Abstract
rabattues de l'ARN à médiation sont largement utilisés pour contrôler l'expression des gènes. Cette famille de techniques polyvalent utilise de l'ARN court (ARNs) qui peut être synthétisée avec une séquence quelconque, et destiné à compléter n'importe quel gène ciblé pour le silençage. Étant donné que ARNs constructions peuvent être introduites à de nombreux types de cellules, directement ou en utilisant une variété de vecteurs, l'expression génique peut être réprimée dans les cellules vivantes sans modification génétique laborieuse. L'ARN le plus commun de la technologie knockdown, l'interférence ARN (ARNi), fait usage de la reconnaissance de la séquence endogène ARN-induite silençage complexe (RISC) de médiation et de clivage de l'ARNm cible. Les applications de cette technique sont donc limités à des organismes de type RISC, principalement exprimant eucaryotes. Récemment, une nouvelle génération de biotechnologistes d'ARN ont développé des mécanismes alternatifs pour contrôler l'expression des gènes par ARN, et ainsi rendu possible rabattues de gènes ARN médiée par des bactéries. Nous décrivons ici une méthode pour faire taire expres de gènession dans E. coli qui ressemble fonctionnellement ARNi. Dans ce système, un phagemide synthétique a été conçu pour exprimer des ARNs, qui peut conçu pour cibler une séquence quelconque. La construction d'expression est délivrée à une population de E. coli avec des cellules non lytique du phage M13, après quoi il est capable de se répliquer de manière stable comme un plasmide. La reconnaissance antisens et le silençage de l'ARNm cible est médié par la protéine Hfq endogènes à E. coli. Ce protocole comprend des procédés pour la conception de l'ARNs antisens, la construction du vecteur phagémide, le conditionnement du phagemide dans bactériophage M13, la préparation d'une population de cellules vivantes pour l'infection, et en effectuant l'infection elle-même. La protéine fluorescente mKate2 et chloramphénicol acétyltransférase du gène de résistance aux antibiotiques (CAT) sont ciblés pour générer des données représentatives et de quantifier l'efficacité knockdown.
Introduction
rabattues de gènes ARN médiée procèdent en deux étapes. Tout d'abord, une molécule d'ARN est introduit dans une lignée cellulaire ou d'un organisme d'étude. Deuxièmement, les protéines liant l'ARN endogènes, faciliter la reconnaissance de l'ARN-cible et de produire l'effet de silençage. Toutes les technologies d'ARN knockdown bénéficient de la nature personnalisable des ARNs synthétiques, qui peut être facilement produit pour correspondre à une cible d'intérêt spécifique. Cependant, les détails moléculaires de l'absorption de l'ARN et le silençage varient considérablement d'un système modèle, contraignant où et comment passes rabattues d'ARN peuvent être appliquées.
Dans les nématodes, l' ARN double brin (ARNdb) molécules peut être introduit directement dans les médias ou en alimentant les vers avec une population de ARNdb exprimant E. 1,2 cellules de E. coli. Chez la drosophile, l' ARNi peut être obtenue par micro - injection d' embryons à partir d' ARNdb 3, ou mis en œuvre dans des lignées cellulaires en ajoutant simplement l' ARNdb dans le milieu de culture 4. Dans les lignées cellulaires de mammifères,synthétiques petits ARN interférents (siRNA) peuvent être délivrés à des cellules vivantes par électroporation 1,2,5, emballés dans des liposomes 3,6, ou exprimés à partir de vecteurs d' ADN plasmidique 4,7. Une fois que les espèces d'ARN atteint le cytosol, la voie de l'ARNi repose sur le complexe RISC pour traiter ARNdb, faciliter la reconnaissance antisens de la cible, et de catalyser la répression traductionnelle, la dégradation de l'ARNm, ou de la formation hétérochromatine, en fonction de l'hôte.
En raison de ces exigences, l'ARNi classique peut être effectuée que dans les organismes qui prennent l'ARN exogène efficace et expriment RISC ou une activité RISC-like. Notamment, cela exclut le modèle bactérie E. coli, qui n'a pas la voie ARNi. Cependant, les progrès récents en biologie synthétique fournissent les outils nécessaires pour résoudre à la fois le problème de livraison et le problème de silence.
Dans ce protocole, les constructions ARNs sont exprimés en E. coli à partir d' un vecteur d'ADN délivré à liVing cellules en utilisant le système phagémide / helper M13. Un phagemide est tout plasmide ayant une origine f1 phage dérivé de replication. Un plasmide auxiliaire, dans ce cas M13KO, porte toute la machinerie nécessaire pour produire des particules virales, mais pas assez compétent pour la réplication et l'emballage. Quand un phagémide et plasmide auxiliaire sont co-transformées, le phagemide seul est répliqué à l'origine f1, emballé et sécrétée. Le phagemide vectorisé est alors capable d'infecter en direct E. coli via le pilus F.
Dans ce système, l'effet de silençage est produite par des cassettes d'ARNs personnalisées combinant une séquence d'échafaudage avec une séquence de liaison à la cible. La séquence de liaison à la cible est de 24 paires de bases antisens à un ARNm cible, typiquement au niveau du site de liaison au ribosome (RBS). La séquence d'échafaudage, développé par Na et ses collègues 8, contient un motif Hfq contraignant extrait de MICC, un petit ARN régulateur endogène E. coli. La protéine Hfq stimule l'ARN-ARN binding et la dégradation de l' ARNm, servant un rôle dans ce système similaire à RISC dans l' ARNi. La figure 1 illustre un schéma complet pour rabattues de ARNs phages à médiation, y compris la structure ARNs de cassette, vectorisation phagemide, et le mécanisme taire.
En tant que méthode pour moduler l' expression génique dans E. coli, ARNs silencing est simple, rapide et polyvalent. E. ciblée coli est pas surchargé au - delà de la propagation du phagemide et exprimant le ARNs. Cela peut être pertinent dans le contexte de la biologie synthétique ou la recherche fondamentale où l'expression des plus grandes constructions hétérologues peut grever les ressources cellulaires 9. Phagemides avec de nouvelles cibles peuvent être produites par une seule PCR et a récolté un jour après la transformation phagémide. Enfin, presque tous les ARNm peut être ciblé. La cassette de régulation ARNs (sur un plasmide standard) a été montré pour travailler sur une variété de cibles dans le métabolisme avec des niveaux de répression typiques> 90% 8.
10. Tout d' abord, un phagemide emballé est introduit dans une culture de E. batch coli et les cellules utilisées pour réduire au silence l' expression de la protéine fluorescente mKate2. changements de fluorescence suivants sont surveillés en temps réel. Deuxièmement, abattre le gène CAT est indiqué pour réduire la résistance au chloramphénicol phénotypique sur des plaques d'agar-agar. Dans les deux cas, le phagémide lui-même porte un marqueur GFP, permettant ainsi le taux d'infection à mesurer indépendamment l'un de l'efficacité knock-down.
Protocol
1. Conception et construction des vecteurs phagémide Gardant ARNs Silencing Cassettes
- De Novo Conception d'ARNs Désactiv Cassettes 8
- Identifier la séquence complète de l'ARNm devant être réduit au silence en utilisant une base de données de séquence d'ADN. Pour générer la séquence cible, notez les 24 premières pb de la séquence codante, de la position 1-24 commençant par le codon de démarrage (par exemple, ATG).
Remarque: Taire est moins efficace lorsque d' autres sites ou des segments de l'ARNm sont ciblés 8. - Prenez le complément inverse de la séquence cible pour produire la séquence GUIDE pour la cassette ARNs. Voir le tableau 1 pour des exemples de TARGET et GUIDE séquences pour la chloramphénicol acétyltransférase (CAT).
- Pour concevoir le 292 pb cassette d'expression complète de ARNs, organiser le promoteur pR, séquence GUIDE, Hfq domaine de protéine de liaison et T1 / TE séquences de terminaison de transcription en série (tableau 2).
- Ajouter des sites de clonage supplémentaires de choix pour faciliter le clonage de la cassette d'ARNs dans le vecteur cible.
- Obtenir la cassette complète ARNs par synthèse génique commerciale ou une méthode similaire et cloner dans un vecteur phagémide avec une réplication origine f1 fonctionnelle 11. Voir d'accompagnement pour la séquence complète du vecteur phagemide final.
- Identifier la séquence complète de l'ARNm devant être réduit au silence en utilisant une base de données de séquence d'ADN. Pour générer la séquence cible, notez les 24 premières pb de la séquence codante, de la position 1-24 commençant par le codon de démarrage (par exemple, ATG).
- Modification de la séquence ciblée par une cassette d'expression d' ARNs existant en utilisant le site basé sur la PCR mutagenèse dirigée 12
- Identifier la séquence GUIDE 24 pb dans une cassette d'expression d'ARNs existante. Remarque: Le plasmide pAB.001 annotée, utilisée dans ce travail, est disponible sous forme de fichier de séquence supplémentaire.
- Conception avant et arrière amorces avec de courtes régions d'homologie à la cassette ARNs existante flanquant la nouvelle séquence GUIDE 24 pb. Obtenir les amorces à travers la synthèse d'oligonucléotides commerciale.
Remarque: la conception Primer pour la mutagenèse dirigée est depicted à la figure 2. séquences de matrice d'amorces exacte sont fournies dans le tableau 3. - Préparer une culture de 5 ml de E. coli portant le phagemide modèle ARNs d'expression. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans du milieu LB avec des antibiotiques appropriés.
- Extraire et purifier le modèle ARNs expression phagemide du 5 ml de culture bactérienne en utilisant un kit ADN miniprep ou méthode similaire 12.
- Préparer deux réactions PCR en utilisant le phagémide modèle d'expression d' ARNs et de haute fidélité de la polymerase, l' un avec l'avant et l' autre avec l'amorce inverse (tableau 4). Utiliser des conditions de PCR tel que recommandé par le fournisseur de la polymérase (tableau 5). Augmenter la concentration de matrice de 10-50x supérieur à une réaction classique pour tenir compte du fait que la réaction d'amorce unique ne produit pas une amplification exponentielle.
- Combiner les deux réactions de PCR ci-dessus dans un tube à microcentrifugation. Anneal les produits par chauffage à 98 ° C dans un bain d'eau bouillante. Immédiatement après avoir placé le tube de microcentrifugation dans le bain d'eau, retirer la source de chaleur et laisser le bain pour revenir lentement à la température ambiante pendant 1-2 heures.
- Pour éliminer le modèle d'ARNs non mutée expression phagemide, ajouter 1 pl. L'enzyme de restriction Dpnl au mélange et on incube à 37 ° C pendant 1 heure, ou le temps recommandé par le fabricant pour une digestion complète.
Remarque: DpnI digère les sites cibles ne méthylés, qui sont présents sur les phagemides hôte répliqué mais pas les produits de PCR. - Transform acheté ou préparé 13 E. chimiquement compétente coli avec 1 à 5 ul du produit de PCR recuit. Isoler des colonies uniques de la souche transformée par le placage sélectif sur des plaques d'agar LB contenant les antibiotiques appropriés.
- Pour vérifier l'incorporation de la séquence GUIDE correcte, cribler les colonies résultantes par PCR sur colonie. En utilisant une pointe de pipette 200 pi, collect une petite quantité de cellules à partir d'une seule colonie transformée. Mark et de préserver la colonie d'origine pour une utilisation en aval après vérification.
- Ajouter les cellules recueillies à 50 ul d'eau sans nucléase dans un tube à centrifuger. Mélanger par pipetage de haut en bas.
- En utilisant un thermocycleur de paillasse ou un bain d'eau bouillante, lyser les cellules par chauffage à 95 ° C pendant 2 min.
- PCR amplifient la région phagémide en utilisant 1 pi de cellules lysées à la chaleur en tant que matrice d'ADN. Les conditions de PCR et les protocoles du thermocycleur sont fournis dans les tableaux 6 et 7. Voir le fichier supplémentaire de séquence pAB.001 pour des séquences de vérification d'amorces.
- Séquencer le produit de PCR afin de vérifier l'incorporation de la séquence GUIDE correcte.
- Inoculer une culture de 5 ml de E. clone coli portant l'expression ARNs phagemide séquence vérifiée. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans un milieu LB sélectif.
- Préparer un stock de glycéroldu clone de la séquence vérifiée. Ajouter 750 ul de la culture d'une nuit à 250 pi de 60% de glycérol dans un tube de cryo bouchon à vis.
- Stocker le stock de glycérol à -80 ° C indéfiniment. Le reste de la culture d'une nuit peut être utilisée comme source pour l'expression de phagémide ARNs à l'étape 2.
2. Production et récolte des stocks de phagemides M13-emballés
- Préparer une culture de 5 ml de E. coli portant l'expression de phagémide ARNs. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans du milieu LB avec des antibiotiques appropriés. Note: L'expression de phagemide ARNs peuvent être obtenus par le biais de novo clonage comme décrit à l' étape 1.1.5, ou modifié à partir d' un phagemide existant et récolté à l' étape 1.2.16.
- De la même façon de préparer une culture de 5 ml de E. coli portant le plasmide auxiliaire M13KO7. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans un milieu LB sélectif.
- Extraire et purifier l'expressio ARNsn phagemide et le plasmide auxiliaire en utilisant un kit d'extraction d'ADN ou d'une méthode similaire 12.
- Co - transformer acheté ou préparé 13 E. coli chimiquement compétentes avec 1 ul de chacune des ARNs phagemide d'expression et le plasmide auxiliaire. Sélectionnez pour cotransformants par étalement sur gélose LB avec des antibiotiques sélectifs pour les deux constructions.
- Préparer une culture de 10 ml à partir d'une seule colonie de la souche cotransformé dans LB avec des antibiotiques sélectifs. Incuber à 37 ° C sous agitation pendant 8-12 heures ou toute la nuit.
- Centrifuger la culture à 3300 xg pendant 10 min. Recueillir le surnageant et le filtre à travers un filtre de 0,2 um. Attention: En cas de déversement de médias, nettoyer la zone avec l'eau de Javel diluée (0,5%) pour détruire les particules de phage infectieux.
- Rangez le filtrat phagemide emballé à 4 ° C. Note: Les échantillons peuvent être conservés pendant des jours ou des semaines sans perte d'activité.
3. Préparation des cellules F + cibles pour Silencing
- Déterminer si les cellules à cibler pour faire taire expriment le pilus F 14. Si le pilus F est déjà présent, passez à l'étape 4.
Note: les souches de laboratoire courantes de E. coli annotés comme F ou F + "pour indiquer la présence du pilus F dans leur génome ou un plasmide. - Obtenir une souche F + E. coli tel que TOP10F '.
Remarque: Assurez-vous que la souche cible porte un marqueur de résistance unique afin d'être séparé du donneur F-plasmide après conjugaison. - Pour introduire F pili par conjugaison avec une souche F +, préparer 5 ml de cultures à la fois la souche cible et donneur F-14 plasmide. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans du milieu LB avec des antibiotiques appropriés.
- Le lendemain, diluer les deux souches 1: 100 dans 5 ml de LB sélectif et continuer la culture à 37 ° C avec agitation.
- Déterminer la phase de croissance des cellules en mesurant l'optdensité ical de la culture à 600 nm (DO 600) à l' aide d' un spectrophotomètre de paillasse. Culture des cellules pendant environ 2 heures jusqu'à une DO 600 de 0,3 est atteint, ce qui indique une croissance en phase logarithmique 15.
- Préparer les réactions 3 de conjugaison dans des tubes à centrifuger: 0,5 ml F-plasmide souche donneur + 0,5 ml de cible, 0,5 donneur ml F-plasmidique + 0,5 ml de milieu LB (contrôle négatif) et 0,5 ml souche cible + 0,5 ml LB médias (contrôle négatif). Laisser la conjugaison se dérouler pendant 2 heures à 37 ° C avec agitation.
- Plaque 100 ul de chaque réaction de conjugaison sur agar sélectif LB avec des antibiotiques spécifiques au F-plasmide (généralement à la tetracycline) et la souche cible. Plate les réactions de contrôle négatif pour confirmer que ni donneur ou souche réceptrice expriment les résistances aux antibiotiques.
4. L'infection par phagemides packagées pour Silencing
- Inoculer une seule colonie de cellules cibles + F dans une culture de 5 ml de LB médiun avec des antibiotiques appropriés. Incuber une nuit à 37 ° C sous agitation.
- Le jour suivant, on dilue les cellules cibles F + 1: 100 dans 5 ml de milieu LB sélectif et continuer à la culture à 37 ° C sous agitation.
- Déterminer la phase de croissance des cellules en mesurant la densité optique de la culture à 600 nm (DO 600) à l' aide d' un spectrophotomètre de paillasse. Culture des cellules pendant environ 2 heures jusqu'à une DO 600 de 0,3 est atteint, ce qui indique une croissance en phase logarithmique 15. Note: L'expression de pili et de l'infection est le plus élevé d'efficacité F dans la phase logarithmique.
- Ajouter les phagemides M13-emballés (étape 2.6) aux cellules cibles dans un rapport en volume de 1: 100 pour obtenir une infection près de 99% de la population cible. Permettre à l'infection de se dérouler à 37 ° C avec agitation pendant 30 à 60 min.
- Doser les phénotype ARNs-silencing selon la méthode de choix.
Remarque: Pour une cible de protéine fluorescente, l'effet de silençage peut être quantifiéedirectement par fluorométrie 10. Alternativement, les tests phénotypiques peuvent être utilisés pour observer les conséquences phénotypiques de gène knockdown 8. - Préparer un stock de glycérol pour l'hôte phagemide ARNs exprimant suivant les étapes 1.2.14-1.2.16. Remarque: le phagemide va se propager dans la souche hôte indéfiniment et peut être maintenu avec un antibiotique semblable à un plasmide conventionnel.
Representative Results
Silencing de mKate2 Fluorescence dans les milieux liquides
La figure 1 illustre le schéma de passes rabattues ARNs médiation décrites dans ce travail, y compris la conception ARNs de cassette, vectorisation phagemide, et le mécanisme de silence. Suivant le protocole 1.2, la cassette ARNs taire du plasmide pAB.001 a été modifié pour cibler mKate. La cassette ARNs a été synthétisé et cloné dans phagemide Litmus28i_J23115-B0032-GFP, un don de Monica Ortiz et Drew Endy 11. Ce phagemide porte des marqueurs pour l'expression de GFP et la résistance à la kanamycine, ce qui permet d'infections réussies à suivre. stocks de phagemides emballés ont été préparés en suivant le protocole 2.
Un dérivé de E. coli K12 MG1655 portant, un marqueur mKate2 chromosomique intégré exprimé constitutivement a été préparé pour l' infection par le phage par conjugaison avec une souche plasmide donneur F suivant le protocole 3. Les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique moyen et le phagemide introduit suivant le protocole 4. Après l'infection phagemide, 200 cultures ul ont été transférés à un lecteur de plaque de fluorescence et la fluorescence a été contrôlée en continu pendant 24 heures.
La figure 3 montre l'effet de silençage ARNs à médiation par l'expression mKate2. La souche infectée par un phagemide anti-mKate2 montré aucune fluorescence mKate2 détectable sur fond. En revanche, cette souche a fait exprimer le marqueur GFP, indiquant l'absorption réussie du phagemide. des cellules témoins non infectées ont produit une fluorescence mKate2 mais pas GFP. Un contrôle supplémentaire, dans lequel le domaine de ciblage anti mKate2 a été remplacée par une séquence de ciblage CAT n'a eu aucun effet sur mKate2 fluorescence.
Silencing de la Résistance chloramphénicol sur des plaques d'agar
contenu "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Après le protocole 1.1, une cassette ARNs taire a été produit pour cibler CAT Un dérivé de E. coli K12 MG1655 portant un constitutivement exprimé, le chromosome marqueur CAT intégré a été préparé. l'infection par des phages par conjugaison avec une souche donneuse F-plasmide suivant le protocole 3. les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique moyenne et le phagémide introduit suivant le protocole 4. Après 1 h d'incubation à 37 ° C, les cellules infectées ont été dilués en série et étalés à une gamme de concentrations de chloramphenicol. les plaques ont été incubées pendant une nuit, et la proportion de cellules résistantes à chaque concentration chloramphenicol a été déterminée en comptant les unités formant colonie (CFU) le jour suivant.La figure 4 montre l'effet de silençage ARNs à médiation par le phénotype de résistance au chloramphénicol. Les cellules non infectées ou des cellules infectées par le phagemide ciblant mKate2, étaient résistants àchloramphénicol à toutes les concentrations testées. En revanche, les cellules infectées par le phagemide ciblant CAT ont montré une diminution de la survie à de faibles concentrations de chloramphénicol, et près de 99% tuant à des concentrations supérieures. L'ajout d'ampicilline, pour sélectionner uniquement les bactéries portant le phagemide, réduit la survie de chloramphénicol à des niveaux indétectables. Ceci est cohérent avec les travaux antérieurs montrant que la fuite de l' infection de phage est une voie commune pour échapper au silence 10.
Figure 1: Gene Silencing dans E. coli avec ARNs Expression Cassettes prononcé par M13 Phage La cassette ARNs se compose de 4 modules:. le promoteur pR (un promoteur constitutif dérivé du bactériophage lambda), un domaine de ciblage 24 pb, un domaine de liaison Hfq extrait de MICC et un terminateur transcriptionnel 8 E. coli exprimant le pilus F, où commence l' expression d' ARNs. Le ARNs recrute alors la protéine Hfq (représenté en rouge) et se lie à une cible d'ARNm antisens à proximité du site de liaison de ribosome, ce qui entraîne la répression traductionnelle et la dégradation de l' ARNm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Conception d' amorces et de mutagénèse dirigée du site cible ARNs Deux amorces sont conçues avec une homologie partielle avec une cassette d'ARNs existante. L'amorce sens contient 20 pb homologue au promoteur pR à l'extrémité 5 ', suivi par24 pb représentant la nouvelle séquence GUIDE, puis 18 pb homologue au domaine Hfq liaison à l'extrémité 3 '. L'amorce inverse est le complément inverse exacte de l'amorce vers l'avant, avec des régions d'homologie avec la cassette d'ARNs existant flanquant le complément inverse de la nouvelle séquence guide. Séquences d'amorces exactes sont indiquées dans le tableau 3. Les réactions de PCR unique amorces distinctes avec l'avant et les amorces inverses produisent linéaire, l' ADN simple brin avec la séquence modifiée souhaitée. Recuire la marche avant et arrière des produits de réaction, après nettoyage tel que décrit dans le protocole, les résultats de l'ADN double brin plasmide portant la cassette ARNs modifiée souhaitée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Knockdown d'un journaliste mKate2 Fluorescent intégré dans le chromosome. E. coli MG1655 K12 exprimant mKate2 étaient soit non traitées (lignes rouges et barres) gauche, infecté par un phagemide anti-mKate2 (lignes vertes et bars), ou infecté par un contrôle phagemide ciblant CAT (lignes bleues et bars). (A) non traitée E. coli a atteint des densités plus élevées de saturation, ce qui indique un coût métabolique à l' infection par des phages. Les lignes pointillées indiquent les écarts-types de 3 répétitions. (B) Le signal mKate2 a été réduite à des niveaux de fond près de l'anti-mKate2 traités souche, mais pas dans les souches de contrôle. (C) la fluorescence de GFP, également porté par le phagemide est détectable uniquement dans les contrôles traités par phagémide. (D, E) lectures de fluorescence finales après 24 h de la croissance ont été normalisées à OD. signal de GFP, indiquant une infection de phagemide, était absent dans les contrôles non traités, mais également sensiblement réduite à la suite anti-CAT ptraitement hagemid. Cela peut indiquer des effets hors-cible du phagemide. Le signal mKate2 a été réduite par un traitement anti phagémide mKate2 par rapport aux témoins non traités. Le contrôle phagemide CAT ciblée n'a montré aucun effet sur la mKate2 fluorescence. Les barres d'erreur représentent l' écart type de 3 répétitions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Knockdown de CAT Restaure chloramphénicol Sensibilité à une population génétiquement résistant E.. coli MG1655 K12 exprimant un gène CAT chromosomique intégré ont été laissés non traités (barres rouges), traité avec un phagemide de contrôle ciblant mKate2 (barres vertes), ou traité avec un phagémide exprimant un anti-CAT ARNs (barres bleues). Après 1 heure de l'infection, la viabilité sur la fourmi indiquéeibiotics a été évaluée par des dilutions en série et le placage. Les souches traitées avec un anticorps anti-CAT phagémide ont été tuées de manière significative (> 90%) par du chloramphénicol à des concentrations plus élevées, alors que les traitements témoins sont pas affectés. L'addition d'ampicilline aux plaques de culture sélectionne positivement l'infection par le phagemide et élimine les cellules non infectées. Dans ces conditions, aucune des colonies résistantes au chloramphenicol ont été observés après le traitement anti-CAT. Ceci indique que la plupart des survivants représentent un échec de l'infection, plutôt qu'une défaillance de silençage. Les barres d'erreur représentent l'écart type de 3 répétitions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| séquence TARGET CAT | 5 '- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3' |
| séquence GUIDE DE CAT | 5 '- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3' |
Tableau 1:. Une séquence exemple TARGET et GUIDE pour la CAT Gene Notez la relation de complément inverse.
| promoteur pR | TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC | ||||
| séquence GUIDE | ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT | ||||
| domaine de liaison Hfq | TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG | ||||
| T1 / TE terminateur | CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA | ||||
Tableau 2:. Composants de séquence de la cassette ARNs Chaque séquence est écrit 5'-3 '. La cassette complète est la concaténation de ces 4 éléments dans l'ordre et comprend 292 pb.
| Forward Primer | 5 '- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3' |
| amorce antisens | 5 '- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3' |
Tableau 3: Primer Conception à Alter éléments de guidage existants L'amorce sens comprend les derniers 20 pb du promoteur pR, la nouvelle séquence de GUIDE, et les 18 premières pb du domaine Hfq contraignant.. La séquence cible est le complément inverse exact de la séquence GUIDE. L'amorce inverse est le complément inverse exact de l'amorce sens.
Tableau 4: Suggestions Conditions pour le Single-Primer Mutagène PCR.
| Étape | Temp | Temps |
| dénaturation initiale | 98 ° C, | 30 sec |
| 30 cycles | 98 ° C, | 10 sec |
| 55 ° C, | 30 sec | |
| 72 ° C, | 120 s | |
| Extension finale | 72 ° C, | 300 s |
| Stockage | 10 ° C, |
Tableau 5: Protocole suggéré Thermocycleur pour le Single-Primer Mutagène PCR.
| Composant | Le volume |
| Patron de l'ADN | 1 ul |
| 10 Forward Primer uM | 0,5 ul |
| 10 amorce inverse iM | 0,5 ul |
| Taq 2X Master Mix | 25 ul |
| wate sans nucléaser | 23 pi |
| Volume total | 50 ul |
Tableau 6: Suggestions Conditions de la PCR de vérification de séquence.
| Étape | Temp | Temps |
| dénaturation initiale | 95 ° C, | 30 sec |
| 30 cycles | 95 ° C, | 30 sec |
| 55 ° C, | 30 sec | |
| 68 ° C, | 30 sec | |
| Extension finale | 68 ° C, | 300 s |
| Stockage | 10 ° C, |
Tableau 7: Suggestion Thermocycleur ProProtocole pour la PCR de vérification de séquence.
Discussion
Le présent procédé atteint 80% de réduction des niveaux de fluorescence mKate par rapport aux témoins non ciblés. Ceci est en ligne avec d' autres méthodes knockdown d'ARN, où silençage complète est pas observée et 50-90% d' efficacité est typique 16,17. Au niveau phénotypique, rabattues CAT ciblées ont pu atténuer de manière significative la résistance au chloramphénicol, et l'éliminer sous certaines conditions.
Le phénotype knockdown était détectable au niveau de la population après seulement un post-infection quelques heures (figure 3B). Ceci illustre une caractéristique importante de la livraison basée sur les phages: une fréquence knockdown élevée peut être obtenue directement en culture discontinue sans modification génétique préalable. A la différence des modifications génétiques classiques, en utilisant une transformation de plasmide ou d'intégration génomique, l'infection par le phage ne nécessite pas qu'une population re-cultivé à partir d'une seule colonie isolée. Ceci permet aux effets de l'infection par des phages pour être explored dans les populations dynamiques spatiales complexes 11, avec des structures spatiales préexistantes comme biofilms 18, ou dans les populations naturelles génétiquement mixtes 19.
Une étape cruciale dans cette méthode est la production de phagemide emballé à titre élevé. La charge métabolique associé à la production de particules de phage peut conduire à des taux élevés de mutation ou perte de plasmide dans la souche de production phagemide. Il est recommandé que la souche de production phagémide être cultivées directement à partir d'une seule colonie cotransformé et non réfrigérée, congelée ou sous-cultivées avant la récolte de phage. Une faible efficacité de la co-transformation peut également être observé lors de l' introduction du phagemide et le plasmide auxiliaire à E. coli simultanément. Dans ce cas, des rendements plus élevés peuvent être obtenus en transformant le plasmide auxiliaire d'abord, puis la préparation de cellules compétentes portant le plasmide auxiliaire pour la transformation ultérieure avec le phagémide.
Phainfection gemid ou l'expression d'ARNs impose aussi une charge métabolique détectable sur les cellules cibles, et peuvent entraîner une certaine perturbation phénotypique. Par exemple, une réduction de la fluorescence mKate2 n'a été observé même lorsque les cellules ont été infectées avec un phagemide de ciblage CAT (figure 3). L' infection par le M13 est pas pensé pour déclencher des réactions de stress systémiques dans E. coli 20, mais peut modifier les modèles de transcription indirectement. Alternativement, les marqueurs de la GFP ou de résistance à l'ampicilline inclus sur le phagémide peuvent concourir pour les ressources cellulaires, ce qui réduit l' expression mKate2 et la croissance 9. Enfin, la cassette elle-même ARNs peut modifier globalement les profils d'expression génique en dosant la protéine Hfq ou par le biais hors cible de l'ARNm silençage. Effets cibles Off sont fréquents dans l' ARNi in vivo ciblant 21-23, mais ils doivent encore être systématiquement étudiées pour ce système.
Une limitation de cette méthode est que les effi d'infectioncacité est inférieure à 100%, ce qui permet certaines bactéries non infectées à persister dans la population. Les résultats de ces travaux et les travaux antérieurs 10 suggèrent que les cellules non infectées représentent 1-10% de la population finale, et sont responsables de la plupart des phénotypes nonsilenced observées. Une variété de routes à M13-résistance sont connus, avec la perte étant mutationnelle la plus courante de l' expression des pili 24. À la lumière de ces limitations, les contrôles doivent être utilisés pour confirmer les taux d'infection élevés et l'efficacité knockdown.
Une autre limite potentielle pour certaines applications est le transfert occasionnel de contamination phage auxiliaire. Bien que M13K07 contient un signal d'encapsidation muté, il peut être encapsidé dans la capside du phage à basse fréquence et transféré dans les populations infectées, ce qui entraîne des cellules compétentes pour la production de phage et la propagation continue de phages au - delà de l'événement d'infection initiale 25. Les modifications apportées au phage auxiliaire ont prouvé leur efficacitéà la réduction des emballages non spécifiques, bien que parfois au détriment de la production de phage réduite 26.
Bactériophage Engineered sont devenus un outil indispensable pour E. biologie synthétique coli, permettant une livraison rapide de nouveaux gènes à une population croissante. Des travaux récents ont produit des circuits de communication intercellulaire 11 ou exprimé des facteurs de transcription pour supprimer la résistance aux antibiotiques voies 27. Le protocole présenté ici ajoute à une collection croissante d'outils qui permettent le contrôle de la physiologie bactérienne par ARNs programmées. Nucléases CRISPR-Cas, lorsqu'ils sont mutés pour éliminer l' activité nucléase, ont été montré pour réprimer la transcription sur des cibles de gènes ARN-guidée 17,28. En revanche, les ARNs silençage fonctionne au niveau de translation et ne nécessite pas l'expression de protéines exogènes. biotechnologies de nouvelle génération peuvent unir le contrôle de la transcription et de la traduction avec la livraison de phage médiée programmer phéno complexetypes en temps réel.
Acknowledgments
Le financement de ce travail a été fourni par la Fondation Bettencourt Schueller à l'appui de l'équipe de Paris Bettencourt iGEM. Nous remercions l'unité de recherche de U1001 INSERM et Chantal Lotton pour l'assistance technique et des conseils. Phagémide Litmus28i_J23115-B0032-GFP a été fourni par Monica Ortiz et Drew Endy de Stanford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
| M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
| DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
| LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
| Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
| Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G |
References
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