lång tid. Etanol användes som en positiv kontroll, eftersom det är en etablerad teratogen 23. OUR metod visade att både höga koncentrationer och långa exponeringstider till nitrit var skadliga för överlevnad och resulterade i olika fenotyper, som sträcker sig från mild (ödem) till allvarliga (bruttoutvecklingsdefekter). Därför är zebrafisk en användbar modell för att direkt undersöka de potentiella teratogena effekter av nitrat och nitrit på embryon för att komplettera epidemiologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedurer som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Indiana University of Pennsylvania.
1. Skörd Embryon
- Bibehålla zebrafisk vid 28,5 ° C, pH 7, konduktivitet mellan 500-1,500 iS, och en ljus / mörker-cykel av 14 timmar ljus och 10 timmar mörker 24. Använd vildtyp stammar, såsom tu, AB eller Tü / AB hybrid. Olika stammar kan reagera olika på kemisk behandling 25.
- Ställ in fisk för att passa kvällen innan skörd ägg genom att lägga till fisk systemet vatten i en passande behållare. Lägg en manlig och kvinnlig fisk i tanken och separera de två fiskar med en avdelare. Varje fisk par kommer att producera en rad 50-300 ägg. För att säkerställa att tillräckligt med ägg produceras, upprätta 30 par av fisk. Vanligtvis kommer ca 50% av fisk par på prime parnings ålder (6-9 månader gamla) producera ägg, vilket resulterar upp till 200 ägg per par och högst upp till tre000 ägg för detta experiment.
- Nästa morgon efter att ljuset tänds, ta bort avdelare för att initiera parning. Kontrollera parning tankar för ägg varje 15 min.
- När fisken lägger ägg, skörda alla embryon med hjälp av en tesil och kombinera dem till en stor behållare med E3-buffert (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4). Vid 1,5 HPF, ta bort och kasta obefruktade ägg med en plast överföringspipett under ett dissektionsmikroskop. Obefruktade ägg är ogenomskinliga medan befruktade ägg är transparenta 34.
- Överför 50 embryon till en 100 x 15 mm glaspetriskål innehållande 50 ml E3 buffert för varje behandlingsbetingelse. Totalt 33 rätter behövs för 11 behandlingsbetingelserna och 3 replikat.
2. Behandling av embryon
- Utföra behandlingar på 2 h efter befruktning (HPF) 35. Inkubera embryon / larver vid 28,5 ° C och undersöka larverna vid 120 HPF. Utför på least tre replikat av varje behandlingsbetingelse för statistisk analys.
- För 3 petriskålar (som vardera innehåller 50 embryon) vid två HPF bort E3 buffert med en överföringspipett och tillsätt 50 ml av 300 mM etanol utspätt i E3-buffert. Täck petriskålar med Parafilm för att minimera avdunstning av etanol.
- Fortsätt att exponera embryon till etanol under 22 h. Ta sedan bort etanolen med en överföringspipett. Tillsätt 50 ml av E3-buffert och snurra på skålen flera gånger för att tvätta ur etanolen. Ta bort den här E3 buffert med en överföringspipett och upprepa tvättsteget 2 gånger.
- För 3 petriskålar (som vardera innehåller 50 embryon) vid två HPF bort E3 buffert med en överföringspipett och tillsätt 50 ml ny E3 buffert.
- För 9 petriskålar (som vardera innehåller 50 embryon) vid två HPF bort E3 buffert med en överföringspipett och tillsätt 50 ml av 1000 mg / L natriumnitrit upplöst i E3-buffert. Kontrollera koncentrationen av beståndet nitritlösning i förväg med hjälp av enmodifiering av diazotering (USEPA metod 354,1) spektrofotometrisk metod 28.
- Fortsätt att utsätta 3 rätter för 46 timmar, 3 rätter för 70 timmar och 3 rätter för 94 timmar. Byt nitritlösningen med nybakade nitritlösning dagligen.
- Efter varje exponeringstid, ta bort nitrit med en överföringspipett. Tillsätt 50 ml av E3-buffert och snurra på skålen flera gånger för att tvätta ur nitrit. Ta bort den här E3 buffert med en överföringspipett och upprepa tvättsteget 2 gånger.
- För 3 petriskålar (som vardera innehåller 50 embryon) vid två HPF bort E3 buffert med en överföringspipett och tillsätt 50 ml av 200 mg / L natriumnitrit. Upprepa detta med 400, 600, 800, och 1000 mg / L av natriumnitrit.
- Fortsätt att exponera embryon till nitrit för 70 timmar. Byt nitritlösningen med nybakade nitritlösning dagligen.
- Efter exponeringstiden, avlägsna nitrit med en överföringspipett. Tillsätt 50 ml av E3-buffert och snurra skålen fleragånger för att tvätta ur nitrit. Ta bort den här E3 buffert med en överföringspipett och upprepa tvättsteget 2 gånger.
- För 3 petriskålar (som vardera innehåller 50 embryon) vid två HPF bort E3 buffert med en överföringspipett och tillsätt 50 ml av 1000 mg / L natriumnitrat löst i E3-buffert. Kontrollera koncentrationen av beståndet nitratlösning i förväg med hjälp av en modifiering av kadmium reduktion (USEPA metod 353,3) spektrofotometrisk metod 28.
- Fortsätt att exponera embryon till nitrat för 70 timmar. Byt ut nitratlösning med nybakade nitratlösning dagligen.
- Efter exponeringstiden, avlägsna nitrat med en överföringspipett. Tillsätt 50 ml av E3-buffert och snurra på skålen flera gånger för att tvätta ur nitrat. Ta bort den här E3 buffert med en överföringspipett och upprepa tvättsteget 2 gånger.
- Under varje dag av exponeringen, räkna antalet döda embryo / larver med hjälp av ett stereomikroskop. Tecken på dödenär brist på hjärtslag och blodcirkulation eller brist på rörlighet efter en minut för observation. Ta bort döda embryon / larver med en överföringspipett att minska föroreningen av E3-buffert.
- När experiment slutar vid 120 HPF, avliva larverna.
- Ta E3 buffert med en överföringspipett. Tillsätt sedan 50 ml 0,2% MS-222 (buffrad till pH 7) och vänta 10 min.
- Ta bort MS-222 med en överföringspipett. Tillsätt 50 ml av E3-buffert och virvla runt för att tvätta ur MS-222.
- Avlägsna E3 buffert med en överföringspipett och tillsätt 20 ml av 4% paraformaldehyd (PFA) för att fixera larver. Snurra skålen flera gånger. Använda en överföringspipett att överföra larver i en glasflaska tillsammans med tillräckligt med PFA för att fylla flaskan. Förvara rören i kylskåp över natten (O / N).
- Ta bilder av fasta larver med hjälp av en stereoskop med en digitalkamera. Använd 30X förstoring, ISO 200 och 200 ms exponeringstid. Orientera larverna så att den främre till left och rygg är till toppen av fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exponering för 300 mM etanol under 22 h hade ingen effekt på överlevnads (data ej visade), som är förenliga med tidigare rapporter 5,23,26. Detta förväntas, som etanol är en känd teratogen och tjänade som en positiv kontroll. Observerade fenotyper ingår perikardiell ödem, simblåsa noninflation (Figur 1), kraniofaciala defekter, och utvecklingsförsening (data visas ej).
Behandling med nitrit resulterade i mild till allvarliga effekter på överlevnad, beroende på exponeringstiden. Till exempel, exponering för 1000 mg / L för 94 h hårt drabbade överlevnad jämfört med kortare exponeringstider (figur 2).
Vi bedömde också effekten av olika nitritkoncentrationer på överlevnad. Embryon exponerades under 70 h till 200, 400, 600, 800, och 1000 mg / L. Överlevnaden var lägre när de utsätts för högkoncentrationer av nitrit, medan nitrat inte har en effekt på överlevnaden (Figur 3). Fenotyper för nitritbehandlade larver liknade etanol behandlade embryon (Figur 4).
Figur 1:. Develop Effekter av Etanol Behandling Embryon som behandlades med etanol uppvisade perikardiell ödem (pil), bada blåsan noninflation (streckad linje), gulesäcken ödem (pilspets) och kraniofaciala defekter (data ej visade). Bilder togs vid 96 HPF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Survival of 1000 mg / L Nitrit behandling efter olika tider på Exposure. Embryon utsattes för 1000 mg / L nitrit vid två HPF. Nitrit tvättades ut efter 46, 70, och 94 timmar av exponering, och överlevnadsgraden beräknades. Ökad tid exponering resulterade i minskad överlevnad. Standardavvikelser: Obehandlad = 24; 46 h = 6; 70 h = 6; 94 h = 0,9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Överlevnad efter exponering mot olika nitritkoncentrationer Embryon exponerades under 70 h för ökande koncentrationer av nitrit. Högre koncentrationer av nitrit ledde till lägre överlevnadsgrad. Nitrat hade ingen effekt ens vid den högsta koncentrationen av 1000 mg / L efter exponering under 70 h. Standardavvikelser för nitrit: Obehandlad = 19; 200 mg / L = 16; 400 mg / L = 21; 600 mg / L = 20; 800mg / L = 14; 1000 mg / L = 12. Standardavvikelsen för nitrat lika 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Utvecklings Effekter av nitrat och nitrit Embryon behandlas med 1000 mg / L nitrat (mitten panel) hade ingen effekt jämfört med den obehandlade kontrollen (övre panelen). Nitrit behandling vid 1000 mg / L resulterade i bruttoutvecklingsdefekter utöver liknande fenotyper observerats i etanolbehandling (nedre panelen). Bilder togs vid 120 HPF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här beskrivna metoden visar användbarheten av zebrafisk vid bedömningen av den teratogena potentialen av nitrit och nitrat. Jämfört med andra ryggradsdjur, zebrafisk har fördelar som inkluderar hög fruktsamhet, yttre befruktning, optisk transparens, och snabb utveckling. Tillgängliga mutanter som saknar pigmentering (såsom Casper zebrafisk 36) bidrar också till att öka synligheten av inre organ. Det är också lätt att generera transgena zebrafisk med reportergener för att underlätta analys i levande fisk 37. Eftersom zebrafisk genomet är konserverad med människor, kan information som erhålls från sina studier leda till translationella resultat hos människor 9. Metoden kan tillämpas på genuttryck analys, såsom in situ hybridisering, för att få ytterligare information om felaktig reglering av gener som orsakas av teratogener.
Etanol exponering påverkade inte signifikant överlevnad, men det vållade marked defekter som liknar tidigare rapporter 5,23,26. Detta visar att vår metod är tillförlitlig upprepa publicerade resultat. Nitrat hade ingen effekt på överlevnad, medan nitrit hade en betydande påverkan beroende på koncentration och exponeringstiden. Längre exponering och högre nivåer av nitrit hade en negativ effekt på överlevnad, i linje med tidigare resultat 5. Det har nyligen visat att överdriven nitrit exponering orsakade defekt hjärtklaff utveckling i zebrafisk 27, validerar användningen av zebrafisk att studera mekanismen för teratogener.
Det är kritiskt att bekräfta koncentrationerna av arbetslösningar efter att de är gjorda. Koncentrationerna av nitrat och nitrit kan mätas med användning av modifikationer av kadmium reduktion (USEPA Metod 353,3) och diazotering (USEPA Metod 354,1) spektrofotometriska metoder, respektive 28. En annan avgörande steg är att täcka Petri plattan med Parafilm för att minimera evapotranspirationranson av etanol, om detta används som en positiv kontroll. Om larver har oväntade dödlighet (för höga eller för låga), dubbelkolla beräkningarna och koncentrationerna av lösningarna.
Nyligen genomfördes en liknande metod används för att bestämma de teratogena effekterna av etanol 29. Även om denna metod är liknande vår metod här, endast exponerar den embryon till etanol under upp till 24 h, förmodligen på grund av toxiciteten av att exponera embryon till etanol under en lång tidsperiod. I kontrast, exponerar vår metod embryon till nitrat och nitrit i flera dagar med byte av testlösningarna dagligen. Detta är fördelaktigt för att testa mindre giftiga kemikalier.
Vi föreställer oss att vår metod kan tillämpas för att testa andra läkemedel eller särskilda miljöförhållanden. Dock är denna metod begränsad till endast testa vattenlösliga molekyler. Ljuskänslighet av vissa kemikalier är en annan faktor att beakta. Om testkemikalier är ljus SENSITIve, svepa petriskålar i aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Dessutom är metoden inte bra för att testa vatten som tas från en specifik miljö eftersom laboratoriezebrafisk kräver särskilda villkor (såsom pH och ledningsförmåga) för optimal utveckling. Ändå tjänar zebrafisk som en positiv modell för att snabbt avgöra utvecklingsdefekter som orsakas av potentiella teratogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DREL/2010 instrument | Hach | 26700-03 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| KIMAX glass Petri Dish | VWR | 89001-244 | |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| NitraVer 5 Nitrate Reagent | Hach | 14034-46 | |
| NitriVer 3 Nitrite Reagent | Hach | 14065-99 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 3-374-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| S6E stereomicroscope | Leica | 10446294 | |
| Sodium nitrate | Fisher Scientific | S343 | |
| Sodium nitrite | Fisher Scientific | S347 | |
| Transfer pipets | Laboratory Products Sales | L320072 | |
| Glass vials | Fisher Scientific | 03-338B |
References
- Gilbert-Barness, E.
- Brent, R. L. The cause and prevention of human birth defects: What have we learned in the past 50 years. Con Anom. 41 (1), 3-21 (2001).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E. Zebrafish: an in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
- Pamanji, R., et al. Toxicity effects of profenofos on embryonic and larval development of zebrafish (Danio rerio). Environ Toxicol Pharmacol. 39 (2), 887-897 (2015).
- Simmons, A. E., Karimi, I., Talwar, M., Simmons, T. W. Effects of nitrite on development of embryos and early larval stages of the zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 9 (4), 200-206 (2012).
- Mantecca, P., et al. Toxicity Evaluation of a New Zn-Doped CuO Nanocomposite With Highly Effective Antibacterial Properties. Toxicol Sci. , (2015).
- Jensen, F. B. Nitric oxide formation from nitrite in zebrafish. J Exp Biol. 210, 3387-3394 (2007).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment--applications beyond acute toxicity testing). Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- CDC. Spontaneous abortions possibly related to ingestion of nitrate-contaminated well water--LaGrange County, Indiana, 1991-1994. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 45 (26), 569-572 (1996).
- Brender, J. D., et al. Prenatal nitrate intake from drinking water and selected birth defects in offspring of participants in the national birth defects prevention study. Environ Health Perspect. 121 (9), 1083-1089 (2013).
- Huber, J. C., et al. Maternal dietary intake of nitrates, nitrites and nitrosamines and selected birth defects in offspring: a case-control study. Nutr J. 12, 34 (2013).
- Phillips, W. E. Naturally occurring nitrate and nitrite in foods in relation to infant methaemoglobinaemia. Food Cosmet Toxicol. 9 (2), 219-228 (1971).
- Moncada, S., Palmer, R. M., Higgs, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 43 (2), 109-142 (1991).
- Gladwin, M. T., Crawford, J. H., Patel, R. P. The biochemistry of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin: role in blood flow regulation. Free Radic Biol Med. 36 (6), 707-717 (2004).
- Gupta, S. K., et al. Recurrent acute respiratory tract infections in areas with high nitrate concentrations in drinking water. Environ Health Perspect. 108 (4), 363-366 (2000).
- Kross, B. C., Ayebo, A. D., Fuortes, L. J. Methemoglobinemia: nitrate toxicity in rural America. Am Fam Physician. 46 (1), 183-188 (1992).
- Greer, F. R., Shannon, M. Infant methemoglobinemia: the role of dietary nitrate in food and water. Pediatrics. 116 (3), 784-786 (2005).
- Sanchez-Echaniz, J., Benito-Fernandez, J., Mintegui-Raso, S. Methemoglobinemia and consumption of vegetables in infants. Pediatrics. 107 (5), 1024-1028 (2001).
- Reregistration Eligibility Decision: Inorganic Nitrate/Nitrite (Sodium and Potassium Nitrates). , U.S. Environmental Protection Agency. Available from: http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/old_reds/4052red.pdf (1991).
- Virtanen, S. M., et al. Nitrate and nitrite intake and the risk for type 1 diabetes in Finnish children. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diabet Med. 11 (7), 656-662 (1994).
- Case Studies in Environmental Medicine: Nitrate/Nitrite Toxicity. , U.S. Agency for Toxic Substances and Diseases Registry. Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/HEC/CSEM/nitrate/docs/nitrate_nitrite.pdf (2001).
- Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).
- Westerfield, M. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, University of Oregon Press. (2007).
- Loucks, E., Carvan, M. J. Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).
- Bilotta, J., Barnett, J. A., Hancock, L., Saszik, S. Ethanol exposure alters zebrafish development: a novel model of fetal alcohol syndrome. Neurotoxicol Teratol. 26 (2), 737-743 (2004).
- Li, J., Jia, W., Zhao, Q. Excessive nitrite affects zebrafish valvulogenesis through yielding too much NO signaling. PLoS One. 9 (3), e92728 (2014).
- Methods for chemical analysis of water and wastes. , United States Environmental Protection Agency. Cincinnati, OH. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Office of Research and Development (1983).
- Loucks, E., Ahlgren, S. Assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure. J Vis Exp. (61), (2012).
- Addiscott, T. M. Fertilizers and nitrate leaching. Agricultural Chemicals and the Environment, Issues in Environmental Science and Technology. , book 5 1-26 (1996).
- Su, Y. F., Lu, L. H., Hsu, T. H., Chang, S. L., Lin, R. T. Successful treatment of methemoglobinemia in an elderly couple with severe cyanosis: two case reports. Journal of Medical Case Reports. 6 (290), (2012).
- Harvey, M., Cave, G., Chanwai, G. Fatal methaemoglobinaemia induced by self-poisoning with sodium nitrite. Emergency Medicine Australasia. 22, 463-465 (2010).
- Nishiguchi, M., Nushida, H., Okudaira, N., Nishio, H. An autopsy case of fatal methemoglobinemia due to ingestion of sodium. Forensic Research. 6, (2015).
- Avdesh, A., Chen, M., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Ong, D., Rainey-Smith, S., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
