Introduction
Diğer hücrelere zarar vermeden özel hücrelerin ortadan kaldırılması özellikle kurulmuş doku olarak, son derece zordur ve doku mühendisliği alanında bir hücre eleme yöntemi için acil bir ihtiyaç vardır. 3 - Günümüzde rejeneratif tıp alanında, embriyonik kök hücreleri (ES), pluripotent kök hücrelerini (PSC), ya da uyarılmış pluripotent kök hücre (iPS) kullanarak doku kültürleri umut verici malzemeler 1 bulunmaktadır.
Bu doku rejenerasyonu umut verici olmasına rağmen, istenmeyen hücreleri ile kirlenme önemli bir husustur. Ayrıca, transplantasyon 4,5 sonra tümorijenisite 'nin güvenlik endişesi var. Birçok çalışmalar bu konular üzerinde duruldu olmasına rağmen özellikle rejeneratif tıp 6, belirli hücreleri ortadan kaldırmak için - 8, hiçbir pratik bir yöntem geliştirilmiştir.
Yakın Kızılötesi photoimmunotherapy (NIR PIT) bir antikor-photoabsorber conjugat göre bir tedavi yöntemie (APC). Bir APC hücreye spesifik monoklonal antikor (mAb) ve photoabsorber, IR700 oluşur. IR700 bir hidrofilik silika ftalosiyanin türevi ve tek başına 9 ile fototoksisite indüklemez. IR700 kovalent lisin molekülü yan zinciri üzerinde amid artıkları ile antikora konjuge edilir. APC hücre membran hedef molekülüne bağlanması ve daha sonra 690 nm 'de, NIR ışığa maruz kaldıktan sonra yaklaşık anında hücre nekrozunu indükler. 14 - NUR-ışık, hücre ölümüne 9 yol açan hücresel membran rüptürü maruz kalma sırasında. 21 - NIR PIT anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mezotelin, anti-GPC3 ve anti-CEA 15 de dahil olmak üzere birden fazla antikor ya da antikor fragmanları, etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, NIR PIT hedef moleküller, çok çeşitli karşı kullanılabilir. Ayrıca, NIR-PIT NIR ligh kısıtlayarak belirli bölgelerde seçici tedavi sağlayan bir iyi-kontrollü tedavit ışınlama 18,22.
Burada, karışık 3D kültürlerden gelen NIR PIT kullanarak belirli hücre eleme bir yöntem mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıdaki protokol NUR-PIT kullanarak belirli hücreleri ortadan kaldırmak için gereken adımları açıklar. Kontroller ve NUR-PIT ve hücre canlılığı ile ilgili diğer ayrıntıları başka bir yerde 18 bulunabilir.
Monoklonal antikorlara IR700 1. Konjugasyon (mAb)
- 2-5 mg / 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.6) çözeltisi içinde ml'de ilgi mAb hazırlayın.
- Mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 M Na 2 HPO 4 çözeltisi (pH 8.6) içinde 10 mM IR700 30.8 nmol olan mAb 6.8 nmol karıştırın ve alüminyum folyo ile kaplı 1 saat için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- iki kez 15 ml PBS ile PD-10 kolonu (Malzeme / Ekipman bkz: İçindekiler) yıkayın. Adım 1.2 numuneyi yükleyin.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, PBS ile akıtılarak PD-10 kolonu ile bir karışım saflaştınlır.
Not: Burada, elüsyon IR700 band rengi boyunca oldu. 300 ul örnek, PBS elüsyon fraksiyonu 4.4 ml, tipik olarak 2,5 ila ml'dir. - belirlemekBir spektrofotometre 9 595 nm'de emilimin ölçülmesiyle, Coomassie boyama ile protein konsantrasyonu. Her mAb molekülüne 9 konjuge florofor moleküllerinin sayısını onaylamak için 689 nm'de absorpsiyon ile IR700 konsantrasyonunu belirleyin.
Not: bir spektrofotometre ile 1 MAB'deki IR700 moleküllerinin optimal konjügasyon sayısını belirlemek için önemlidir. Genel olarak, 1 mAb molekül içinde 3 çevresinde IR700 molekülleri, in vitro ve in vivo çalışmaları en uygunudur. HPLC ve SDS-PAGE yöntemleri mAb ile IR700 bağlı olup olmadıklarını teyit etmek için kullanılabilir. - protein konsantrasyonu belirlendikten sonra 4 ° C'de saklayın.
Karışık 3D Hücre Kültürü 2. Hazırlık (spheroid Karışık)
- damla plakaları asılı levha rezervuar kısmına steril su (yaklaşık 1 ml) uygulayın.
- A431-luc-GFP hücreleri ve 3T3-RFP hücrelerini - çeşitli ilgi hücre tiplerinin oranları hazırlayın -Kültür ortamı, 50 ul içerisinde süspansiyon haline toplam 5000 hücreleri ihtiva eden her bir örnek ile.
Not: kültür ortamı daki hücre türlerinin oranı, hücre tipine bağlı olarak vb 100: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 1 hazırlayın. - 37 ° C ve% 5 karbon dioksit nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 96 gözenekli asılı bırakma plakasında 5-7 gün karışımı inkübe edin. 2 günde kültür ortamı değiştirin. Not: hücreleri içeren damlalar olarak, 3D tam küremsi yapmak hafifçe plaka işlemek için 3D şekiller oluşturan önce kolayca düşmek.
- 40X büyütme - 10X bir ters aydınlık mikroskop kullanılarak küremsi morfolojisi ve boyutunu dikkate alınmalıdır. Not: Bu hücre tipleri ve asılı damla büyüklüğüne bağlı olmasına rağmen, sfero çapı de damla plaka asılı 96'da kuluçkalamadan 7 gün sonra yaklaşık 400-600 um olduğundan emin olun.
Karışık 3D Hücre Kültürü için İn Vitro NUR-PIT 3.
- ha ortamı değiştirmek10 ug / ml antikor-photoabsorber konjügatı (APC) ihtiva eden ortama açılan levhalar donanımının değiştirilmesi, ve 37 ° C'de ve% 5 karbon dioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 6 saat inkübe edilir.
- 6 saat kuluçkalamadan sonra, taze kültür ortamı (fenol kırmızısı Free) ile iki kez sfero yıkayın. ucu kesilmiş hafifçe steril bir 200 ul pipet kullanarak 100 ul taze fenol kırmızısı ücretsiz kültür ortamı ile bir cam tabanlı 50 mm çanak sfero aktarın. Her yemeğin bir sfero yerleştirin.
- morfoloji değişikliği tespit etmek için ters aydınlık mikroskop ile sfero dikkate alınmalıdır. Aşağıdaki filtre ayarları ile floresan mikroskop kullanmak optik gazetecilere (örneğin, GFP ve RFP) gözlemlemek için: GFP - 469 nm uyarma filtresi ve 525 nm emisyon filtresi; RFP - 559 nm uyarma filtresi ve 630 nm emisyon filtresi.
- ışınlanması için cam tabanlı tabak üzerinde ışık yayan diyot (LED) koyun.
Not: küremsi NIR maruz kalabilirmikroskop veya laminer kaputu ya yanar.- Bir optik güç ölçer 9 NIR ışık güç yoğunluğunu ölçün. Bu ölçüme göre, 2 J / cm2 de 670 nm 710 dalga boylarında ışık yayan ışık yayan diyotlar (LED'ler) üzerinden NIR ışık saçmak.
Not: LED ışık yaklaşık 5 inç maksimum derinliği nüfuz edebilir. NIR PIT sitotoksik etkileri bağımsız olarak güç yoğunluğu ve maruz kalma 23 süresi, sadece belirli bir enerji bağlıdır.
- Bir optik güç ölçer 9 NIR ışık güç yoğunluğunu ölçün. Bu ölçüme göre, 2 J / cm2 de 670 nm 710 dalga boylarında ışık yayan ışık yayan diyotlar (LED'ler) üzerinden NIR ışık saçmak.
- Işık verilmesinden sonra taze kültür ortamı 50 ul yeni Asılı damla plakasına sfero aktarmak ve 37 ° C'de ve% 5 karbon dioksit, bir nemlendirilmiş inkübatörde 1 gün süreyle inkübe edilir.
- Yavaşça kesilmiş ucu ile steril 200 ul pipet kullanarak taze kültür ortamı (fenol kırmızısı ücretsiz), 100 ul bir cam tabanlı çanak sfero aktarın. NUR-PIT kullanarak fi sonra bir floresan mikroskop 1 gün sfero gözlemlemekltresi ayarları adım 3.3 tarif.
- Veya bir floresan mikroskobu (Şekil 2B) 14,18,22 kullanılarak sitoplazmik GFP floresans kaybı ile 2 ug / ml'lik bir son konsantrasyonda ortamına propidyum iyodür eklenerek ölü hücreleri algılar.
- Hedef hücreler tamamen ortadan değilse tekrarlayın 3,1-3,6 adımları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
optik olarak EGFR aşın NIR PIT, A431 hücre hattı, etkin olabilmesi için, genetik olarak GFP ve lusiferaz (A431-Luc-GFP) ifade etmek için modifiye edilmiştir. NIR PIT olmayan bir hedef olarak Balb / 3T3 hücre çizgisi optik RFP (3T3-RFP) ifade etmek için modifiye edilmiştir. APC panitumumab-IR700 (pan-IR700) sentezlendi. Hücreleri (A431-luc-GFP ve 3T3-RFP) çeşitli oranlarda oluşmuştur Karışık sferoidler, bu protokol (Şekil 1) 'e göre imal edildi. Tekrarlanan NIR PIT pan-IR700 (Şekil 2A'da rejim bakınız) ile inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Bu karma 3D kültüründen hedef hücre eliminasyonu elde ve floresan ve lusiferaz aktiviteleri (Şekil 2B, C) ile izlendi. Diğer yandan, hedef olmayan hücreler büyümeye devam etmiştir.
3D cep küresellerde Şekil 2. Hedef hücre eliminasyon (A431-luc-GFP ve 3T3-RFP hücrelerinin karışık sferoidler). (A) NIR PIT (2 J / cm2) rejimi gösterilir. NUR-PIT Tekrarlanan (B) tamamen karışık 3D sfero olarak, hedef olmayan hücrelere (3T3-RFP) hiçbir zarar ile hedef hücreleri (A431-luc-GFP) ortadan kaldırmıştır. Çubuk = 200 um. Lusiferaz aktivitelerinin (C) Niceleme (RLU oranı)hedef hücrelerde (n = her grupta 10 sferoidler) arasında gösterdi tamamen ortadan kaldırılması. Bu rakam, 18 modifiye edilmiştir. Veri ± sem aracı olarak ifade edilir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu NIR PIT kullanarak hedef olmayan hücrelere zarar vermeden karışık bir 3D hücre kültüründen spesifik hücre eliminasyonu için bir yöntem ortaya koymaktadır. Şimdiye kadar, hiçbir pratik hücre eleme yöntemi doku sağlandıktan sonra veya transplantasyon sonrasında bulunmamaktadır. Böylece, NIR-PIT bunu gerçekleştirmek için gelecek vadeden bir yöntemdir. APC 'ler mAb kendisi benzer farmakokinetiği göstermektedir, çünkü bu teknik, aynı zamanda, in vivo 18,22 yararlanılabilir. hedef hücre tipi, çeşitli APC ile uyarlanabilir. 21 - anti-EGFR, anti-PSMA, anti-mezotelin, ve anti-CEA dahil olmak üzere çeşitli antikorlar ya da antikor fragmanları, daha önce APC '15 olarak kullanıldı. Buna ek olarak, NIR radyasyon bölgesini değiştirme tedavi bölgeyi en aza indirebilirsiniz. Burada, hedef hücreler üzerinde lusiferaz aktivitesi miktarının ve floresan ile spesifik hücreler tamamen ortadan kaldırılması doğrulandı.
NUR-PIT böylece kritik bir nokta t, bir ışık tabanlı bir tedavidirışık enerjisi ve ters-kare yasa (adım 3.4) 'e göre, bu nedenle hücre nekrozu azalma beri NIR ışık kaynağı ve hedef arasındaki o mesafeyi. 3D doğrusu, plaka tedavi edilmelidir ve mümkün olduğunca nazikçe kuluçkaya sfero yapmak. damla içeren hücreleri kolayca tahrip ya da 3D şekiller oluşturan önce biraz şok düşmek vardır.
NUR-PIT birçok benzersiz avantajlara sahiptir. İlk olarak, NIR-PIT ZPT nedeniyle hücreler ve minimal hedef dışı birikimini hedef bağlayıcı oldukça spesifik yol IR700 hidrofil özellikleri, ebeveyn olmayan konjuge antikor benzer intravenöz farmakokinetik göstermektedir. Bu nedenle, daha doku naklinden sonra, NIR PIT NIR için ilgili bölgenin maruz bırakılarak, ardından APC'nin intravenöz enjeksiyon ile hedef hücrelerin tedavi edilebilir. İkinci olarak, NIR ışık UV veya görünür ışıktan daha dokuya daha derin nüfuz edebilir, bu nedenle, NIR-PIT yüzey değil, aynı zamanda enti sadece tedavi edilebileceğiyüzeyde NUR maruz nakledilen doku kalınlığı yeniden. Son olarak, NIR PIT sürekli sınırlama olmaksızın hedef hücreleri yok etmek için de kullanılabilir. Hedef hücreler, hücre yüzeyinde 18 hedef moleküllerin yeterli kopyalarını ifade bu yöntem yararlıdır.
Ancak, bu tekniğin bir kaç sınırlamalar vardır. Bu büyük bir molekül olduğu için İlk olarak, APC geçirgenliği sınırlıdır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, NIR PIT tedavisi ya da antikor fragmanları, 18,19,22 yararlanılabilir tekrarladı. Başka bir sınırlama ışık nüfuz olduğunu. NIR ışık düzgün in vitro kültürü, böyle bir hedef bölgeye yakın ışık kaynağını taşımak için fiberoptik ile sindirim endoskopi, bronkoskopi, ya da doğrudan torakoskopi olarak uyarlanmış yaklaşımları gerektirir in vivo tedaviye çeviri nüfuz edebilir rağmen.
NIR PIT daha adaptasyonların lokal ve spec hem de bu yöntemin kullanımı için izin verir26 - Böyle bağışıklık azaltılması veya tümör mikroçevrelerde 24 olarak birçok alanda, IFIC hücre ortadan kaldırılması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Kanser Araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | |
| Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates | 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) | HDP1096-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | |
| LED: L690-66-60 | Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) | L690-66-60 | |
| Vectibix (panitumumab) | Amgen (Thousand Oaks, CA, USA) | ||
| 35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm | Cellvis (Mountain View, CA, USA) | D35-10-0-N |
References
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).
- Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).
- Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143 (4), 508-525 (2010).
- Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).
- Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).
- Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).
- Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12 (1), 345 (2012).
- Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).
- Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).
- Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).
- Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).
- Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9 (11), 113276 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).
- Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
- Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).
- Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).
- Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).
- Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).
- Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14 (1), 389 (2014).
- Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).
- Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
