Summary
Nous présentons un protocole pour obtenir des matrices dérivées de cellules riches en protéines de la matrice extracellulaire, en utilisant Crowders macromoléculaires (MMC). En outre, nous présentons un protocole qui incorpore MMC dans organotypique génération de co-culture de la peau 3D, ce qui réduit le temps de la culture tout en maintenant la maturité de la construction.
Abstract
La famille des collagènes glycoprotéine représente les principales protéines structurales dans le corps humain, et sont des composants essentiels de biomatériaux utilisés dans l'ingénierie tissulaire moderne. Un goulot d' étranglement technique est le dépôt de collagène in vitro, comme il est notoirement lent, entraînant une sous-optimale la formation du tissu conjonctif et de la cohésion du tissu ultérieur, en particulier dans les modèles de peau. Ici, nous décrivons un procédé qui comprend l'addition de co-polymères de saccharose différentiellement taille des cultures de peau pour générer entassement macromoléculaire (CMM), qui se traduit par une amélioration spectaculaire du dépôt de collagène. En particulier, des fibroblastes dermiques déposé une quantité importante de collagène de type I / IV / VII et de la fibronectine sous MMC par rapport aux témoins.
Le protocole décrit également un procédé pour decellularize couches de cellules encombrées, exposant ainsi des quantités importantes de la matrice extracellulaire (ECM) qui ont été retenus sur la surface de culture comme en témoigne immunocytochemistry. motif total de masse et la distribution matrice a été étudiée en utilisant la microscopie interférence de réflexion. matrices intéressant, les fibroblastes, les kératinocytes et les co-cultures produites dérivées de cellules (MDP) de la composition et de la morphologie variable. MDP pourrait être utilisé comme «bio-échafauds» pour l'ensemencement des cellules secondaire, où l'utilisation actuelle des revêtements ou échafauds, généralement à partir de sources animales xénogéniques, peut être évité, déplaçant ainsi vers plus cliniquement pertinente des applications.
En outre, ce protocole décrit l'application de MMC pendant la phase immergée d'une peau modèle 3D organotypique co-culture qui était suffisant pour améliorer le dépôt de l'ECM dans la jonction dermo-épidermique (JDE), en particulier le collagène VII, le composant majeur des fibrilles d'ancrage. La microscopie électronique a confirmé la présence de fibrilles d'ancrage sur des cultures développées avec MMC, par rapport aux témoins. Cela est important car fibrilles d'ancrage d'attache du derme à l'épiderme, par conséquent,ayant une maturité DEJ préformé peut bénéficier receveurs de greffe de la peau en termes de stabilité du greffon et la guérison globale de la plaie. En outre, le temps de la culture a été condensé de 5 semaines à 3 semaines pour obtenir une construction mature, lorsque vous utilisez MMC, en réduisant les coûts.
Introduction
La peau forme une barrière protectrice en empêchant la perte d'eau et de l'entrée de l'agent pathogène. Il est constitué de trois composants principaux; les stromales riches derme 1, un épiderme stratifié 2,3,4 sur le dessus de celui - ci, et la jonction dermo-épidermique entre 5,6. Le derme est composé en grande partie de collagène et des fibres élastiques et est peu peuplé avec des fibroblastes 7. En revanche, l'épiderme riches en cellules est composé de plusieurs couches de kératinocytes. Les kératinocytes de la couche interne, la plupart sont proliférative et fournissent de nouvelles cellules basales qui renouvellent et remplacent les kératinocytes de différenciation terminale qui se déplacent constamment à la plus externe couche de la peau et ont perdu leurs noyaux et de matériel cytoplasmique, résultant en une couche cornée qui subit desquamation.
La jonction dermo-épidermique, un type spécifique de la membrane basale, est une structure complexe composée d'interconnexion molécules de la matrice, ce qui tethers l'épiderme au derme. fibres de collagène I du derme entrelacent avec le collagène VII fibrilles d'ancrage qui sont ancrés au collagène IV riche lamina densa. filaments d'ancrage (de la laminine 5, collagène XVII et intégrines) à son tour relient la lamina densa avec hémidesmosomes de kératinocytes basales. kératinocytes basales (stratum basale) ont la capacité de se multiplier et renouveler, ainsi que différencier et stratifier pour former les couches suprabasales; stratum spinosum, stratum granulosum, et enfin la couche cornée, qui représente la surface de la peau de contact avec l'environnement. En route à partir de la couche basale de la couche cornée, les kératinocytes passer les profils d'expression des cytokératines et enfin l'apoptose et s'enveloppent dans cornified des enveloppes, des coques de protéines spécifiques qui sont de manière covalente réticulés par activité transglutaminase.
Recréer la peau et de ses couches in vitro, y compris les structures complexes du jonction dermo-épidermique et dermique matrice extracellulaire, et d'imiter le processus de kératinisation, a les scientifiques et les bioingénieurs longtemps intrigué comme une tâche difficile. Il y a eu des avancées significatives dans la peau du génie tissulaire, par exemple, l'extraction réussie de cellules de la peau à partir de biopsies de patients et la génération de cultures organotypiques de la peau en utilisant des cellules de la peau des patients dérivés 8. Cependant, les problèmes irrésolus restent relatifs à une mauvaise sécrétion des protéines de la matrice extracellulaire par les cellules de la peau et se traduit par des modèles sous-optimaux peau. En outre, le temps nécessaire pour générer la co-culture de la peau organotypique 3D en utilisant des protocoles actuels varie entre quatre à huit semaines, un délai qui pourrait éventuellement être raccourci avec l'incorporation de Crowders macromoléculaires. La réduction du temps de culture permet d'économiser le coût d'un réactif réduit l'incidence de la sénescence cellulaire et réduit le temps d'attente du patient, si le produit est utilisé en clinique.
t "> macromoléculaire entassement (MMC) consiste à introduire des macromolécules spécifiques au milieu de culture pour générer des effets de volume exclu. Ceux - ci affectent les taux de réaction enzymatique , y compris le clivage protéolytique de procollagène qui est en retard dans des conditions de culture aqueuses standards 9-13. Sous MMC, les réactions enzymatiques sont empressa sans augmenter la quantité de réactifs 14,15 entraînant, dans le cas du procollagène clivage, une plus grande quantité de collagène de molécules I dans des cultures encombrées par rapport aux témoins 10 uncrowded. comme la conversion du pro - collagène au collagène permet la formation de collagène assemblées, les fibroblastes cultivés avec MMC pendant 48 heures ont donné beaucoup plus de collagène I par rapport aux cultures de fibroblastes uncrowded surveillés jusqu'à quatre semaines 11,16,17. outre les effets sur les activités enzymatiques qui affectent la formation, la stabilisation et le remodelage de l' ECM, MMC a également a été montré pour améliorer et moduler le collagène directementla formation de fibres 18,19.Nous présentons ici une méthode pour améliorer la production de la matrice extracellulaire (ECM) par des cellules de la peau, en particulier, les fibroblastes dermiques et de kératinocytes de l'épiderme. En outre, nous montrons que l'ECM enrichi produit dans MMC dans des cultures monocouches peut être décellularisé et utilisé comme matrice pur dérivé de cellules (MDP).
Nous utilisons une approche non-conventionnelle de visualiser et d'apprécier pleinement l'ECM déposé par les cellules de peau en culture avec MMC. La microscopie interférence de réflexion est généralement utilisée pour l'étude des interactions cellule-matrice ou points de contact de cellule à verre. Cette technique a été utilisée dans notre système pour afficher le montant total de la matrice déposée sur la surface du verre. La microscopie Interférence de réflexion a été couplé avec immunomarquage fluorescent pour obtenir la plus grande quantité d'informations en termes de composition de la matrice extracellulaire et la structure, en présence et en absence de MMC.
Organotypic peau co-cultures est une méthode classique pour modéliser la peau in vitro dans un contexte tridimensionnel. Alors que les co-cultures bidimensionnelles peuvent fournir des informations importantes, il est limité lors de la traduction de ces données et l' appliquer de nouveau à un environnement in vivo, ce qui est en soi une structure tridimensionnelle. kératinocytes de la peau, en particulier, sont polarisées et contiennent des segments apicales et basales qui sont essentielles pour l'homéostasie et l'adhérence des cellules. En outre, l'expression des protéines suprabasales typiques dans les kératinocytes au-dessus de la couche basale, telles que la kératine 1, de la kératine 10 et filaggrine est présent uniquement au cours de la stratification et la différenciation terminale des kératinocytes. La différenciation terminale est pratiquement présent dans des cultures monocouches typiques, l'expression de la protéine est normalement suprabasale pas réalisée dans ce système de culture. Par conséquent, les cultures organotypiques commencent immergés dans un milieu de culture, mais sont ensuite levées à une interface air-liquide pour conduire keratinocytdifférenciation e. Cela se traduit par l'expression des marqueurs de stratification, même la kératinisation et généralement une meilleure réflexion de la physiologie épidermique. Alors que d'autres groupes ont déjà généré la peau organotypique co-cultures avec succès, la mise en place d'une zone de jonction dermo-épidermique fonctionnelle a été un problème. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour la culture de peau organotypique co-cultures avec une membrane basale améliorée, dans un laps de temps condensé et sans compromettre la maturité de ces constructions. Cela fournirait des mimétiques de la peau pour la modélisation in vitro, l'étude de la biologie de la peau et un assortiment de tests de criblage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. macromoléculaire Surpeuplement en 2D des cultures de cellules de la peau
- Seed 50.000 cellules (fibroblastes primaires ou des kératinocytes primaires ou co-culture de fibroblastes et kératinocytes primaires) par puits d'une plaque de 24 puits. cellules de semences dans 1 ml de milieu de croissance de type cellule correspondante.
- Laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2.
- Jeter les anciens médias et le remplacer par 1 ml de milieu frais contenant Crowders macromoléculaires et 100 uM d'acide ascorbique. Utiliser un cocktail crowder constitué de 37,5 mg / ml de Ficoll 70 et 25 mg / ml de Ficoll 400. Utilisation support de fibroblaste (FM) constitué de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% d'antibiotiques de pénicilline-streptomycine. Cultivez kératinocytes dans un milieu sans sérum, KSFM ou CnT-57. Maintenir des co-cultures dans un mélange de 50% FM et des médias sans sérum 50%.
- Incuber les cultures pendant 6 jours dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2, avec un changement de milieu tous les 2 jours.
2. immunocoloration fluorescente sur des cultures de cellules de la peau
- Laver les cultures de cellules deux fois avec PBS 1x.
- Fixer des cultures de cellules soit avec du méthanol ou de paraformaldehyde (selon les spécifications d'anticorps).
- Fixation pour Méthanol
- Aliquote de 500 ul de methanol froid dans chaque puits et incuber à 20 ° C pendant 10 min. Aspirer fixateur et jeter les déchets de méthanol. Sécher à l'air dans une hotte laminaire des fumées.
- Pour paraformaldéhyde Fixation
- Aliquote de 500 pi d'une solution de paraformaldehyde à 2% dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min. Aspirer fixateur et jeter les déchets de paraformaldehyde.
- Laver avec 1x PBS, pendant trois lavages, 5 min par lavage.
- Aliquote de 1 ml de PBS 1x dans chaque puits.
- Fixation pour Méthanol
- L'immunocoloration en utilisant des anticorps fluorescents
- Aliquote de 500 ul de 3% de sérum albumine bovine (diluée dans 1 x PBS) dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 30 min. Aspirer la solution de blocage et le jeter.
- L'anticorps primaire
- Pour l'imagerie directement à partir de la plaque: Aliquoter 200 pi d'anticorps primaire (dilution 1: 100 dans 10% de sérum de chèvre), la solution dans chaque puits et incuber pendant 90 min à température ambiante.
- Pour lamelles: aliquotes 50 ul d'anticorps primaire (dilution 1: 100 dans 10% de sérum de chèvre) solution sur un morceau plat de Parafilm. Placez la lamelle sur le Parafilm, avec la cellule côté (partie de lamelle avec des cellules) face à la solution. Couvrir la cellule côté entier, sans bulles. Incuber pendant 90 min à température ambiante.
- solution d'anticorps primaire Aspirer et défausse.
- Laver avec 1x PBS, pendant trois lavages, 5 min par lavage.
- L'anticorps secondaire
- Pour l'imagerie directement à partir de la plaque: Aliquoter 200 pi d'anticorps secondaire (dilution 1: 400 dans 10% de sérum de chèvre) solution dans chaque puits et incuber pendant 30 min à température ambiante, recouvrant la plaque d'aluminium fo il.
- Pour lamelles: aliquotes 50 pi d'anticorps secondaire (dilution 1: 400 dans 10% de sérum de chèvre) solution sur un morceau plat de Parafilm. Placez la lamelle sur le Parafilm, avec la cellule côté (partie de lamelle avec des cellules) face à la solution. Couvrir la cellule côté entier, sans bulles. Incuber pendant 30 min à température ambiante, recouvrant la Parafilm avec une feuille d'aluminium.
- Aspirer solution d'anticorps secondaire et défausse.
- Laver avec 1x PBS, pendant trois lavages, 5 min par lavage. Aliquote de 1 ml de PBS 1x dans chaque puits.
- Montage
- Pour l'imagerie directement à partir de la plaque: ne pas monter. Passez à microscope.
- Pour l'imagerie des lamelles: lamelles de montage, dans les milieux de montage, sur une lame de verre. Sécher toute la nuit dans un récipient recouvert d'une feuille d'aluminium. Passez à microscope.
- Acquisition d'images en utilisant un microscope confocal à balayage laser avec un objectif d'huile 40X / 1.30.
- Laver les couches de cellules deux fois avec PBS 1x.
- Aliquoter 100 ul de tampon de lyse (voir liste des matières) dans chaque (format de plaque de 6 puits) bien. Racler la couche de cellules avec un grattoir à cellules et une solution de transfert dans un microtube.
- solution Centrifuger à 15330 xg pendant 30 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un autre tube à centrifuger et jeter le culot.
- Mélanger 13 pi de chaque échantillon avec 5 pi de tampon d'échantillon et 2 ul d'agent réducteur (voir la liste des matériaux). Des échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 10 min.
- Centrifuger les échantillons à 15330 xg pendant 1 min pour recueillir l'eau de condensation. Charger les échantillons dans un gel PAGE pré-cast et fonctionnent à 100 V pendant environ 1 h.
- Pour transférer les protéines séparées sur une membrane de nitrocellulose, de prendre en sandwich le gel et la membrane entre les morceaux de papier et les éponges (de la même taille). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles entre le gel, membrane, papiers et éponges. Fermez la cassette sandwich et exécuter le transfert à 70 V au 2 h.
- Pour vérifier si le transfert a été complète, incuber la membrane avec 10 ml membrane Ponceau S. Laver avec 0,1% de PBS-Tween-20, trois fois, 10 min par lavage.
- Bloquer avec 10 ml de 5% de lait pendant 1 heure à température ambiante. Laver la membrane avec 0,1% de PBS-Tween-20, trois fois, 10 min par lavage.
- Incuber avec 10 ml d'anticorps primaire pendant 90 min (souris anti-collagène VII, LH 7.2, 1: 1000 dilution dans 5% de lait). Laver la membrane avec 0,1% de PBS-Tween-20, trois fois, 10 min par lavage.
- Incuber avec 10 ml d'anticorps secondaire pendant 30 min (chèvre anti-souris-HRP, 1: 2000 dilution dans 5% de lait). Laver la membrane avec 0,1% de PBS-Tween-20, trois fois, 10 min par lavage.
- Transférer la membrane sur une cassette et ajouter 1 ml de réactif de détection ECL. Placez une feuille plastique transparent, mince sur la membrane.
- Pour détecter chimioluminescence, placer un film sensible à la lumière sur la feuille de plastique et fermez la cassette. après 2-5 Min, retirer le film de la cassette et le placer dans un développeur.
4. Faire et utilisation d'une matrice de cellules dérivées
- Seed 50.000 cellules (fibroblastes primaires ou des kératinocytes primaires ou co-culture de fibroblastes et kératinocytes primaires) par puits d'une plaque de 24 puits.
- Laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2.
- Jeter les anciens médias et le remplacer par un milieu frais contenant Crowders macromoléculaires et 100 uM d'acide ascorbique. Le cocktail crowder se compose de 37,5 mg / ml de Ficoll 70 et 25 mg / ml de Ficoll 400. Les supports fibroblaste (FM) est composé de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% de Pen-strep. Les kératinocytes sont cultivées dans un milieu sans sérum, KSFM ou CnT-57. Maintenir les co-cultures dans un mélange de 50% et 50% FM KSFM ou CNT-57.
- Incuber cultures pendant 6 jours dans un incubateur à 37 ° à 5% de CO 2, changer de support tous les 2 jours.
- Decellularize couches de cellules pour obtenir une matri dérivée des cellulesx (f-mat = matrice dérivé des fibroblastes, k = matrice-mat kératinocytaire dérivée, co-mat = matrice dérivée d'une co-culture de fibroblastes et kératinocytes).
- Laver les couches de cellules deux fois dans PBS 1x.
- Ajouter 250 pi de désoxycholate de sodium à 0,5%. Laisser incuber sur de la glace pendant 10 min. Aspirer le lysat cellulaire.
- Répétez l'étape 4.5.2 trois fois.
- Matrice de lavage dérivé des cellules deux fois dans l' eau distillée 2 O. Gardez la matrice dérivée des cellules dans PBS 1x. Matrices peuvent être stockés pendant 1 semaine à 4 ° C.
- Préparer la suspension cellulaire secondaire (par exemple, Seeding kératinocytes sur le dessus de f-mat).
- Aspirer PBS 1x.
- Seed 50.000 kératinocytes sur le dessus de la matrice dérivée des cellules (f-mat). Laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2.
Nota: Les dosages peuvent être réalisés directement sur les cellules adhérentes.
5. Caractérisation de la Cell-Matrice dérivée
- immunocoloration Fluorescent: Se référer au protocole n ° 2.
- Interférence Réflexion Microscopie
- cellules de semences sur de lamelles de verre, après Protocole 4.1-4.5.
- Après l'obtention de la matrice dérivée des cellules, fixer des échantillons suivants Protocole 2.2.
Remarque: la coloration des anticorps est facultative. Si nécessaire, reportez-vous au protocole 2.3. - Effectuer l'acquisition d'images en utilisant un microscope confocal à balayage laser avec un objectif 40x / 1,30 d'huile. Réglez le sténopé à 74 mm.
- Utilisez LP 505 pour la ré fl exion microscopie (IRM) canal d'interférence et BP 575-615 IR pour la fluorescence canal rouge pour les filtres. Utiliser NT 80/20 pour le canal IRM et HFT 405/488/561, NFT 565, plaque pour la fluorescence canal rouge pour les séparateurs de faisceaux. Utilisez les lasers suivants: DPSS 561-10 (longueur d'onde 561 nm) à 1,1% de la puissance pour la fluorescence canal rouge et HeNe633 (longueur d'onde 633 nm) à une puissance de 5,0% pour le canal IRM.
6. 3D organotypique peau Co-culture
- Jetez un gel de collagène, avec Fibroblastes encapsulé, dans une culture cellulaire Insert (format plaque de 6 puits).
- Aliquote de 10 ml de queue de rat de collagène de type I à un bécher froid.
- Ajouter 1 ml de DMEM froid. Ajouter 0,5 ml de NaOH 1 M pour neutraliser le collagène acide. Ajouter 0,5 ml de suspension de fibroblastes (contenant 1.200.000 fibroblastes).
- Transférer la solution, dans une pipette à froid, les inserts de culture cellulaire dans une plaque de 6 puits. 12 ml de solution totale est également divisés en 6 inserts de culture cellulaire.
- Incuber le gel dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2, pendant 1 heure.
- Après le gel est solidifié, immerger le gel dans FM. Après 24 heures, jeter les vieux médias et le remplacer par un milieu frais, contenant Crowders macromoléculaires. Ajouter un volume de 2 ml à l'intérieur de l'insert de culture cellulaire et 2 ml à l'extérieur de la pièce rapportée de culture cellulaire.
- Après 24 h,Seed kératinocytes sur le dessus du gel de collagène.
- Trypsiniser kératinocytes en utilisant 0,125% d'agent trypsine / chélateur pendant 5 min à 37 ° C. Appuyez sur les côtés du flacon doucement pour déloger les cellules et neutraliser la trypsine avec du sérum contenant des médias. Compter les cellules et préparer des kératinocytes suspension (300.000 kératinocytes par gel et en suspension dans 200 médias pi).
- Aspirer anciens médias d'insert de culture cellulaire. Ajouter des kératinocytes au-dessus du gel.
- Incuber le gel dans un incubateur à 37 ° au niveau de 5% de CO 2, pendant 1 heure.
- Après que les kératinocytes sont fixés à la surface du gel, immerger le gel avec 2 ml KSFM ou CNT-57 à l'intérieur de l'insert de culture cellulaire et 2 ml de FM à l'extérieur de la pièce rapportée de culture cellulaire.
- Après 24 heures, jeter les vieux médias et le remplacer par un milieu frais, contenant Crowders macromoléculaires.
- Après 7 jours de culture submergée, élever la culture à l'interface air-liquide.
- Transférez les ins de culture cellulaireert à une plaque de puits profonds. Ajouter 10 ml de milieu de stratification à l'extérieur de la pièce rapportée de culture cellulaire. Gardez l'intérieur de la culture cellulaire insert sec.
- Incuber les cultures dans un incubateur à 37 ° à 5% de CO 2 et de changer de support tous les 3 jours, pour les 14 prochains jours.
Remarque: Après 2 semaines à l'interface air-liquide, l'équivalent de peau est mature et peut être récolté (soit une congélation instantanée ou formaline fixe).
7. équivalents de peau de récolte et caractérisation de organotypiques
- Aspirer les médias de stratification.
- En utilisant des pinces, transférer insère la culture sur une serviette en papier et tamponner loin des médias restants de la base de l'insert.
- À l'aide d'un scalpel, coupé le long de la circonférence intérieure de l'insert de culture.
- Fixer la co-culture de la peau organotypique (conjointement avec la membrane PET).
- snap Gel
- Transférer la construction de gel à un cryomoule. Couvrir l'intérieur du cryomoule OCTcomposé. Placer le cryomoule dans l'azote liquide pendant 10 secondes.
- En utilisant une pince à épiler, retirez le cryomoule congelé de l'azote liquide, envelopper dans du papier d'aluminium et de stocker les échantillons congelés dans un congélateur à -80 ° C.
- Extemporané des échantillons avec un cryostat, avec une épaisseur de coupe de 7 um.
- formol Fixation
- Placer un «tampon éponge biopsie 'dans la' cassette de biopsie. Transférer le gel construire sur le tampon éponge. Placez un autre tampon éponge délicatement sur le dessus de la construction de gel. Fermez la cassette.
- immerger complètement la cassette dans 10% du formol tamponné neutre pendant 48 heures, à la température ambiante. Retirez la cassette et jeter les déchets formaline.
- Incorporer l'échantillon fixé dans un bloc de cire en premier déshydratant avec une série d'éthanol, puis infiltrer progressivement l'échantillon avec de la cire. Section du bloc de cire avec un microtome.
- snap Gel
- Caractérisation de l'équivalent de peau
- immunocoloration
- Pour les sections congelées:
- Incuber les coupes dans du sérum de chèvre à 10% (dilué dans 1 x PBS) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les coupes dans 1x PBS pour enlever le sérum de chèvre.
- Incuber les sections avec un anticorps primaire (dilution 1: 100 dans du sérum de chèvre à 10%) pendant 90 min à température ambiante. Laver sections 1x PBS, trois fois, 5 minutes par lavage.
- Incuber les sections avec un anticorps secondaire (dilution 1: 400 dans du sérum de chèvre à 10%) pendant 30 min à température ambiante, dans un récipient recouvert d'une feuille d'aluminium. Laver sections 1x PBS, trois fois, 5 minutes par lavage.
- Mont glisse, avec les médias de montage, sur une lamelle. échantillons Couvrir avec une feuille d'aluminium et laisser sécher pendant la nuit.
- L'image en utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1.30 d'huile.
- Pour Formol paraffiniques fixe Sections intégrées:
- sections de DEWAX (et réhydrater) en diminuant les pourcentages d'éthanol à l'eau (Xylène - éthanol à 100%- 90% d'éthanol - 80% d'éthanol - 70% d'éthanol - eau). immerger entièrement les échantillons dans les solutions. Chaque étape de déparaffinage devrait être de 3 min.
- Incuber sections de 1% de peroxyde d'hydrogène pendant 30 min. Laver sections 1x PBS pendant 5 min.
- Incuber les sections dans une solution de citrate (10 ml de solution de citrate est dissoute dans 90 ml d'eau) à 120 ° C pendant 20 min. Laisser les lames refroidir pendant une nuit, à la température ambiante. Laver sections 1x PBS, trois fois, 5 minutes par lavage.
- Incuber les coupes dans du sérum de chèvre à 10% (dilué dans 1 x PBS) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les coupes dans 1x PBS pour enlever le sérum de chèvre.
- Incuber les sections avec un anticorps primaire (dilution 1: 100 dans du sérum de chèvre à 10%) pendant 90 min à température ambiante. Laver sections 1x PBS, trois fois, 10 min par lavage.
- Incuber les sections avec un polymère marqué à la HRP (non dilué) pendant 30 min à température ambiante. Laver les sections avec PBS 1x, trois fois, 10 min par lavage.
- Pour un tube de microcentrifugeuse, mélanger 1 mlDAB Substrat (3,3'-diaminobenzidine) avec 1 goutte de chromogène. Incuber les sections avec cette solution pendant 15 secondes - 5 min (couleur brun = signal positif).
- Pour arrêter la réaction, laver les sections dans l'eau courante.
- noyaux Counterstain à l'hématoxyline, pendant 5 min. Rincer les sections à l'eau courante.
- Incuber les coupes dans une solution d'acide-alcool, pendant 1 min. Rincer les sections à l'eau courante.
- Incuber sections dans la solution de l'eau du robinet de Scott, pendant 2 min. Rincer les sections à l'eau courante.
- Facultatif: Incuber sections en éosine pendant 1 min et laver à l'eau courante.
- Déshydrater sections en pourcentage croissant d'éthanol au xylène (70% d'éthanol - 80% d'éthanol - 90% d'éthanol - 100% d'éthanol - xylène). Veiller à ce que les échantillons sont complètement immergés pendant 3 min par étage.
- Mont glisse, en utilisant un milieu de montage, à une lamelle. Air sécher pendant la nuit.
- L'image en utilisant un microscope confocal avec un objectif 40X / 1.30 d'huile.
- Pour les sections congelées:
- Transmission Electron Microscopy (pour visualiser Ancrage fibrilles)
- Fixer des échantillons à 2,5% de glutaraldéhyde pendant 72 heures.
- échantillons Laver en PBS 1x, trois fois, 10 min par lavage.
- Couper en petits morceaux (1 mm 3). échantillons post-fix dans 1% de tétroxyde d'osmium, pH 7,4, pendant 1 h à température ambiante. Laver les échantillons dans de l'eau distillée.
Attention: tétroxyde Osmium est toxique et toxiques et doivent être manipulés avec précaution dans une hotte. - Déshydrater les échantillons à travers une série ascendante d'éthanol (25% d'éthanol - 50% d'éthanol - 75% d'éthanol - 95% d'éthanol - 100% d'éthanol - acétone) pendant 20 minutes par étape.
- Infiltrez par trempage des échantillons à 100% d'acétone: résine Araldite (1: 1) pendant 30 min à température ambiante, puis à 1: 3 pendant 1 heure, puis 1: 6 nuit. Faire tremper l'échantillon dans une résine araldite frais pendant 2 heures à la température ambiante, suivi d'un second changement de résine araldite frais pendant 1 heure à 40 ° C. Laissez le troisième un nouveauchangement de résine raldite pendant 1 heure à 45 ° C et laisser le quatrième frais de changement de résine araldite pendant 1 heure à 50 ° C.
- Incuber les échantillons à 60 ° C pendant 24 heures pour permettre la polymérisation.
- Des échantillons de la section à l'aide d'un couteau de verre, pour obtenir des coupes semi-fines d'une épaisseur de 1 pm. section Stain avec du bleu de méthylène pour observer histologie. Section de l'échantillon afin d'obtenir des coupes ultra-minces de 70 nm et de recueillir chaque section sur une grille de cuivre.
- des sections de tache avec une solution à 5% d'acétate d'uranyle pendant 15 minutes suivie d'une solution à 3% de citrate de plomb pendant 10 minutes.
- Acquisition d'images avec un microscope électronique à transmission (100 kV), à un grossissement de 30,000X.
- immunocoloration
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Encombrement macromoléculaire a pu améliorer le dépôt d'ECM, en particulier, les fibroblastes déposés plus de collagène I, IV et de la fibronectine par rapport aux cultures témoins (Figure 1, la couche cellulaire; 1A, le collagène I; 1B, le collagène IV, 1C, fibronectine). Sur décellularisation, il était évident que les fibroblastes étaient les principaux déposants de collagène I, IV et de la fibronectine par rapport aux kératinocytes (Figure 1, Matrix).
Sur la figure 2, on a observé que les fibroblastes au lieu de kératinocytes ont été les principaux producteurs de collagène VII. Ceci est le premier rapport du collagène VII déposé avec succès in vitro (Benny et al, 2015).
La matrice dérivée des cellules a été caractérisée par immunofluorescence en utilisant Antibod spécifiques. Bien que ce soit une approche classique, il était important de visualiser l'ECM dans sa totalité et apprécier pleinement l'effet des Crowders macromoléculaires. En utilisant la microscopie interférence de réflexion (IRM), l'étendue de la matrice a été capturé (Figure 3). Une superposition du marquage de l'anticorps avec l'image IRM indique la quantité relative de ce composant ECM par rapport à la quantité totale de l'ECM.
Dans un modèle in vitro 3D de la peau, MMC condensé le temps de culture de 5 semaines à 3 semaines pour obtenir un co-culture mûre organotypique peau (Figure 4). Une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine a révélé que, à 3 semaines, la culture avec Crowders macromoléculaires est composée d'un épiderme pluri- stratifié et stromales derme riche, par rapport aux cultures témoins uncrowded qui manquaient d'un épiderme complètement différenciées. En outre, intense et continue immunocoloration collagène VII a été détectée au niveau du dermal-épidermique des cultures de cellules surpeuplées, par rapport à un immunomarquage collagène VII faible et inégale dans les cultures témoins. La microscopie électronique à transmission (figure 5) a révélé la présence de fibrilles d' ancrage dans des cultures organotypiques, montrant fonctionnel collagène VII.
Figure 1: encombrement macromoléculaire mixte (MMMC) améliore le dépôt de dermo-épidermiques composants de jonction in vitro (A) le dépôt de collagène I est renforcée par MMMC (couche de cellules et de la matrice) dans les fibroblastes seulement.. Surpeuplement des co-cultures produisent le plus de collagène I et montrent que les kératinocytes a stimulé la production de collagène I par les fibroblastes. (B) Le collagène IV dépôt par les fibroblastes est renforcée par le surpeuplement. Cela se voit encore plus clairement dans les co-cultures bondés. Fait à noter, keratinocytes colorées pour le collagène IV montrent la plupart du temps associé aux cellules ou intracellulaire collagène IV, mais pas une matrice péricellulaire. En co-cultures, les deux types de cellules se séparent avec le collagène IV étant principalement associée avec des fibroblastes épargnant les îles de kératinocytes. Dépôt (C) fibronectine n'a été observée avec des fibroblastes, et dans celle - ci fortement renforcée par l' encombrement (couche de cellules et de la matrice). En co-cultures, un maillage réticulaire de la fibronectine a été associée à des fibroblastes seulement, épargnant les îles de kératinocytes. Les barres d'échelle = 20 pm. Ce chiffre a été modifié depuis Benny et al., 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Mixte encombrement macromoléculaire (MMMC) facilite le dépôt deancrage fi bril collagène du bâtiment VII. (A) Un motif de dépôt réticulaire de collagène VII dépôt est évident avec les fibroblastes que sous MMMC. En co-cultures, le collagène extracellulaire VII est fortement associée à des colonies fi broblastes entre les îles de kératinocytes. Keratinocytes montrent le collagène péricellulaire et VII intracellulaire plus fortement exprimé en présence de MMMC. Après la lyse des cellules, des empreintes de collagène VII sont vus dans une couche granulaire fi ne dans les cultures fi broblastes MMMC-traités, mais un dépôt fi brillar discernable sont récupérées à partir des co-cultures. (B) l' analyse par immunotransfert des couches de cellules lysées montre que les deux fibroblastes bondés et les cultures de kératinocytes contiennent significativement plus de collagène VII par rapport aux témoins uncrowded. Le collagène VII récupéré est principalement dérivé péricellulaire. (C) Analyse densitométrique B montre que MMMC augmente la quantité de cellules associéd collagène VII par un facteur 8 dans les fibroblastes et un facteur de 2 dans les kératinocytes. Les barres d'échelle = 20 pm. Ce chiffre a été modifié depuis Benny et al., 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Fibroblast empreintes contiennent plus ECM totale visualisés par des interférences ré fl exion microscopie (IRM) sur l' analyse des composants ECM individuels (collagène IV et fibronectine), la culture sous MMMC amélioré le dépôt extracellulaire.. Pour visualiser l'ECM total déposé, IRM a été utilisée pour quantifier tous les ECM comme la coloration des anticorps a ses limites. IRM a montré clairement la quantité de matrice globale et le modèle sous MMMC par rapport aux conditions de contrôle. Barre d'échelle = 20 pm. Ce chiffre a étémodifié depuis Benny et al., 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Macromoléculaire mixte entassement (MMMC) pendant la phase immergée améliore la maturation de l'jonction dermo-épidermique (JDE) en équivalents de peau fibroblaste contenant des gels de collagène ont été ensemencées avec des kératinocytes sur le dessus et maintenus immergés pendant 1 semaine, puis levé à un interface air-liquide. Dans le protocole classique, le collagène VII (vert) était absent après un total de 3 semaines en culture, mais est apparu en équivalents de peau au bout de 5 semaines. En revanche, sous MMMC, le collagène VII était déjà fortement évidente après 3 semaines et même plus fortement teinté après 5 semaines par rapport aux cultures classiques. Hématoxyline et éosine (grossissement de 20x) coloration csur fi rmé que, avec ce protocole rapide, strati fi cation et de la maturité de l'équivalent de la peau ont été maintenues et accéléré. Barre d'échelle = 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis Benny et al., 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Preuve de la formation de novo d'ancrage fibrilles en équivalents de peau générés dans le cadre des études MMMC ultrastructurales de la naissante jonction dermo-épidermique des co-cultures organotypiques après 3 semaines de protocole de culture avec MMMC (A, B) suggère des structures analogues à l' ancrage fibrilles (flèches) qui sont absents en équivalents de la peau non-encombrées (C) après 3 semaines de culture. Ce chiffre a été modifié from Benny et al., 2015. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
