Summary
Apresenta-se um protocolo para obter matrizes derivadas de células ricas em proteínas da matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Além disso, apresentamos um protocolo que incorpora MMC na geração de co-cultura de pele organot�ica 3D, o que reduz o tempo de cultura, mantendo a maturidade da construção.
Abstract
A família das glicoproteínas de colágenos representa as principais proteínas estruturais do corpo humano, e são componentes essenciais de biomateriais utilizados em engenharia de tecidos modernos. Um gargalo técnica é a deposição de colagénio in vitro, como é notoriamente lenta, resultando numa sub-óptima formação de tecido conjuntivo e subsequente coesão tecido, particularmente em modelos de pele. Aqui, nós descrevemos um método que envolve a adição de co-polímeros de sacarose diferencialmente porte a culturas de pele para gerar macromolecular aglomerando (MMC), o que resulta num aumento dramático da deposição de colagénio. Particularmente, os fibroblastos dérmicos depositada uma quantidade significativa de colagénio I / IV / VII e fibronectina sob MMC em comparação com os controlos.
O protocolo também descreve um método para decellularize camadas de células aglomeradas, expondo quantidades significativas de matriz extracelular (ECM), que foram retidas na superfície da cultura como evidenciado por immunocyimuno. Total de padrão de massa de matriz e distribuição foi estudada usando microscopia de interferência reflexão. matrizes Curiosamente, f ibroblastos, queratinócitos e co-culturas produzidas derivadas de células (CDM) de composição variada e morfologia. MDL podem ser usados como "bio-andaimes para" semear célula secundária, em que a utilização actual de revestimentos ou andaimes, tipicamente a partir de fontes animais xenogénicas, pode ser evitado, movendo-se assim, para aplicações mais clinicamente relevante.
Além disso, este protocolo descreve a aplicação de MMC durante a fase submersa de um modelo 3D-organotípicas pele de co-cultura que foi suficiente para aumentar a deposição de ECM na junção dermo-epidérmica (JDE), em particular, colagénio VII, o componente principal das fibrilas de ancoragem. A microscopia eletrônica confirmou a presença das fibrilas de ancoragem em culturas desenvolvidas com MMC, em comparação aos controles. Isto é significativo como fibrilas de ancoragem amarrar da derme para a epiderme, daí,tendo um pré-formado madura JDE podem beneficiar receptores de enxertos de pele em termos de estabilidade do enxerto e da cura de feridas em geral. Além disso, o tempo de cultura foi condensado a partir de 5 semanas a 3 semanas para obter uma construção madura, quando se utiliza MMC, reduzindo os custos.
Introduction
A pele constitui uma barreira de protecção, impedindo a perda de água e entrada de agentes patogénicos. Ele é constituído por três componentes principais; derme ricos do estroma 1, uma epiderme estratificada 2,3,4 em cima dela, e a junção dermo-epidérmica entre 5,6. A derme é composta em grande parte de colágeno e fibras elásticas e é pouco povoada com fibroblastos 7. Em contraste, a epiderme rica de células é constituída por várias camadas de queratinócitos. Os queratinócitos da camada mais interior são proliferativa e fornecer novas células basais que renovam e substituir os queratinócitos terminalmente diferenciados que movem-se constantemente para o mais exterior da camada da pele e perderam os seus núcleos e o material citoplasmático, resultando numa camada córnea que sofre descamação.
A junção dérmico-epidérmica, um tipo específico de membrana basal, é uma estrutura complexa composta por moléculas que interligam matriz, que tethers da epiderme para a derme. fibras de colágeno I da derme entrelaçado com o colágeno VII fibrilas de ancoragem que são ancorados ao colágeno IV rica lâmina densa. filamentos de ancoragem (laminina 5, XVII colágeno e integrinas), por sua vez ligar a lâmina densa com hemidesmossomos de queratinócitos basais. Os queratinócitos basais (stratum basale) têm a capacidade de proliferar e renovar, bem como diferenciar e estratificar para formar as camadas suprabasais; estrato espinhoso, estrato granuloso, e, finalmente, o estrato córneo, que constitui a superfície de contacto da pele com o meio ambiente. No caminho a partir da camada basal até à camada córnea, queratinócitos mudar os padrões de citoqueratinas de expressão e, por fim, sofrem apoptose e encerram-se em cornificado envelopes, cascos de proteínas específicas que são covalentemente reticulados pela actividade da transglutaminase.
Recriando pele e suas camadas, in vitro, incluindo as estruturas complexas do junção dermo-epidérmica e dérmica matriz extracelular, e emular o processo de queratinização, tem cientistas longa intrigado e bioengenheiros como uma tarefa desafiadora. Tem havido avanços significativos na engenharia de tecido de pele, por exemplo, a extracção com êxito de células da pele de biópsias de pacientes e a geração de culturas organotípicas pele usando células da pele derivada de paciente 8. No entanto, permanecem por resolver problemas relativos à pobre secreção de proteínas da matriz extracelular pelas células da pele si e resultando em modelos de pele sub-óptimas. Além disso, o tempo necessário para gerar a co-cultura organotípica pele 3D utilizando protocolos correntes varia entre quatro a oito semanas, um período de tempo, que poderia, potencialmente, ser encurtado com a incorporação de Crowders macromoleculares. Reduzindo o tempo de cultura economiza custos reagente, reduz a incidência de senescência celular e reduz o tempo de espera do paciente o produto deve ser utilizado na prática clínica.
t "> Macromoleculares aglomerando (MMC) envolve a introdução de macromoléculas específicas para o meio de cultura para gerar efeitos de volume excluído. Isto afecta as taxas de reacção enzimáticas, incluindo a clivagem proteolítica da pró-colagénio que é tardia sob condições de cultura padrão aquosas 9-13. De acordo com MMC, as reacções enzimáticas são apressou sem aumentar a quantidade de reagentes 14,15 resultantes em, no caso de clivagem de pró-colagénio, um aumento da quantidade de colagénio I moléculas em culturas cheio como comparado com os controlos sem aglomeração 10. à medida que a conversão de pró-colagénio de colagénio permite a formação de colagénio assembléias, fibroblastos cultivados com MMC durante 48 horas produziu significativamente mais colágeno I, em comparação com culturas de fibroblastos desertas monitorados por até quatro semanas 11,16,17. Além dos efeitos sobre as atividades enzimáticas que afetam a formação, estabilização e remodelação de ECM, MMC também foi mostrado para melhorar directamente e modulam colagénioformação de fibras 18,19.Apresentamos aqui um método para aumentar a produção de matriz extracelular (ECM) por células da pele, em particular, fibroblastos da derme e queratinocitos epidérmicos. Além disso, mostramos que a ECM enriquecido produzido sob MMC em culturas em monocamada pode ser descelularizados e usado como matriz derivada de células puro (MDL).
Nós usamos uma abordagem não convencional para visualizar e apreciar plenamente a ECM depositado por células da pele cultivadas com MMC. microscopia de interferência de reflexão é tipicamente utilizada para estudar as interacções célula-matriz ou pontos de contacto célula-a-vidro. Esta técnica foi utilizada no nosso sistema para visualizar a quantidade total de matriz depositado na superfície do vidro. microscopia de interferência reflexão foi acoplado com imunocoloração fluorescente para obter a maior quantidade de informação em termos de composição da matriz extracelular e o padrão, na presença e ausência de MMC.
Organotypic pele co-culturas é um método clássico para modelar a pele in vitro num contexto tridimensional. Enquanto bidimensionais co-culturas podem fornecer informação significativa, é limitado ao traduzir estes dados e aplicando-a de volta para um ambiente in vivo, o que é inerentemente uma estrutura tridimensional. queratinócitos da pele, em particular, são polarizados e contêm segmentos apicais e basais, que são essenciais para a homeostase e adesão celular. Além disso, a expressão de proteínas nos queratinócitos suprabasais típicos acima da camada basal, tais como queratina 1, queratina 10 e filagrina só está presente no decurso da estratificação e diferenciação terminal de queratinócitos. Como diferenciação terminal é dificilmente presente em culturas em monocamada típicos, a expressão da proteína suprabasal normalmente não é conseguido no presente sistema de cultura. Portanto, as culturas organotípicas de começar submerso em meio de cultura, mas são, então, levantada para uma interface ar-líquido para dirigir keratinocyte diferenciação. Isto resulta na expressão de marcadores de estratificação, mesmo cornifica�o e geralmente melhor reflexão da fisiologia epidérmica. Enquanto outros grupos têm gerado anteriormente pele organot�ica co-culturas com sucesso, o estabelecimento de uma zona de junção dermo-epidérmica funcional tem sido um problema. Aqui, apresentamos um novo método para a cultura de pele organot�ica co-culturas com uma membrana basal melhorada, num período de tempo condensado e sem comprometer a maturidade dessas construções. Isso proporcionaria miméticos da pele para modelar in vitro, o estudo da biologia da pele e uma variedade de ensaios de rastreio.
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Protocol
1. Macromolecular Crowding em 2D culturas de células da pele
- 50.000 células de sementeira (fibroblastos primários ou queratinócitos primários ou co-cultura de fibroblastos e queratinócitos primários) por poço de uma placa de 24 poços. Semear as células em 1 ml de meio de crescimento tipo de célula correspondente.
- Permitir que as células a aderir durante a noite, numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Descartar a velha mídia e substituir com 1 ml de meio fresco contendo Crowders macromoleculares e ácido ascórbico 100? M. Use de um cocktail consistindo Crowder de 37,5 mg / ml de Ficoll 70 e 25 mg / ml de Ficoll meios 400. Utilização de fibroblastos (FM) que consiste em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de antibióticos penicilina-estreptomicina. Crescer queratinócitos em um meio livre de soro, KSFM ou CNT-57. Manter a co-culturas em uma mistura de 50% de FM e 50% de meio isento de soro.
- Incubar as culturas durante 6 dias numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2, com uma mudança de meio a cada 2 dias.
2. A imunocoloração fluorescente em culturas de células da pele
- Lavar as culturas de células duas vezes com PBS 1x.
- Fix culturas de células com metanol ou paraformaldeído (dependendo das especificações de anticorpos).
- Para Metanol Fixação
- Alíquota de 500 ul de metanol frio em cada cavidade e incuba-se a -20 ° C durante 10 min. Aspirar fixador e descartar resíduos metanol. Ar seco em uma capa laminar fume.
- Para paraformaldeído Fixation
- Alíquota de 500 ul de solução de paraformaldeído a 2% em cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Aspirar fixador e descartar resíduos paraformaldeído.
- Lavar com 1x PBS, durante três lavagens, 5 min por lavagem.
- Aliquota de 1 ml de PBS 1x em cada cavidade.
- Para Metanol Fixação
- A imunomarcação utilizando anticorpos fluorescentes
- Alíquota de 500 ul de albumina de soro bovino a 3% (diluído em PBS 1x) para cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Aspirar a solução de bloqueio e descartar.
- anticorpo primário
- Para imagiologia directamente a partir da placa: alíquota de 200 ul do anticorpo primário (diluição 1: 100 em soro de cabra a 10%) em solução de cada poço e incubar durante 90 min à temperatura ambiente.
- Para lamelas: alíquota de 50 uL de anticorpo primário (diluição 1: 100 em soro de cabra a 10%) solução sobre uma peça plana de Parafilm. Coloque lamela para o Parafilm, com o lado da célula (parte da lamela com células) voltado para a solução. Cobrir o lado da célula inteira, sem bolhas. Incubar durante 90 minutos à temperatura ambiente.
- solução de anticorpo primário Aspirar e descarte.
- Lavar com 1x PBS, durante três lavagens, 5 min por lavagem.
- O anticorpo secundário
- Para imagiologia directamente a partir da placa: alíquota de 200 uL de anticorpo secundário (1: 400 de diluição em 10% de soro de cabra) solução em cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, cobrindo a placa de alumínio com fo il.
- Para lamelas: alíquota de 50 uL de anticorpo secundário (1: 400 de diluição em 10% de soro de cabra) solução sobre uma folha plana de Parafilm. Coloque lamela para o Parafilm, com o lado da célula (parte da lamela com células) voltado para a solução. Cobrir o lado da célula inteira, sem bolhas. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, cobrindo o Parafilm com folha de alumínio.
- solução de anticorpo secundário Aspirar e descarte.
- Lavar com 1x PBS, durante três lavagens, 5 min por lavagem. Aliquota de 1 ml de PBS 1x em cada cavidade.
- Montagem
- Para geração de imagens diretamente da placa: não montar. Avance para o microscópio.
- Para geração de imagens de lamelas: lamelas de montagem, em montagem de mídia, sobre uma lâmina de vidro. secar durante a noite em um recipiente coberto com papel alumínio. Avance para o microscópio.
- Adquirir imagens utilizando um microscópio confocal de digitalização a laser com um 40X / 1,30 Objetivo Oil.
- Lavar as camadas de células duas vezes com PBS 1x.
- Alíquota de 100 ul de tampão de lise (ver a Lista de Materiais) em cada (formato de placa de 6 poços) bem. Raspar a camada de células com um raspador de células e solução de transferência para um tubo de microcentrífuga.
- solução Centrifugar a 15.330 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga e rejeitar o sedimento.
- Misturar 13 ul de cada amostra com 5 ul de tampão de amostra e 2 ul de agente de redução (ver Lista de Materiais). amostras de calor a 95 ° C durante 10 min.
- Centrifugar as amostras a 15.330 xg por 1 min para recolher a água de condensação. amostras de carga em um gel PAGE pré-moldados e executar a 100 V durante aproximadamente 1 hora.
- Para transferir proteínas separadas para uma membrana de nitrocelulose, a sanduíche de gel e de membrana entre as peças de papel e esponjas (do mesmo tamanho). Certifique-se de que não há bolhas entre o gel, membranas, papéis e esponjas. Fechar a cassete de sanduíche e executar a transferência, a 70 V durante 2 h a.
- Para verificar se a transferência estar completa, incubar a membrana com 10 ml de membrana Ponceau S. lavagem com 0,1% de PBS-Tween-20, três vezes, 10 min por lavagem.
- Bloco com 10 ml de leite a 5% durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar membrana com 0,1% de PBS-Tween-20, três vezes, 10 min por lavagem.
- Incubar com 10 mL de anticorpo primário durante 90 min (de ratinho anti-colagénio VII, LH 7,2, 1: 1000 de diluição em leite a 5%). Lavar membrana com 0,1% de PBS-Tween-20, três vezes, 10 min por lavagem.
- Incubar com anticorpo secundário 10 ml durante 30 min (de cabra anti-ratinho-HRP, 1: 2000 de diluição em leite a 5%). Lavar membrana com 0,1% de PBS-Tween-20, três vezes, 10 min por lavagem.
- Transferir a membrana para uma cassete e adicionar 1 mL de Reagente de Detecção de ECL. Coloque uma folha de plástico transparente, fina sobre a membrana.
- Para detectar quimiluminescência, coloque um filme sensível à luz sobre a folha de plástico e fechar a gaveta. após dois-5 Min, retire a película da cassete e colocá-lo em um desenvolvedor.
4. Fazer e utilizando uma matriz de derivadas de células
- 50.000 células de sementeira (fibroblastos primários ou queratinócitos primários ou co-cultura de fibroblastos e queratinócitos primários) por poço de uma placa de 24 poços.
- Permitir que as células a aderir durante a noite, numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
- Descartar a velha mídia e substituir por meios frescos contendo Crowders macromoleculares e ácido ascórbico 100? M. O cocktail Crowder consiste de 37,5 mg / ml de Ficoll 70 e 25 mg / ml de Ficoll 400. meios de fibroblastos (FM) é composto por DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de pen-strep. Queratinócitos são cultivadas em um meio livre de soro, KSFM ou CNT-57. Manter a co-culturas em uma mistura de 50% de FM e 50% KSFM ou CNT-57.
- Incubar as culturas durante 6 dias numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2, mudando meios de comunicação a cada 2 dias.
- Decellularize camadas de células para se obter um derivado de células MatriX (F-mat = matriz derivada de fibroblastos, k-esteira = matriz derivada de queratinócitos, co-mat = matriz derivada de uma co-cultura de fibroblastos e queratinócitos).
- Lavar as camadas de células duas vezes em PBS 1x.
- Adicionar 250 uL de 0,5% de desoxicolato de sódio. Incubar, em gelo, durante 10 min. Aspirar lisado celular.
- Repita o passo 4.5.2 três vezes.
- Lavar matriz derivada de células duas vezes em H2O destilada Manter matriz derivada de células em PBS 1x. As matrizes podem ser armazenados durante 1 semana, a 4 ° C.
- Prepare suspensão de células secundário (por exemplo, Semeando queratinócitos no Topo da f-mat).
- Aspirar PBS 1x.
- Semente 50.000 queratinócitos no topo da matriz derivada de células (M-MAT). Permitir que as células a aderir durante a noite, numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2.
Nota: Os ensaios podem ser realizados directamente nas células aderentes.
5. Caracterização do Cell-Matrix derivado
- imunomarcação fluorescente: Consulte o Protocolo 2.
- Interferência Microscopia Reflexão
- células de sementes sobre a lamelas de vidro, seguindo o protocolo 4,1-4,5.
- Após a obtenção da matriz derivada de células, corrigir amostras seguintes Protocol 2.2.
Nota: coloração com anticorpos é opcional. Se necessário, consulte protocolo 2.3. - Executar aquisição de imagem usando um microscópio confocal de varrimento laser com um objetivo de petróleo 40x / 1,30. Defina o pinhole em 74 mm.
- Use LP 505 para a re fl exão microscopia (IRM) canal de interferência e BP 575-615 IR para a fluorescência canal vermelho para filtros. Use NT 80/20 para o canal de IRM e HFT 405/488/561, NFT 565, placa para a fluorescência canal vermelho para os divisores de feixe. Use as seguintes lasers: DPSS 561-10 (comprimento de onda 561 nm) com potência de 1,1% para o canal de fluorescência vermelha e HeNe633 (comprimento de onda 633 nm) com potência de 5,0% para o canal de IRM.
6. Organotípicas 3D pele Co-cultura
- Transmitir um gel de colagénio, por fibroblastos encapsulado, numa célula de cultura de Inserção (formato de placa de 6 poços).
- Alíquota de 10 ml de cauda de rato colágeno tipo I para um copo de frio.
- Adicionar 1 ml de DMEM frio. Adicionar 0,5 ml de NaOH 1 M para neutralizar o ácido colagénio. Adicionar 0,5 ml de suspensão de fibroblastos (contendo fibroblastos 1.200.000).
- Transferir a solução, em uma pipeta de frio, para as inserções de cultura de células dentro de uma placa de 6 poços. 12 ml de solução total é dividido igualmente em 6 inserções de cultura celular.
- Incubar o gel em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2, durante 1 h.
- Depois que o gel tem solidificado, submergir o gel em FM. Após 24 h, descartar a velha mídia e substituir por meios frescos, contendo Crowders macromoleculares. Adicionar um volume de 2 ml para o interior da inserção de cultura de células e 2 ml para o exterior da inserção de cultura de células.
- Depois de 24 horas,Semear queratinócitos no topo do gel de colagénio.
- Tripsinizar queratinócitos usando 0,125% de agente de tripsina / quelante durante 5 min a 37 ° C. Toque lados do balão suavemente para desalojar as células e neutralizar a tripsina com meio contendo soro. Contagem de células e preparar a suspensão de queratinócitos (300.000 queratinócitos por gel e suspenso em 200 ul de meios de comunicação).
- Aspirar velha mídia da inserção de cultura de células. Adicionar queratinócitos no topo do gel.
- Incubar o gel em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2, durante 1 h.
- Depois de queratinócitos têm ligado à superfície do gel, submergir o gel com 2 ml KSFM ou CNT-57 para o interior da inserção de cultura de células e 2 ml de FM para o exterior da inserção de cultura de células.
- Após 24 h, descartar a velha mídia e substituir por meios frescos, contendo Crowders macromoleculares.
- Após 7 dias de cultura submersa, elevar a cultura a uma interface ar-líquido.
- Transfira os ins-cultura de célulasERT a uma placa de poço profundo. Adicionam-se 10 ml de meio de estratificação para o exterior da inserção de cultura de células. Manter o interior da inserção de cultura de células secas.
- Incubar as culturas em uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2 e mudar de suporte a cada 3 dias, durante os próximos 14 dias.
Nota: Após 2 semanas na interface ar-líquido, o equivalente de pele é maduro e pode ser colhido (o snap congelados ou fixados com formalina).
7. Colheita e caracterização de Organotípicas equivalentes de pele
- media aspirado de estratificação.
- Usando pinças, transferir a cultura insere em uma toalha de papel e dab distância meios restantes a partir da base da inserção.
- Utilizando um bisturi, cortar ao longo da circunferência interna da inserção de cultura.
- Fixar a co-cultura organotípica pele (em conjunto com a membrana de PET).
- snap Congelar
- Transferir o gel para um constructo cryomold. Cobrir o interior do cryomold com outubrocomposto. Coloque a cryomold em azoto líquido durante 10 seg.
- Com uma pinça, retire a cryomold congelados do azoto líquido, embrulhe em folha de alumínio e armazenar as amostras congeladas em um congelador C -80 °.
- Seção amostras congeladas com um criostato, com uma espessura de corte de 7 mm.
- formol Fixation
- Coloque um "pad esponja biópsia 'na' gaveta biópsia". Transferir o gel para construir o bloco de esponja. Coloque uma outra almofada de esponja suavemente no topo da construção em gel. Feche a cassete.
- Totalmente submergir a cassete em 10% de formalina tamponada neutra durante 48 h, à temperatura ambiente. Retire a fita e descartar resíduos formalina.
- Incorporar a amostra fixada em um bloco de cera pela primeira desidratando com uma série de etanol e, em seguida, se infiltrando gradativamente a amostra com cera. Seção do bloco de cera com um micrótomo.
- snap Congelar
- Caracterização do Equivalente de Pele
- imunocoloração
- Para as secções congeladas:
- Incubar secções em soro de cabra a 10% (diluído em PBS 1x), durante 1 h à temperatura ambiente. seções de lavagem em 1X PBS para remover o soro de cabra.
- Incubar secções com o anticorpo primário (diluição 1: 100 em soro de cabra a 10%) durante 90 min à temperatura ambiente. Lave os cortes em 1x PBS, três vezes, 5 min por lavagem.
- Incubar secções com anticorpo secundário (1: 400 de diluição em soro de cabra a 10%) durante 30 min à temperatura ambiente, num recipiente coberto com folha de alumínio. Lave os cortes em 1x PBS, três vezes, 5 min por lavagem.
- Mount desliza, com meios de montagem, em uma lamela. amostras de cobertura com papel alumínio e deixe secar durante a noite.
- Imagem usando um microscópio confocal com um objetivo de petróleo 40x / 1,30.
- Para fixados em formalina parafina secções embutidas:
- seções dewax (e reidratar) em descendente percentagens de etanol para água (xileno - 100% de etanol- 90% de etanol - 80% de etanol - 70% de etanol - água). Totalmente submergir as amostras em soluções. Cada passo de desparafinação deve ser de 3 min.
- Incubar secções em peróxido de hidrogénio a 1% durante 30 min. Lavar as secções em PBS 1X durante 5 min.
- Incubar secções em solução de citrato (10 ml de solução de citrato é dissolvido em 90 ml de água) a 120 ° C durante 20 min. Permitir lâminas arrefecer durante a noite, à temperatura ambiente. Lave os cortes em 1x PBS, três vezes, 5 min por lavagem.
- Incubar secções em soro de cabra a 10% (diluído em PBS 1x), durante 1 h à temperatura ambiente. seções de lavagem em 1X PBS para remover o soro de cabra.
- Incubar secções com o anticorpo primário (diluição 1: 100 em soro de cabra a 10%) durante 90 min à temperatura ambiente. Lave os cortes em 1x PBS, três vezes, 10 min por lavagem.
- Incubar secções com polímero marcado com HRP (diluído), durante 30 min, à temperatura ambiente. Lave os cortes com 1x PBS, três vezes, 10 min por lavagem.
- Para um tubo de microcentrífuga, misture 1 mlSubstrato de DAB (3,3'-diaminobenzidina) com 1 gota de cromogénio. Incubar as secções com esta solução durante 15 seg - 5 min (cor marrom = sinal positivo).
- Para parar a reacção, lavar as secções em água corrente.
- contracoloração núcleos com hematoxilina, durante 5 min. Enxágüe seções em água corrente.
- Incubar secções em solução de álcool de ácido, durante 1 min. Enxágüe seções em água corrente.
- Incubar seções em solução água da torneira de Scott, por 2 min. Enxágüe seções em água corrente.
- Opcional: Incubar seções em eosina para 1 min e lavar em água corrente.
- Desidratar seções em percentagens ascendentes de etanol para xileno (70% de etanol - 80% de etanol - 90% de etanol - 100% de etanol - xileno). Garantir que as amostras são totalmente submerso por 3 min por estágio.
- Mount desliza, usando meios de montagem, para uma lamela. Ar seco durante a noite.
- Imagem usando um microscópio confocal com um objetivo de petróleo 40x / 1,30.
- Para as secções congeladas:
- Microscopia Eletrônica de Transmissão (para visualizar fibrilas de ancoragem)
- Fix amostras em 2,5% de glutaraldeído, durante 72 h.
- Lavar as amostras em 1x PBS, três vezes, 10 min por lavagem.
- Cortar em pequenos pedaços (1 mm3). amostras pós-FIX em 1% de tetróxido de ósmio, pH 7,4, durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar as amostras em água destilada.
Cuidado: tetróxido de ósmio é venenoso e tóxicos e devem ser manuseados com cuidado em um exaustor. - Desidratar as amostras através de uma série ascendente de etanol (25% etanol - 50% etanol - 75% etanol - 95% etanol - 100% de etanol - acetona) durante 20 minutos por passo.
- Se infiltrar por imersão amostras em 100% de acetona: Resina Araldite (1: 1) durante 30 min à temperatura ambiente e depois a 1: 3 para 1 h, seguida por 1: 6 durante a noite. Soak amostra em resina araldite fresco durante 2 horas à temperatura ambiente, seguido por uma segunda mudança de resina araldite fresco durante 1 hr a 40 ° C. Deixar o terceiro fresca ummudança raldite resina durante 1 h a 45 ° C e deixar a quarta mudança resina araldite fresco durante 1 hr a 50 ° C.
- Incubar as amostras a 60 ° C durante 24 h, para permitir a polimerização.
- Secção amostras usando uma faca de vidro, para se obter cortes semi-finos com uma espessura de 1 um. seção mancha com azul de metileno para observar histologia. Secção da amostra para obtenção de cortes ultra-finos de 70 nm e recolher cada secção para uma grelha de cobre.
- secções são coradas com solução de acetato de uranilo a 5% durante 15 min, seguido por solução de citrato de chumbo 3% durante 10 min.
- Adquirir imagens com um microscópio eletrônico de transmissão (100 kV), com uma ampliação de 30,000X.
- imunocoloração
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Representative Results
Aglomeração macromolecular foi capaz de aumentar a deposição de ECM, em particular, fibroblastos depositado mais colagénio I, IV e fibronectina, em comparação com culturas de controlo (Figura 1, camada celular; 1A, colagénio I; 1B, colagénio IV; 1C, fibronectina). Após a descelularização, era evidente que os fibroblastos eram os principais depositantes de colagénio I, IV e fibronectina, em comparação com os queratinócitos (Figura 1, matriz).
Na Figura 2, observou-se que os fibroblastos em vez de queratinócitos foram os principais produtores de colagénio VII. Este é o primeiro relatório de colagénio VII depositada com sucesso in vitro, (Benny et ai, 2015).
A matriz derivada de células foi caracterizado por imunofluorescência usando Antibod específicas. Embora esta seja uma abordagem clássica, que era importante para visualizar a ECM em sua totalidade e apreciar plenamente o efeito das Crowders macromoleculares. Utilizando microscopia de interferência de reflexão (IRM), a extensão da matriz foi capturado (Figura 3). Uma sobreposição da coloração do anticorpo com a imagem de IRM mostra a quantidade relativa de componente ECM que em relação à quantidade total de ECM.
Em um modelo de pele in vitro 3D, MMC condensado do tempo de cultura a partir de 5 semanas a 3 semanas para se obter um co-cultura organotípica pele madura (Figura 4). A coloração com hematoxilina e eosina mostraram que em 3 semanas, a cultura com Crowders macromoleculares consistiu de uma epiderme pluri-estratificado e estroma rico derme, em comparação com culturas de controlo sem aglomeração que carecia de uma epiderme completamente diferenciada. Além disso, intensa e contínua imunocoloração de colagénio VII foi detectada na dermejunção L-epidérmica de culturas de células aglomeradas, em comparação com uma imunocoloração de colagénio VII fraca e irregular nas culturas de controlo. Microscopia electrónica de transmissão (Figura 5) mostrou a presença de fibrilas de ancoragem em culturas organotípicas, mostrando funcional colagénio VII.
Figura 1: aglomeração macromolecular Misto (MMMC) aumentam a deposição de componentes da junção dérmico-epidérmicas in vitro (A) A deposição de colagénio que é reforçada por MMMC (camada de células e matriz) em apenas fibroblastos.. Aglomeração de co-culturas produzem mais colágeno I e mostram que os queratinócitos estimulada a produção de colágeno I por fibroblastos. (B) A deposição de colágeno IV por fibroblastos é reforçada por aglomeração. Isto é visto ainda mais claramente na co-culturas lotados. De nota, keratinocytes coradas para mostrar colágeno IV na maior parte das células-associada ou intracelular colágeno IV, mas não uma matriz pericelular. Em co-culturas, os dois tipos de células segregam com colágeno IV sendo predominantemente associada com fibroblastos poupadores ilhas de queratinócitos. Deposição (C) A fibronectina foi visto apenas com fibroblastos, e é aí fortemente reforçada por apinhamento (camada de células e matriz). Em co-culturas, uma malha reticular de fi bronectin foi associado com apenas fibroblastos, poupando ilhas de queratinócitos. Barras de escala = 20 uM. Este valor foi modificado a partir Benny et al., 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mixed aglomeração macromolecular (MMMC) facilita a deposição deancorando fi bril colágeno edifício VII. (A) Um padrão de deposição reticular de colagénio VII deposição é evidente com fibroblastos somente sob MMMC. Em co-culturas, colágeno extracelular VII está fortemente associada com as colônias fi broblast entre ilhas de queratinócitos. Queratinócitos mostram colagénio pericelular e intracelular VII expresso mais fortemente na presença de MMMC. Após a lise celular, pegadas colágeno VII são vistos em uma camada granular fi ne em culturas fi broblast tratados MMMC, mas uma deposição fi brillar discernível é recuperado de co-culturas. (B) A análise de imunotransferência de camadas de células lisadas mostra que ambos os fibroblastos lotados e culturas de queratinócitos contêm significativamente mais colágeno VII comparados com os controles desertas. O colagénio VII recuperado é principalmente derivada pericelular. (C) A análise densitométrica de B mostra que MMMC aumenta a quantidade de células-associadod colagénio VII por um factor de 8 em fibroblastos e um factor de 2 em queratinócitos. Barras de escala = 20 uM. Este valor foi modificado a partir Benny et al., 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fibroblasto pegadas conter mais ECM total, como visualizado por interferência re fl exão microscopia (IRM) na análise de componentes da MEC individuais (colágeno IV e fi bronectin), cultura sob MMMC reforçada a deposição extracelular.. Para visualizar o ECM total depositado, o IRM foi utilizada para quantificar todos ECM como coloração de anticorpos tinha as suas limitações. IRM mostrou claramente a quantidade de matriz total e padrão sob MMMC em comparação com condições de controle. Barra de escala = 20 mm. Esta figura tem sidomodificada a partir de Benny et al., 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Macromolecular Mixed apinhamento (MMMC) durante a fase submersa aumenta a maturação da junção dermo-epidérmica (DEJ) em equivalentes de pele fibroblastos contendo gel de colágeno foram semeadas com queratinócitos na parte superior e manteve submerso durante 1 semana, então ergueu a um interface ar-líquido. No protocolo clássico, colagénio VII (verde) estava ausente após um total de 3 semanas em cultura, mas apareceram em equivalentes de pele após 5 semanas. Em contraste, sob MMMC, colagénio VII já foi fortemente evidente após 3 semanas e ainda mais fortemente corados depois de 5 semanas, em comparação com culturas convencionais. Hematoxilina e eosina (20x) coloração cno fi rmou que, com este protocolo rápida, strati fi cação e maturidade do equivalente de pele foram mantidas e acelerado. Barra de escala = 100 pm. Este valor foi modificado a partir Benny et al., 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Evidência de formação de novo de ancoragem fibrilas em equivalentes de pele obtidos em estudos MMMC ultra-estruturais da junção dermo-epidérmica nascente de co-culturas organotípicas após um protocolo de cultura 3 semana com MMMC (A, B) sugere estruturas parecidas com ancoragem fibrilas (setas) que estão ausentes em equivalentes de pele não-aglomeradas (C) após 3 semanas de cultura. Esta figura foi modificado from Benny et al., 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S.
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering--a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
