Summary
Vi præsenterer en protokol for at opnå celle-afledte matricer rige på ekstracellulære matrixproteiner, hjælp makromolekylære Crowders (MMC). Derudover præsenterer vi en protokol, som inkorporerer MMC i 3D organotypisk hud co-kultur generation, hvilket reducerer dyrkningstid samtidig opretholde løbetid på konstruktionen.
Abstract
Den glycoprotein familie af collagener repræsenterer de vigtigste strukturelle proteiner i den menneskelige krop, og er centrale elementer i biomaterialer, der anvendes i moderne tissue engineering. En teknisk flaskehals er aflejringen af collagen in vitro, som det er notorisk langsomt, hvilket resulterer i suboptimal dannelse af bindevæv og efterfølgende væv samhørighed, især i hudmodeller. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der indebærer tilsætning af differentielt størrelse saccharose copolymerer i skindet kulturer til at generere makromolekylær fortrængning (MMC), hvilket resulterer i en dramatisk forøgelse af kollagen deposition. Især dermale fibroblaster deponeret en betydelig mængde af kollagen I / IV / VII og fibronectin under MMC sammenlignet med kontroller.
Protokollen beskriver også en fremgangsmåde til decellularize overfyldte cellelag, udsætter betydelige mængder af ekstracellulær matrix (ECM), som blev tilbageholdt på kulturen overflade som vist ved immunocytochemistry. Total matrix masse og fordelingsmønster blev undersøgt under anvendelse interferens refleksioner mikroskopi. Interessant fibroblaster, keratinocytter og co-kulturer fremstillet celleafledte matricer (CDM) af varierende sammensætning og morfologi. CDM kunne bruges som "bio-stilladser" for sekundær celle såning, hvor den nuværende anvendelse af belægninger eller stilladser, typisk fra xenogene animalske kilder, kan undgås, og dermed bevæger sig i retning af mere klinisk relevant applikationer.
Derudover denne protokol beskriver anvendelsen af MMC i den neddykkede fase af en 3D-organotypiske hud co-kultur model, som var tilstrækkelig til at forøge ECM aflejring i dermo-epidermal junction (DEJ), især kollagen VII, hovedkomponenten forankringsorganer fibriller. Elektronmikroskopi bekræftede tilstedeværelsen af forankring fibriller i kulturer udviklet med MMC, sammenlignet med kontroller. Dette er væsentligt, da forankringsorganer fibriller tether dermis til epidermis dermedhar en foruddannet modne DEJ kan drage fordel hudtransplantation modtagere i form af graft stabilitet og samlet sårheling. Endvidere blev dyrkningstid kondenseret fra 5 uger til 3 uger for at opnå en moden konstruktion, når der anvendes MMC, reducere omkostningerne.
Introduction
Huden danner en beskyttende barriere ved at forhindre vandtab og patogen post. Den består af tre hovedkomponenter; de stromale rige dermis 1, en stratificeret epidermis 2,3,4 på toppen af det, og dermo-epidermal junction i mellem 5,6. Dermis består hovedsageligt af kollagen og elastiske fibre og er tyndt befolket med fibroblaster 7. I modsætning hertil er den celle-rige epidermis består af flere lag af keratinocytter. Keratinocytterne af inderste lag er proliferativ og tilvejebringe nye basale celler, som fornyer og erstatte terminalt differentierende keratinocytter, der konstant flytter til den udvendige mest lag af huden og har mistet deres kerner og cytoplasmatiske materiale, hvilket resulterer i en forhornede lag, som undergår afskalning.
Den dermale-epidermale krydset, en specifik type basalmembran, er en kompleks struktur bestående af indbyrdes forbundne matrixmolekyler, der tethers epidermis til dermis. Kollagen I fibre af dermis interlace med kollagen VII forankring fibriller, som er forankret til collagen IV rige lamina densa. Forankring filamenter (laminin 5, collagen XVII og integriner) til gengæld forbinde lamina densa med hemidesmosomer af basale keratinocytter. Basale keratinocytter (stratum basale) har kapacitet til at formere sig og forny, samt differentiere og stratificere at danne suprabasallagene; stratum spinosum, stratum granulosum, og endelig stratum corneum, som repræsenterer kontakt overfladen af huden med miljøet. Undervejs fra det basale lag til forhornede lag, keratinocytter skifter ekspressionsmønstre for cytokeratiner og endelig undergår apoptose og indkapsle sig i forhornede kuverter, skrog specifikke proteiner, som er kovalent tværbundet ved transglutaminase aktivitet.
Genskabelse hud og dets lag in vitro, herunder de komplekse strukturer dermal-epidermal krydset og dermal ekstracellulære matrix, og at emulere cornificering proces, har længe fascineret forskere og bioengineers som en udfordrende opgave. Der har været betydelige fremskridt i huden tissue engineering, for eksempel, den vellykkede udvinding af hudceller fra patientens biopsier og generering af huden organotypiske kulturer ved hjælp patient-afledte hudceller 8. Dog forbliver uløste problemer vedrørende dårlig sekretion af ekstracellulære matrix proteiner ved hudceller selv og resulterer i sub-optimale hudmodeller. Desuden den nødvendige tid til at generere 3D organotypisk hud co-kultur ved hjælp af de nuværende protokoller varierer mellem fire til otte uger, en tidsramme, der potentielt kan afkortes med indarbejdelsen af makromolekylære Crowders. Reduktion kultur tid sparer reagens omkostninger, reducerer forekomsten af celle ældning og reducerer ventetiden for patienten skal produktet bruges i klinikken.
t "> Makromolekylær fortrængning (MMC) involverer om særlige makromolekyler til dyrkningsmediet at generere ekskluderede volumen effekter. Disse påvirker enzymatiske reaktionshastigheder herunder den proteolytiske spaltning af prokollagen, der er langsomme under standard vandige dyrkningsbetingelser 9-13. Under MMC, enzymatiske reaktioner er fremskyndet uden at øge mængden af reagenser 14,15 resulterer i, i tilfælde af prokollagen spaltning, en forøget mængde af kollagen i-molekyler i overfyldte kulturer i sammenligning med Uncrowded kontroller 10. da omdannelsen af procollagen til collagen tillader dannelsen af kollagen samlinger, fibroblaster dyrket med MMC i 48 timer gav signifikant mere kollagen i sammenlignet med Uncrowded fibroblastkulturer overvåges i op til fire uger 11,16,17. Udover virkninger på enzymatiske aktiviteter, som påvirker dannelsen, stabilisering og remodellering af ECM, MMC også har vist sig at direkte forbedre og modulere kollagenfiberdannelse 18,19.Vi præsenterer her en metode til at forbedre den ekstracellulære matrix (ECM) produktion af hudceller, navnlig dermale fibroblaster og epidermale keratinocytter. Derudover viser vi, at den berigede ECM produceret under MMC i monolagskulturer kan decellulariserede og anvendt som rent celleafledt matrix (CDM).
Vi bruger en ikke-konventionelle tilgang til at visualisere og fuldt ud forstår ECM deponeret af hudceller dyrket med MMC. Interferens refleksioner mikroskopi anvendes typisk til at studere celle-matrix interaktioner eller celle-til-glas kontaktpunkter. Denne teknik blev anvendt i vores system til at se den samlede matrix aflejres på glasoverfladen. Interferens refleksioner mikroskopi blev koblet med fluorescerende immunfarvning for at opnå den mest mængden af information i form af ekstracellulær matrix komposition og mønster, i nærvær og fravær af MMC.
Organotypic hud co-kulturer er en klassisk metode til at modellere huden in vitro i en tredimensional kontekst. Mens todimensionale co-kulturer kan give væsentlige oplysninger, er det begrænset, når oversætte disse data og anvende det tilbage til et in vivo miljø, der er i sagens natur en tredimensionel struktur. Hud keratinocytter, i særdeleshed, er polariseret og indeholder apikale og basale segmenter, som er afgørende for homeostase og celle vedhæftning. Derudover er ekspressionen af typiske suprabasale proteiner i keratinocytter over det basale lag, såsom keratin 1, keratin 10 og filaggrin er kun til stede i løbet af lagdeling og terminal differentiering af keratinocytter. Som terminal differentiering er næppe til stede i typiske monolagskulturer er suprabasale proteinekspression normalt ikke nået i denne kultur-system. Derfor begynder organotypiske kulturer nedsænket i dyrkningsmediet, men derefter løftet til en luft-væske grænsefladen til at køre keratinocyte differentiering. Dette resulterer i ekspressionen af stratification markører, selv horndannelse og en generelt bedre afspejling af epidermal fysiologi. Mens andre grupper tidligere har genereret organotypisk hud co-kulturer med succes, har etableringen af en funktionel dermo-epidermal krydset zone været et problem. Her præsenteres en ny fremgangsmåde til dyrkning af organotypiske hud co-kulturer med en forbedret basalmembran, i sammentrængt tidsramme og uden at kompromittere modenhed af disse konstruktioner. Dette ville give huden mimetika til in vitro-modellering, studiet af huden biologi og et sortiment af screening-assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Makromolekylær Fortrængning i 2D hudceller Cultures
- Seed 50.000 celler (primære fibroblaster eller primære keratinocytter eller co-kultur af primære fibroblaster og keratinocytter) pr brønd af en 24-brønds plade. Seed celler i 1 ml af den tilsvarende celletype vækstmedier.
- Tillad celler til at adhærere natten over, i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2.
- Kassér gamle medier og erstatte med 1 ml frisk medium indeholdende makromolekylære Crowders og 100 uM ascorbinsyre. Brug en Crowder cocktail bestående af 37,5 mg / ml Ficoll 70 og 25 mg / ml Ficoll 400. Brug fibroblast medier (FM) bestående af DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin antibiotika. Grow keratinocytter i et serumfrit medium, KSFM eller CnT-57. Oprethold co-kulturer i en blanding af 50% FM og 50% serum-frie medier.
- Inkuber kulturer til 6 dage i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2, med et medie ændring hver 2 dage.
2. Fluorescerende Immunfarvning på hudceller Cultures
- Vask cellekulturer to gange med 1 x PBS.
- Fix cellekulturer med enten methanol eller paraformaldehyd (afhængigt af antistof-specifikationer).
- For Methanol Fiksering
- Aliquot 500 pi kold methanol til hver brønd og inkuberes ved -20 ° C i 10 min. Aspirer fiksativ og kassér methanol affald. Air tørre i en laminar stinkskab.
- For paraformaldehydfiksering
- Aliquot 500 pi 2% paraformaldehyd-opløsning til hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter. Aspirer fiksativ og kassér paraformaldehyd affald.
- Vask med 1x PBS, for tre vaske, 5 min per vask.
- Portion 1 ml 1x PBS i hvert hul.
- For Methanol Fiksering
- Fluorescerende Immunfarvning under anvendelse af antistoffer
- Aliquot 500 pi 3% bovint serumalbumin (fortyndet i 1 x PBS) i hver brønd. Der inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Aspirer blokerende opløsning og kassér.
- primært antistof
- Til billeddannelse direkte fra pladen: Portion 200 pi primære antistof (1: 100 fortynding i 10% gedeserum) opløsning til hver brønd og inkuberes i 90 minutter ved stuetemperatur.
- For dækglas: Alikvote 50 pi primære antistof (1: 100 fortynding i 10% gedeserum) opløsning på et fladt stykke Parafilm. Placer dækglas på Parafilm, med celle-side (del af dækglasset med celler) vendende opløsningen. Dæk hele celle-side, med ingen bobler. Inkuber i 90 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer primært antistof løsning og udsmid.
- Vask med 1x PBS, for tre vaske, 5 min per vask.
- sekundært antistof
- Til billeddannelse direkte fra pladen: Portion 200 pi sekundært antistof (1: 400 fortynding i 10% gedeserum) opløsning til hver brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur, der dækker pladen med aluminium fo il.
- For dækglas: Alikvote 50 pi sekundært antistof (1: 400 fortynding i 10% gedeserum) opløsning på et fladt stykke Parafilm. Placer dækglas på Parafilm, med celle-side (del af dækglasset med celler) vendende opløsningen. Dæk hele celle-side, med ingen bobler. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, dækker Parafilm med aluminiumsfolie.
- Aspirer sekundært antistof løsning og udsmid.
- Vask med 1x PBS, for tre vaske, 5 min per vask. Portion 1 ml 1x PBS i hvert hul.
- Montering
- For billeddannelse direkte fra pladen: ikke montere. Fortsæt til mikroskop.
- For billeddannelse af dækglas: Mount dækglas, i montering medier, på en glasplade. Tør natten over i en beholder dækket med aluminiumsfolie. Fortsæt til mikroskop.
- Anskaf billeder med en Konfokal Laser Scanning Microscope med en 40X / 1,30 Olie Mål.
- Vask cellelag to gange med 1 x PBS.
- Aliquot 100 ul lysepuffer (se Materialer List) i hver brønd (plade med 6 brønde format). Skrabe cellelaget med en celleskraber og overførsel opløsning i et mikrocentrifugerør.
- Centrifuge opløsning ved 15.330 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten overføres til et andet mikrocentrifugerør og kassere bundfaldet.
- Bland 13 pi af hver prøve med 5 pi prøvepuffer og 2 pi reduktionsmiddel (se Materialer List). Heat prøver ved 95 ° C i 10 min.
- Centrifuger prøverne ved 15.330 xg i 1 minut til opsamling af kondensvand. Indlæs prøver til et præ-støbt PAGE-gel og kørt ved 100 V i ca. 1 time.
- For at overføre adskilte proteiner til en nitrocellulosemembran, sandwich gelen og membranen mellem stykker papir og svampe (af samme størrelse). Sørg der er ingen bobler mellem gel, membran, papirer og svamps. Luk sandwich kassetten og køre overførslen ved 70 V i 2 timer.
- For at kontrollere om overførslen var færdig, inkuberes membranen med 10 ml Ponceau S. Vask membran med 0,1% PBS-Tween-20, tre gange, 10 min per vask.
- Blok med 10 ml 5% mælk i 1 time ved stuetemperatur. Vask membranen med 0,1% PBS-Tween-20, tre gange, 10 min per vask.
- Inkuber med 10 ml primært antistof i 90 minutter (muse-anti-collagen VII, LH 7,2, 1: 1,000 fortynding i 5% mælk). Vask membranen med 0,1% PBS-Tween-20, tre gange, 10 min per vask.
- Inkuber med 10 ml sekundært antistof i 30 minutter (gede-anti-muse-HRP, 1: 2.000 fortynding i 5% mælk). Vask membranen med 0,1% PBS-Tween-20, tre gange, 10 min per vask.
- Membranfilteret overføres til en kassette, og der tilsættes 1 ml ECL Detection Reagent. Placer en klar, tynd plastplade over membranen.
- For at detektere kemiluminescens, placere en lysfølsom film over plastpladen og lukke kassetten. efter 2-5 Min, fjerne filmen fra kassetten og læg det i en udvikler.
4. fremstilling og anvendelse af en celle-afledt Matrix
- Seed 50.000 celler (primære fibroblaster eller primære keratinocytter eller co-kultur af primære fibroblaster og keratinocytter) pr brønd af en 24-brønds plade.
- Tillad celler til at adhærere natten over, i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2.
- Kassér gamle medier og erstatte med friske medier, der indeholder makromolekylære Crowders og 100 uM ascorbinsyre. Den Crowder cocktail består af 37,5 mg / ml Ficoll 70 og 25 mg / ml Ficoll 400. fibroblast medier (FM) består af DMEM suppleret med 10% FBS og 1% pen-strep. Keratinocytter dyrkes i et serumfrit medium, KSFM eller CnT-57. Oprethold co-kulturer i en blanding af 50% FM og 50% KSFM eller CnT-57.
- Inkuber kulturer til 6 dage i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2, skiftende medier hver 2. dag.
- Decellularize cellelag for at opnå en celleafledt matrix (f-mat = fibroblast-afledte matrix, k-mat = keratinocytafledt matrix, co-mat = matrix afledt af en co-kultur af fibroblaster og keratinocytter).
- Vask cellelag to gange i 1 x PBS.
- Tilsættes 250 pi 0,5% natriumdeoxycholat. Der inkuberes på is i 10 min. Aspirer cellelysat.
- Gentag trin 4.5.2 tre gange.
- Wash celleafledt matrix to gange i destilleret H2O Hold celleafledt matrix i 1x PBS. Matricer kan opbevares i op til 1 uge ved 4 ° C.
- Forbered Sekundær Cell Suspension (For eksempel, Seeding Keratinocytter på toppen af f-mat).
- Aspirer 1x PBS.
- Seed 50.000 keratinocytter oven på celleafledt matrix (f-mat). Tillad celler til at adhærere natten over, i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2.
Bemærk: Assays kan udføres direkte på adhærerende celler.
5. Karakterisering af celle-afledt Matrix
- Fluorescerende immunfarvning: Se protokol 2.
- Interferens Reflection Microscopy
- Seed celler på til dækglas, følgende protokol 4.1-4.5.
- Efter at have indhentet celle-afledte matrix, fix prøver følgende protokol 2.2.
Bemærk: antistoffarvning er valgfrit. Hvis det er nødvendigt, se protokol 2.3. - Udfør erhvervelse billede ved hjælp af en konfokal laser scanning mikroskop med en 40X / 1,30 olie mål. Indstil pinhole på 74 mm.
- Brug LP 505 for interferens refleksion mikroskopi (IRM) kanal og BP 575-615 IR for fl uorescence røde kanal for filtre. Brug NT 80/20 for IRM kanal og HFT 405/488/561, NFT 565, plade til fl uorescence røde kanal for stråledelere. Brug følgende lasere: DPSS 561-10 (bølgelængde 561 nm) på 1,1% strøm til fl uorescence røde kanal og HeNe633 (bølgelængde 633 nm) på 5,0% strøm til IRM kanal.
6. 3D organotypiske Skin Co-kultur
- Kastet en kollagengel, med fibroblaster Encapsulated, i en celle-kultur Insert (6-brønds pladeformat).
- Alikvot 10 ml rotte hale collagen type I til en kold bægerglas.
- Tilsæt 1 ml kold DMEM. Tilsæt 0,5 ml 1 M NaOH for at neutralisere den sure collagen. Tilsæt 0,5 ml fibroblast suspension (indeholdende 1.200.000 fibroblaster).
- Overfør opløsningen, i et koldt pipette til celle-kultur skær inden for en 6-brønds plade. 12 ml totale opløsning jævnt opdelt i 6 celle-kultur skær.
- Inkubér gelen i en 37 ° C inkubator ved 5% CO2, i 1 time.
- Efter at gelen er størknet, nedsænkes gelen i FM. Efter 24 timer, kassere de gamle medier og erstatte med frisk medium, der indeholder makromolekylære Crowders. Tilføj et volumen på 2 ml til cellens indre-culture insert og 2 ml til ydersiden af cellen-kultur insert.
- Efter 24 timer,Seed Keratinocytter oven på kollagengelen.
- Trypsinisér keratinocytter under anvendelse 0,125% trypsin / chelateringsmiddel i 5 minutter ved 37 ° C. Tap sider af kolben forsigtigt for at fjerne celler og neutralisere trypsin med serum indeholdende medier. Tæl celler og forberede keratinocyt suspension (300.000 keratinocytter pr gel og suspenderet i 200 pi medier).
- Aspirer gamle medier fra celle-kultur insert. Tilføj keratinocytter på toppen af gelen.
- Inkubér gelen i en 37 ° C inkubator ved 5% CO2, i 1 time.
- Efter keratinocytter har bundet til geloverfladen, nedsænkes gelen med 2 ml KSFM eller CnT-57 til indersiden af cellen-culture insert og 2 ml FM til ydersiden af cellen-kultur insert.
- Efter 24 timer, kassere de gamle medier og erstatte med frisk medium, der indeholder makromolekylære Crowders.
- Efter 7 dages nedsænket kultur, hæve kulturen til en luft-væske-grænsefladen.
- Overfør celle-kultur insERT til en dyb-brønds plade. Tilsæt 10 ml lagdeling medier til ydersiden af cellen-kultur insert. Hold cellens indre-culture insert tør.
- Inkuber kulturer i et 37 ° C inkubator ved 5% CO2 og ændre medier hver 3 dage, i de næste 14 dage.
Bemærk: Efter 2 uger på luft-væske grænsefladen, svarer hud er modent og kan høstes (enten snap frosset eller formalin fast).
7. Høst og karakterisering af organotypiske hudækvivalenter
- Aspirer lagdeling medier.
- Ved hjælp af en pincet, overføre kulturen indsætter på et stykke køkkenrulle og dup væk resterende medier fra bunden af indsatsen.
- Ved hjælp af en skalpel, skæres langs den indre omkreds af kulturen insertet.
- Fastgør organotypiske hud co-kultur (sammen med PET-membran).
- Snap Freeze
- Overfør gelen konstruktionen til en kryoformen. Dæk det indre af kryoformen med oktoberforbindelse. Placer kryoformen i flydende nitrogen i 10 sek.
- Ved hjælp af en pincet, fjern den frosne kryoformen fra flydende nitrogen, pak i alufolie og gemme frosne prøver i en -80 ° C fryser.
- Afsnit frosne prøver med en kryostat, med et afsnit tykkelse på 7 um.
- formalinfiksering
- Placer en "biopsi skuresvamp 'i den" biopsi kassette «. Overfør gelen konstruere onto skuresvamp. Placer en anden svamp pude forsigtigt på toppen af gelen konstruktionen. Luk kassetten.
- Fuldt nedsænkes kassetten i 10% neutral bufret formalin i 48 timer ved stuetemperatur. Fjern kassetten, og kassér formalin affald.
- Indlejre den faste prøve i en voks blok ved først dehydrering med en ethanol-serien og derefter gradvist infiltrere prøven med voks. § voks blok med en mikrotom.
- Snap Freeze
- Karakterisering af huden Equivalent
- immunfarvning
- For frosne Sektioner:
- Inkuber sektioner i 10% gedeserum (fortyndet i 1 x PBS) i 1 time ved stuetemperatur. Vask sektioner i 1x PBS til fjernelse af gedeserum.
- Inkuber sektioner med primært antistof (1: 100 fortynding i 10% gedeserum) i 90 minutter ved stuetemperatur. Vask sektioner i 1x PBS, tre gange, 5 minutter per vask.
- Inkuber sektioner med sekundært antistof (1: 400 fortynding i 10% gedeserum) i 30 minutter ved stuetemperatur, i en beholder dækket med aluminiumsfolie. Vask sektioner i 1x PBS, tre gange, 5 minutter per vask.
- Mount glider, med montering medier, på en dækglas. Cover prøver med aluminiumsfolie og lad dem tørre natten over.
- Billede anvendelse af et konfokalt mikroskop med en 40X / 1,30 olie mål.
- For Formalin Fast paraffinindlejret Sektioner:
- Afvoksning sektioner (og rehydrere) i faldende procentdele ethanol til vand (Xylen - 100% ethanol- 90% ethanol - 80% ethanol - 70% ethanol - vand). Fuldt nedsænkes prøverne i opløsninger. Hver afvoksning skridt bør være 3 min.
- Inkuber sektioner i 1% hydrogenperoxid i 30 min. Vask sektioner i 1x PBS i 5 min.
- Inkuber sektioner i citratopløsning (10 ml citratopløsning opløses i 90 ml vand) ved 120 ° C i 20 min. Tillad objektglas at afkøle natten over ved stuetemperatur. Vask sektioner i 1x PBS, tre gange, 5 minutter per vask.
- Inkuber sektioner i 10% gedeserum (fortyndet i 1 x PBS) i 1 time ved stuetemperatur. Vask sektioner i 1x PBS til fjernelse af gedeserum.
- Inkuber sektioner med primært antistof (1: 100 fortynding i 10% gedeserum) i 90 minutter ved stuetemperatur. Vask sektioner i 1x PBS, tre gange, 10 min per vask.
- Inkuber sektioner med HRP-mærkede polymer (ufortyndet) i 30 minutter, ved stuetemperatur. Vask sektioner med 1x PBS, tre gange, 10 min per vask.
- Til et mikrocentrifugerør, kombinere 1 mlDAB Substrat (3,3'-diaminobenzidin) med 1 dråbe chromogen. Inkuber afsnittene med denne løsning i 15 sek - 5 min (brun farve = positivt signal).
- At standse reaktionen, vaskes sektionerne i rindende vand.
- Kontrastfarve kerner med hematoxylin, i 5 min. Skyl sektioner i rindende vand.
- Inkuber sektioner i sur alkoholopløsning, i 1 minut. Skyl sektioner i rindende vand.
- Inkuber sektioner i Scotts postevand løsning, i 2 min. Skyl sektioner i rindende vand.
- Valgfrit: Inkubér sektioner i eosin i 1 min og vask i rindende vand.
- Dehydrere sektioner i stigende procentdele af ethanol til xylen (70% ethanol - 80% ethanol - 90% ethanol - 100% ethanol - xylen). Sørg for, at prøverne er fuldt nedsænket i 3 min pr scenen.
- Mount dias, ved hjælp af montering medier, til et dækglas. Air tør natten over.
- Billede anvendelse af et konfokalt mikroskop med en 40X / 1,30 olie mål.
- For frosne Sektioner:
- Transmission Electron Microscopy (at visualisere Forankring Fibriller)
- Fix prøver i 2,5% glutaraldehyd i 72 timer.
- Vask prøver i 1x PBS, tre gange, 10 min per vask.
- Skåret i små stykker (1 mm3). Post-fix prøver i 1% osmiumtetroxid, pH 7,4, i 1 time ved stuetemperatur. Vask prøverne i destilleret vand.
Forsigtig: Osmiumtetroxid er giftig og giftigt og bør håndteres forsigtigt i et stinkskab. - Dehydrere prøver gennem en stigende ethanol-serien (25% ethanol - 50% ethanol - 75% ethanol - 95% ethanol - 100% ethanol - acetone) i 20 min per trin.
- Infiltrere ved opblødning prøver i 100% acetone: Araldite resin (1: 1) i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter ved 1: 3 i 1 time, efterfulgt af 1: 6 natten over. Soak prøven i frisk araldite harpiks i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af en anden ændring af frisk Araldite harpiks i 1 time ved 40 ° C. Lad den tredje frisk enraldite harpiks ændring i 1 time ved 45 ° C og lade den fjerde frisk Araldite resin ændring i 1 time ved 50 ° C.
- Inkuber prøverne ved 60 ° C i 24 timer for at tillade polymerisering.
- Afsnit prøver under anvendelse et glas kniv, til opnåelse semi-tynde sektioner med en tykkelse på 1 um. Stain sektion med methylenblåt for at observere histologi. § prøven for at opnå ultra-tynde sektioner af 70 nm og indsamle hver sektion på en kobber gitter.
- Farv sektioner med 5% uranylacetat opløsningen i 15 minutter efterfulgt af 3% blycitrat opløsningen i 10 minutter.
- Anskaf billeder med en transmission elektron mikroskop (100 kV), ved en forstørrelse på 30.000 X.
- immunfarvning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Macromolecular fortrængning kunne forbedre ECM deposition, navnlig fibroblaster deponeret mere kollagen I, IV og fibronektin sammenlignet med kontrolkulturer (Figur 1, Cell lag; 1A, collagen I, 1B, collagen IV, 1C, fibronectin). Ved decellularization, det var tydeligt, at fibroblaster var de vigtigste indskydere kollagen I, IV og fibronektin i forhold til keratinocytter (figur 1, Matrix).
I figur 2 blev det observeret, fibroblaster snarere end keratinocytter var de vigtigste producenter af kollagen VII. Dette er den første rapport af kollagen VII deponeret held in vitro (Benny et al, 2015).
Cellen-afledte matrix blev karakteriseret ved immunfluorescens via bestemte Antiboderne. Mens dette er et klassisk tilgang, var det vigtigt at visualisere ECM i sin helhed, og fuldt ud forstår effekten af de makromolekylære Crowders. Brug af interferens refleksioner mikroskopi (IRM), blev det fulde omfang af matrixen indfanget (figur 3). En overlejring af antistoffet farvning med IRM billede viser den relative mængde af denne ECM komponent i forhold til den totale mængde af ECM.
I en 3D in vitro hudmodel, MMC kondenseret kulturen tid fra 5 uger til 3 uger for at opnå en moden organotypisk hud co-kultur (figur 4). En hematoxylin og eosin-farvning viste, at efter 3 uger, kulturen med makromolekylære Crowders bestod af et pluri-stratificeret epidermis og stromale rige dermis sammenlignet med Uncrowded kontrolkulturer, som manglede en helt differentieret epidermis. Desuden blev intens og kontinuerlig kollagen VII immunofarvning detekteres ved dermal-epidermal krydset af overfyldte cellekulturer, sammenlignet med en svag og plettet kollagen VII immunofarvning i kontrolkulturer. Transmissionselektronmikroskopi (figur 5) viste tilstedeværelse af forankring fibriller i organotypiske kulturer, der viser funktionel kollagen VII.
Figur 1: Blandet makromolekylære fortrængning (mMMC) øger aflejringen af dermal-epidermale junction komponenter in vitro (A) Collagen I deposition forstærkes af mMMC (cellelag og matrix) på kun fi broblasts.. Fortrængning af co-kulturer producere de mest kollagen I og viser, at keratinocytter stimuleret kollagen I produktion af fi broblasts. (B) Collagen IV aflejring af fi broblasts forstærkes af fortrængning. Dette ses endnu tydeligere i overfyldte co-kulturer. Notatet keratinocytes farvet for collagen IV show meste celleassocieret eller intracellulær kollagen IV, men ikke en pericellulær matrix. I co-kulturer, begge celletyper adskille med kollagen IV bliver overvejende forbundet med fi broblasts besparende keratinocytkulturer øer. (C) Fibronectin deposition blev kun set med fi broblasts, og deri stærkt forbedret ved fortrængning (cellelag og matrix). I co-kulturer blev en reticular maskestørrelse på fi bronectin forbundet med kun fi broblasts, skåner øer af keratinocytter. Scale barer = 20 pm. Dette tal er blevet ændret fra Benny et al., 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Blandet makromolekylære fortrængning (mMMC) letter aflejring afforankring fi bril bygning kollagen VII. (A) En retikulære deposition mønster af kollagen VII deposition er tydelig med fi broblasts kun under mMMC. I co-kulturer, er ekstracellulær kollagen VII stærkt forbundet med fi broblast kolonier mellem keratinocyt øer. Keratinocytter viser pericellulært og intracellulær kollagen VII stærkere udtrykt i nærvær af mMMC. Efter cellelysis, er kollagen VII fodspor ses i en fi ne kornet lag i mMMC-behandlede fi broblast kulturer, men en mærkbar fi brillar deposition hentes fra co-kulturer. (B) Immunoblotanalyse af lyserede cellelag viser, at både overfyldte fi broblasts og keratinocytkulturer indeholder signifikant mere kollagen VII i forhold til uncrowded kontroller. Den hentede kollagen VII hovedsagelig pericellulært afledt. (C) Densitometrisk analyse af B viser, at mMMC forøger mængden af celle-associeretd kollagen VII med en faktor 8 i fi broblasts og en faktor 2 i keratinocytter. Scale barer = 20 pm. Dette tal er blevet ændret fra Benny et al., 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fibroblast fodspor indeholder mere samlet ECM som visualiseres ved interferens refleksion mikroskopi (IRM) Ved analyse af de enkelte ECM komponenter (kollagen IV og fi bronectin), kultur under mMMC forbedret ekstracellulær aflejring.. For at visualisere den samlede ECM deponerede, blev IRM anvendes til at kvantificere alle ECM som antistof farvning havde sine begrænsninger. IRM viste klart den samlede matrix mængde og mønster under mMMC i forhold til kontrol betingelser. Scale bar = 20 um. Dette tal har væretmodificeret fra Benny et al., 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Blandet makromolekylære fortrængning (mMMC) under den neddykkede fase øger modning af dermal-epidermal krydset (DEJ) i huden ækvivalenter fibroblast-holdige kollagengeler blev podet med keratinocytter på toppen og holdt neddykket i 1 uge, derefter løftes til en luft-væske-grænsefladen. I den klassiske protokol, collagen VII (grøn) var til stede efter i alt 3 uger i kultur, men dukkede op i hudækvivalenter efter 5 uger. I modsætning hertil under mMMC, collagen VII var allerede stærkt tydelig efter 3 uger og endnu stærkere farvet efter 5 uger sammenlignet med standard kulturer. Hematoxylin og eosin (20X forstørrelse) farvning cpå fi RMED, at med denne hurtige protokol, strati fi kation og modenhed af tilsvarende hud blev opretholdt og fremskyndes. Scale bar = 100 um. Dette tal er blevet ændret fra Benny et al., 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Dokumentation for de novo-dannelse af forankring fi brils i hudækvivalenter fremkommet under mMMC Ultrastrukturelle studier af den spirende dermal-epidermal krydset af organotypiske co-kulturer efter en 3 ugers kultur protokol med mMMC (A, B) antyder strukturer beslægtet med forankring fi brils (pile), der er fraværende i ikke-overfyldte hud ækvivalenter (C) efter 3 ugers kultur. Dette tal er blevet ændret frabout Benny et al., 2015. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
