Summary
Se presenta un protocolo para obtener matrices derivadas de células ricas en proteínas de la matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Además, se presenta un protocolo que incorpora MMC en 3D generación de la piel de co-cultivo organotípicos, lo que reduce el tiempo de cultivo, manteniendo la madurez del constructo.
Abstract
La familia de glicoproteínas de colágenos representa las principales proteínas estructurales en el cuerpo humano, y son componentes clave de los biomateriales utilizados en la ingeniería de tejidos moderna. Un cuello de botella técnico es la deposición de colágeno in vitro, ya que es notoriamente lentos, lo que resulta en la formación de sub-óptima de tejido conectivo y la cohesión del tejido posterior, particularmente en modelos de piel. A continuación, describimos un método que implica la adición de co-polímeros de sacarosa diferencialmente de tamaño a cultivos de piel para generar macromolecular hacinamiento (MMC), que se traduce en una mejora dramática de la deposición de colágeno. En particular, los fibroblastos dérmicos depositan una cantidad significativa de colágeno I / IV / VII y fibronectina bajo MMC en comparación con los controles.
El protocolo también describe un método para decellularize capas de células de hacinamiento, la exposición de cantidades significativas de la matriz extracelular (ECM) que se conservaron en la superficie de cultivo como se evidencia por immunocytochemistry. patrón de masa total y la distribución de la matriz se estudió mediante microscopía de interferencia de reflexión. Curiosamente matrices, fibroblastos, queratinocitos y los co-cultivos producidos derivados de células (MDL) de diferente composición y morfología. MDL podría utilizarse como "bio-andamios" para la siembra celular secundaria, donde el uso actual de los revestimientos o andamios, por lo general de fuentes animales xenogénicas, se puede evitar, trasladando así a las aplicaciones más clínicamente relevante.
Además, este protocolo describe la aplicación de MMC durante la fase sumergida de un modelo 3D-organotípicos piel de co-cultivo, que era suficiente para aumentar la deposición de ECM en la unión dermo-epidérmica (DEJ), en particular, el colágeno VII, el componente principal de fibrillas de anclaje. La microscopía electrónica confirmó la presencia de fibrillas de anclaje en cultivos desarrollados con MMC, en comparación con los controles. Esto es significativo ya que las fibrillas de anclaje atar el dermis a la epidermis, por lo tanto,que tiene un pre-formada madura DEJ puede beneficiar a los receptores de injertos de piel en cuanto a la estabilidad del injerto y la curación de heridas en general. Además, el tiempo de cultivo se condensa a partir de 5 semanas a 3 semanas para obtener una construcción madura, al utilizar MMC, reduciendo los costos.
Introduction
La piel forma una barrera protectora mediante la prevención de la pérdida de agua y la entrada de patógenos. Se compone de tres componentes principales; la dermis ricos del estroma 1, una epidermis estratificada 2,3,4 encima de ella, y de la unión dermo-epidérmica de entre 5,6. La dermis se componen en gran parte de colágeno y fibras elásticas y está escasamente poblada con fibroblastos 7. En contraste, la epidermis rica en células se compone de varias capas de queratinocitos. Los queratinocitos de la capa más interna son proliferativa y proporcionan nuevas células basales que se renuevan y sustituyen a los queratinocitos de diferenciación terminal que se mueven constantemente a la capa más externa de la piel y han perdido sus núcleos y el material citoplasmática, lo que resulta en una capa córnea que se somete descamación.
La unión dermoepidérmica, un tipo específico de la membrana basal, es una estructura compleja compuesta de moléculas de la matriz de interconexión, que tetheRS de la epidermis a la dermis. fibras de colágeno I de la dermis se entrelazan con las fibrillas de colágeno VII que se anclan en el colágeno IV densa rica lámina de anclaje. filamentos de anclaje (5 laminina, colágeno XVII y integrinas), a su vez conectan la lámina densa con hemidesmosomas de queratinocitos basales. queratinocitos basales (estrato basale) tienen la capacidad de proliferar y renovar, así como diferenciar y estratificar para formar las capas suprabasales; estrato espinoso, estrato granuloso, y, finalmente, el estrato córneo, que representa la superficie de contacto de la piel con el medio ambiente. En ruta desde la capa basal a la capa córnea, los queratinocitos cambian los patrones de expresión de citoqueratinas y finalmente se someten a apoptosis y encierran a sí mismos en cornified sobres, cascos de proteínas específicas que se reticulan covalentemente por la actividad de transglutaminasa.
La recreación de la piel y sus capas in vitro, incluyendo las estructuras complejas de la unión dermo-epidérmica y dérmica de la matriz extracelular, y emular el proceso de queratinización, tiene intrigado a los científicos durante mucho tiempo y bioingenieros como una tarea difícil. Ha habido avances significativos en la ingeniería de tejidos de la piel, por ejemplo, la extracción con éxito de células de la piel a partir de biopsias de pacientes y la generación de cultivos organotípicos piel utilizando células de la piel derivados del paciente 8. Sin embargo, permanecen sin resolver los problemas relativos a la pobre secreción de proteínas de matriz extracelular por las células de la piel a sí mismos y que resulta en modelos de piel sub-óptimos. Además, el tiempo requerido para generar la piel de co-cultivo organotípicos 3D utilizando los protocolos actuales varía entre cuatro a ocho semanas, un periodo de tiempo que potencialmente podría acortarse con la incorporación de Crowders macromoleculares. La reducción de tiempo de cultivo ahorra costes de reactivos, reduce la incidencia de la senescencia celular y reduce el tiempo de espera del paciente se debe utilizar el producto en la clínica.
t "> Macromolecular hacinamiento (MMC) implica la introducción de macromoléculas específicas para el medio de cultivo para generar efectos de volumen excluido. Estos afectan a las tasas de reacción enzimática, incluyendo la escisión proteolítica de procolágeno que llega tarde bajo condiciones de cultivo estándar acuosas 9-13. Bajo MMC, reacciones enzimáticas se aceleró sin aumentar la cantidad de reactivos 14,15 resultantes en, en el caso de la escisión de procolágeno, un aumento de la cantidad de colágeno I moléculas en cultivos de hacinamiento, en comparación con los controles con poca gente 10. como la conversión de procolágeno a colágeno permite la formación de colágeno asambleas, los fibroblastos cultivados con MMC durante 48 horas produjeron significativamente más colágeno I en comparación con los cultivos de fibroblastos con poca gente supervisados por hasta cuatro semanas 11,16,17. además de los efectos sobre las actividades enzimáticas que afectan a la formación, la estabilización y la remodelación de la MEC, MMC también se ha demostrado para mejorar directamente y modular colágenola formación de fibras 18,19.Presentamos aquí un método para mejorar la producción de la matriz extracelular (ECM) por células de la piel, en particular, fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos. Además, se muestra que la ECM enriquecido producido bajo MMC en monocapas se puede descelularizados y se utiliza como matriz derivada de células puro (CDM).
Utilizamos un enfoque no convencional para visualizar y apreciar plenamente el ECM depositado por las células de piel cultivados con MMC. microscopía de interferencia de reflexión se utiliza normalmente para el estudio de las interacciones célula-matriz o puntos de contacto de célula a vidrio. Esta técnica se utilizó en nuestro sistema para ver la cantidad total de matriz depositada en la superficie de vidrio. microscopía de interferencia de reflexión se acopló con inmunotinción fluorescente para obtener la mayor cantidad de información en términos de composición de la matriz extracelular y el patrón, en presencia y ausencia de MMC.
Organotypic piel co-cultivos es un método clásico para modelar la piel in vitro en un contexto tridimensional. Mientras bidimensionales co-cultivos pueden proporcionar información importante, es limitado en la traducción de estos datos y la aplicación de nuevo a un entorno in vivo, que es inherentemente una estructura tridimensional. queratinocitos de la piel, en particular, están polarizados y contienen segmentos apical y basal, que son esenciales para la homeostasis y la adhesión celular. Además, la expresión de proteínas típicas suprabasal en los queratinocitos por encima de la capa basal, tales como la queratina 1, la queratina 10 y filagrina sólo está presente en el curso de la estratificación y la diferenciación terminal de los queratinocitos. A medida que la diferenciación terminal apenas está presente en los cultivos típicos de una sola capa, la expresión de proteínas suprabasal normalmente no se logra en este sistema de cultivo. Por lo tanto, los cultivos organotípicos comienzan sumergidas en medio de cultivo, pero luego se levantan a una interfaz aire-líquido para conducir keratinocyte diferenciación. Esto resulta en la expresión de marcadores de estratificación, incluso cornificación y generalmente mejor reflexión de la fisiología epidérmica. Mientras que otros grupos han generado previamente la piel organotípicos co-cultivos con éxito, el establecimiento de una zona de unión dermo-epidérmica funcional ha sido un problema. A continuación, presentamos un nuevo método para cultivar piel organotípicos co-cultivos con una membrana basal mejorada, en un marco de tiempo condensado y sin comprometer la madurez de estas construcciones. Esto proporcionaría miméticos de la piel para el modelado in vitro, el estudio de la biología de la piel y una variedad de ensayos de cribado.
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Protocol
1. macromolecular hacinamiento en 2D Cultivos de Células de la piel
- 50.000 células de semillas (fibroblastos primarios o queratinocitos primarios o co-cultivo de fibroblastos y queratinocitos primarios) por pocillo de una placa de 24 pocillos. Sembrar las células en 1 ml de medio de crecimiento tipo de célula correspondiente.
- Permitir que las células se adhieran durante la noche, en una incubadora de 37 ° C en 5% de CO 2.
- Desechar los viejos medios y reemplazar con 1 ml de medio fresco que contiene Crowders macromoleculares y ácido ascórbico 100 mM. Utilice un cóctel Crowder que consiste en 37,5 mg / ml de Ficoll 70 y 25 mg / ml de Ficoll 400. Uso de medios de fibroblastos (FM) que consiste en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos de penicilina-estreptomicina. Crecer queratinocitos en un medio libre de suero, KSFM o CNT-57. Mantener co-cultivos en una mezcla de 50% de FM y 50% de medio libre de suero.
- Incubar culturas para 6 días en una incubadora a 37 ° en 5% de CO 2, con un cambio de medio cada 2 días.
2. La inmunotinción fluorescente en cultivos celulares de la piel
- Lavar cultivos de células dos veces con PBS 1x.
- Fijar los cultivos de células con metanol o paraformaldehído (dependiendo de las especificaciones de anticuerpos).
- Para el metanol Fijación
- Alícuota de 500 l de metanol frío en cada pocillo y se incuba a -20 ° C durante 10 min. Aspirar y desechar los residuos fijador de metanol. Deje secar al aire en una campana de humos laminar.
- Para paraformaldehído fijación
- Alícuota de 500 l de solución de paraformaldehído al 2% en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Aspirar y desechar los residuos fijador paraformaldehído.
- Lavar con PBS 1x, por tres lavados, 5 minutos por lavado.
- Alícuota de 1 ml de PBS 1x en cada pocillo.
- Para el metanol Fijación
- La inmunotinción fluorescente Uso de Anticuerpos
- Alícuota de 500 l de albúmina de suero bovino 3% (diluido en 1X PBS) en cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min. Aspirar la solución de bloqueo y desechar.
- anticuerpo primario
- Para formación de imágenes directamente desde la placa: alícuota de 200 l de anticuerpo primario (1: 100 dilución en 10% de suero de cabra) solución en cada pocillo e incubar durante 90 min a temperatura ambiente.
- Para cubreobjetos: alícuota de 50 l de anticuerpo primario (dilución 1: 100 en 10% de suero de cabra) la solución en una pieza plana de Parafilm. Coloque cubreobjetos sobre el Parafilm, con el lado de la celda (parte de cubreobjetos con células) frente a la solución. Cubrir todo el lado de la célula, sin burbujas. Incubar durante 90 min a temperatura ambiente.
- solución de anticuerpo primario Aspirar y desechar.
- Lavar con PBS 1x, por tres lavados, 5 minutos por lavado.
- anticuerpo secundario
- Para formación de imágenes directamente desde la placa: alícuota de 200 l de anticuerpo secundario (1: 400 dilución en 10% de suero de cabra) solución en cada pocillo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente, que cubre la placa con aluminio fo Illinois.
- Para cubreobjetos: alícuota de 50 l de anticuerpo secundario (1: 400 dilución en 10% de suero de cabra) la solución en una pieza plana de Parafilm. Coloque cubreobjetos sobre el Parafilm, con el lado de la celda (parte de cubreobjetos con células) frente a la solución. Cubrir todo el lado de la célula, sin burbujas. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, que cubre el Parafilm con papel de aluminio.
- solución de anticuerpo secundario Aspirar y desechar.
- Lavar con PBS 1x, por tres lavados, 5 minutos por lavado. Alícuota de 1 ml de PBS 1x en cada pocillo.
- Montaje
- Para obtener imágenes directamente desde la placa: no monte. Continúe con el microscopio.
- Para obtener imágenes del cubreobjetos: cubreobjetos monte, en medio de montaje, en un portaobjetos de vidrio. secar durante la noche en un recipiente cubierto con papel de aluminio. Continúe con el microscopio.
- Adquirir imágenes con un microscopio confocal de barrido láser con un aceite Objetivo 40X / 1.30.
- Lavar las capas de células dos veces con PBS 1x.
- Alícuota de 100 l de tampón de lisis (véase la Lista de Materiales) en cada uno (formato de placa de 6 pocillos) también. Raspar la capa de células con un raspador celular y solución de transferencia en un tubo de microcentrífuga.
- la solución se centrifuga a 15.330 xg durante 30 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga y desechar el sedimento.
- Mezclar 13 l de cada muestra con 5 l de tampón de muestra y 2 l de agente reductor (ver Lista de Materiales). muestras de calor a 95 ° C durante 10 min.
- Centrifugar las muestras a 15.330 xg durante 1 min para recoger el agua de condensación. Cargar las muestras en un gel PÁGINA prefabricado y funcionan a 100 V durante aproximadamente 1 hora.
- Para transferir las proteínas separadas a una membrana de nitrocelulosa, Sandwich el gel y la membrana entre las piezas de papel y esponjas (del mismo tamaño). Asegúrese de que no haya burbujas entre el gel, membrana, papeles y esponjas. Cierre la bandeja sándwich y ejecutar la transferencia a 70 V durante al 2 horas.
- Para comprobar si la transferencia se completa, incubar la membrana con 10 ml de membrana Ponceau S. Lavar con 0,1% PBS-Tween-20, tres veces, 10 minutos por lavado.
- Bloque con 10 ml de 5% de leche durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar la membrana con un 0,1% PBS-Tween-20, tres veces, 10 minutos por lavado.
- Incubar con 10 ml anticuerpo primario durante 90 min (de ratón anti-colágeno VII, LH 7,2, 1: 1.000 dilución en 5% de leche). Lavar la membrana con un 0,1% PBS-Tween-20, tres veces, 10 minutos por lavado.
- Incubar con 10 ml de anticuerpo secundario durante 30 min (de cabra anti-ratón-HRP, 1: 2.000 dilución en 5% de leche). Lavar la membrana con un 0,1% PBS-Tween-20, tres veces, 10 minutos por lavado.
- La transferencia de la membrana para un cassette y añadir 1 ml de reactivo de detección ECL. Coloque una hoja de plástico transparente, delgada sobre la membrana.
- Para detectar quimioluminiscencia, coloque una película sensible a la luz sobre la lámina de plástico y cerrar el casete. después de 2-5 Minutos, retire la película del casete y lo coloca en un desarrollador.
4. Realización y uso de un derivado de matriz de célula
- 50.000 células de semillas (fibroblastos primarios o queratinocitos primarios o co-cultivo de fibroblastos y queratinocitos primarios) por pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Permitir que las células se adhieran durante la noche, en una incubadora de 37 ° C en 5% de CO 2.
- Desechar los viejos medios y reemplazar con medio fresco que contiene Crowders macromoleculares y ácido ascórbico 100 mM. El cóctel de Crowder consta de 37,5 mg / ml de Ficoll 70 y 25 mg / ml de Ficoll 400. medios de fibroblastos (FM) consiste en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% pen-strep. Los queratinocitos se cultivan en un medio libre de suero, KSFM o CNT-57. Mantener co-cultivos en una mezcla de 50% de FM y 50% KSFM o CNT-57.
- Incubar culturas para 6 días en una incubadora a 37 ° en 5% de CO 2, el cambio de los medios cada 2 días.
- Decellularize capas de células para obtener un matri derivado de célulasx (f-mat = matriz derivado de fibroblastos, k-mat = matriz de queratinocitos derivados, co-mat = matriz derivada de un co-cultivo de fibroblastos y queratinocitos).
- Lavar las capas de células dos veces en PBS 1x.
- Añadir 250 ml de desoxicolato de sodio al 0,5%. Incubar, en hielo, durante 10 min. lisado celular aspirado.
- Repita el paso 4.5.2 tres veces.
- Matriz de lavado de células derivadas de dos veces en H2O destilada Mantenga matriz derivada de células en PBS 1x. Las matrices se pueden almacenar durante un máximo de 1 semana a 4 ° C.
- Preparar suspensión celular secundaria (por ejemplo, Siembra de queratinocitos en la cima del f-mat).
- Aspirar PBS 1x.
- Sembrar 50.000 queratinocitos en la parte superior de la matriz derivada de células (f-mat). Permitir que las células se adhieran durante la noche, en una incubadora de 37 ° C en 5% de CO 2.
Nota: Los ensayos se pueden realizar directamente en las células adherentes.
5. Caracterización de la Cell-Matriz derivados
- inmunomarcación fluorescente: Consulte el Protocolo 2.
- Interferencia Microscopía Reflexión
- Se siembran las células en cubreobjetos de vidrio para, siguiendo el protocolo 4.1-4.5.
- Después de obtener la matriz derivada de células, fijar las muestras siguientes Protocolo 2.2.
Nota: La tinción de anticuerpos es opcional. Si es necesario, consulte Protocolo 2.3. - Realizar la adquisición de imágenes mediante el uso de un microscopio de barrido láser confocal con un objetivo de aceite 40X / 1.30. Ajuste el agujero de alfiler a los 74 mm.
- Utilice LP 505 para la reflexión microscopía (IRM) del canal de interferencia y BP 575-615 IR para la fluorescencia del canal rojo para los filtros. Uso NT 80/20 para el canal de IRM y HFT 405/488/561, NFT 565, la placa de la fluorescencia del canal rojo para los divisores de haz. Utilice las siguientes: láseres DPSS 561-10 (longitud de onda de 561 nm) a una potencia del 1,1% para el canal de fluorescencia roja y HeNe633 (longitud de onda de 633 nm) a una potencia de 5,0% para el canal de IRM.
6. 3D Organotípicos piel Co-cultura
- Reparto de un gel de colágeno, con fibroblastos encapsulado, en una celda-inserción del cultivo (formato de placa de 6 pocillos).
- Alícuota de 10 ml de cola de rata colágeno tipo I a un vaso de precipitados frío.
- Añadir 1 ml de DMEM frío. Añadir 0,5 ml de NaOH 1 M para neutralizar el colágeno ácido. Añadir 0,5 ml de la suspensión de fibroblastos (que contiene fibroblastos 1.200.000).
- Transferir la solución, en una pipeta frío, a los insertos de cultivo celular dentro de una placa de 6 pocillos. 12 ml de solución total se divide uniformemente en 6 insertos de cultivo celular.
- Incubar el gel en una incubadora a 37 ° en 5% de CO 2, por 1 hr.
- Después de que el gel se haya solidificado, sumergir el gel en FM. Después de 24 horas, desechar los viejos medios y reemplazar con medio fresco, que contiene Crowders macromoleculares. Añadir un volumen de 2 ml al interior del inserto de cultivo celular y 2 ml al exterior del inserto de cultivo celular.
- Después de 24 horas,Semillas queratinocitos en la parte superior del gel de colágeno.
- Trypsinize queratinocitos usando 0,125% de agente de tripsina / quelante durante 5 min a 37 ° C. Toque lados del matraz suavemente para desalojar las células y neutralizar la tripsina con medio que contenía suero. Recuento de células y preparar la suspensión de queratinocitos (300.000 queratinocitos por gel y se suspendieron en 200 l de medios).
- Aspirar los viejos medios de inserto de cultivo celular. Añadir los queratinocitos en la parte superior del gel.
- Incubar el gel en una incubadora a 37 ° en 5% de CO 2, por 1 hr.
- Después de queratinocitos han unido a la superficie del gel, sumergir el gel con KSFM 2 ml o CNT-57 en el interior del inserto de cultivo celular y 2 ml de FM a la parte exterior del inserto de cultivo celular.
- Después de 24 horas, desechar los viejos medios y reemplazar con medio fresco, que contiene Crowders macromoleculares.
- Después de 7 días de cultivo sumergido, elevar la cultura a una interfaz aire-líquido.
- La transferencia de los complementos de cultivo celularert a una placa de pozo profundo. Añadir 10 ml de medio de estratificación en el exterior de la pieza de inserción de cultivo celular. Mantenga el interior de la célula-inserción del cultivo seco.
- Se incuban los cultivos en una incubadora a 37 ° al 5% de CO2 y cambiar el medio cada 3 días, durante los próximos 14 días.
Nota: Después de 2 semanas en la interfase aire-líquido, el equivalente de piel es madura y puede ser cosechada (ya sea instantánea congelada o fija con formalina).
7. Cosecha y Caracterización de Organotípicos equivalentes de piel
- medios Aspirar estratificación.
- Con unas pinzas, transfiera la cultura inserta en una toalla de papel y unos toques de distancia resto del soporte de la base del inserto.
- El uso de un bisturí, corte a lo largo de la circunferencia interior de la inserción de cultivo.
- Fijar la piel co-cultivo organotípico (junto con la membrana PET).
- Snap Freeze
- Transferir el constructo de gel a un criomolde. Cubra el interior de la criomolde mediante OCTcompuesto. Coloque el criomolde en nitrógeno líquido durante 10 s.
- Con unas pinzas, retire el criomolde congelado del nitrógeno líquido, envolver en papel de aluminio y almacenar las muestras congeladas en un congelador a -80 °.
- Sección congelada muestras con un criostato, con un espesor de corte de 7 micras.
- La fijación de formalina
- Coloque una "almohadilla de esponja biopsia 'en el' cassette de biopsia '. Transferir el gel de construcción en la almohadilla de esponja. Coloque otra almohadilla de esponja suavemente en la parte superior de la construcción de gel. Cierre la bandeja.
- sumergir completamente el casete en el 10% formalina tamponada neutra durante 48 horas, a temperatura ambiente. Retire el casete y desechar los residuos de formalina.
- Incrustar la muestra fijada en un bloque de cera por primera deshidratación con una serie de etanol y luego infiltrando gradualmente la muestra con cera. Sección del bloque de cera con un microtomo.
- Snap Freeze
- Caracterización del equivalente de piel
- La inmunotinción
- Para las secciones congeladas:
- Incubar las secciones en 10% de suero de cabra (diluido en 1X PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente. secciones de lavado en 1X PBS para eliminar el suero de cabra.
- Incubar las secciones con el anticuerpo primario (1: 100 dilución en suero de cabra al 10%) durante 90 min a temperatura ambiente. Lávese las secciones en PBS 1x, tres veces, 5 minutos por lavado.
- Incubar las secciones con el anticuerpo secundario (dilución 1: 400 en suero de cabra al 10%) durante 30 min a temperatura ambiente, en un recipiente cubierto con papel de aluminio. Lávese las secciones en PBS 1x, tres veces, 5 minutos por lavado.
- Monte desliza, con los medios de montaje, sobre un cubreobjetos. muestras de la cubierta con papel de aluminio y dejar secar durante la noche.
- Imagen utilizando un microscopio confocal con un objetivo de aceite 40X / 1.30.
- Para las secciones formol y embebidos en parafina fijo:
- (secciones desparafinar y rehidratar) en orden descendente porcentajes de etanol al agua (Xileno - 100% de etanol- 90% de etanol - 80% de etanol - 70% de etanol - agua). sumergir completamente las muestras en soluciones. Cada etapa de desparafinado debe ser de 3 min.
- Incubar las secciones en peróxido de hidrógeno al 1% durante 30 min. Lavar secciones en 1X PBS durante 5 min.
- Incubar las secciones en solución de citrato (10 ml de solución de citrato se disuelve en 90 ml de agua) a 120 ° C durante 20 min. Permitir que las diapositivas se enfríen durante la noche, a temperatura ambiente. Lávese las secciones en PBS 1x, tres veces, 5 minutos por lavado.
- Incubar las secciones en 10% de suero de cabra (diluido en 1X PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente. secciones de lavado en 1X PBS para eliminar el suero de cabra.
- Incubar las secciones con el anticuerpo primario (1: 100 dilución en suero de cabra al 10%) durante 90 min a temperatura ambiente. Lávese las secciones en PBS 1x, tres veces, 10 minutos por lavado.
- Incubar las secciones con polímero marcado con HRP (sin diluir) durante 30 min, a temperatura ambiente. Lávese las secciones con PBS 1x, tres veces, 10 minutos por lavado.
- A un tubo de microcentrífuga, combine 1 mlDAB sustrato (3,3'-diaminobencidina) con 1 gota de cromógeno. Se incuban las secciones con esta solución durante 15 segundos - 5 min (color marrón = señal positiva).
- Para detener la reacción, lavar las secciones en agua corriente.
- Contratinción núcleos con hematoxilina, por 5 min. Enjuague las secciones en agua corriente.
- Incubar las secciones en solución de ácido alcohol, durante 1 min. Enjuague las secciones en agua corriente.
- Incubar las secciones en solución de agua del grifo de Scott, durante 2 minutos. Enjuague las secciones en agua corriente.
- Opcional: Se incuban las secciones en eosina durante 1 min y lavar en agua corriente.
- Deshidratar secciones en porcentajes ascendentes de etanol para xileno (70% de etanol - etanol 80% - 90% de etanol - 100% de etanol - xileno). Asegurarse de que las muestras están completamente sumergidos durante 3 minutos por etapa.
- Monte desliza, por medio de medios de fijación, a un cubreobjetos. noche a la mañana se seque al aire.
- Imagen utilizando un microscopio confocal con un objetivo de aceite 40X / 1.30.
- Para las secciones congeladas:
- Microscopía Electrónica de Transmisión (para visualizar fibrillas de anclaje)
- Fijar las muestras en glutaraldehído al 2,5% durante 72 horas.
- muestras de lavado en PBS 1x, tres veces, 10 min por lavado.
- Cortar en trozos pequeños (1 mm 3). muestras post-fix en 1% de tetróxido de osmio, pH 7,4, durante 1 hora a temperatura ambiente. muestras de lavado en agua destilada.
Precaución: El tetróxido de osmio es venenoso y tóxicos y deben manejarse con cuidado en una campana de humos. - Deshidratar muestras a través de una serie de etanol ascendente (25% de etanol - 50% de etanol - 75% de etanol - 95% de etanol - 100% de etanol - acetona) durante 20 minutos por paso.
- Infiltrarse por remojo muestras en 100% de acetona: resina Araldite (1: 1) durante 30 min a temperatura ambiente y después a 1: 3 para 1 hr, seguido de 1: 6 durante la noche. Remojar muestra en resina Araldite fresco durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por un segundo cambio de la resina Araldite fresco durante 1 hora a 40 ° C. Deja un tercer frescael cambio de resina raldite durante 1 hora a 45 ° C y dejar el cuarto cambio de resina Araldite fresca durante 1 hora a 50 ° C.
- Incubar las muestras a 60 ° C durante 24 horas para permitir la polimerización.
- muestras sección utilizando un cuchillo de cristal, para obtener secciones semi delgadas con un espesor de 1 m. sección mancha con azul de metileno para observar la histología. Sección la muestra para obtener secciones ultra-delgadas de 70 nm y recoger cada sección en una rejilla de cobre.
- secciones se tiñen con solución de acetato de uranilo al 5% durante 15 min seguido de una solución de citrato de plomo 3% durante 10 min.
- Adquirir imágenes con un microscopio electrónico de transmisión (100 kV), con un aumento de 30,000X.
- La inmunotinción
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Representative Results
Aglomeración macromolecular fue capaz de mejorar la deposición de ECM, en particular, los fibroblastos depositan más colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los cultivos control (figura 1, la capa de células; 1A, colágeno I; 1B, colágeno IV; 1C, fibronectina). Tras la descelularización, era evidente que los fibroblastos fueron los principales depositantes de colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los queratinocitos (Figura 1, la matriz).
En la Figura 2, se observó que los fibroblastos en lugar de queratinocitos fueron los principales productores de colágeno VII. Este es el primer informe de colágeno VII depositado con éxito in vitro (Benny et al, 2015).
La matriz derivada de células se caracterizó por medio de inmunofluorescencia utilizando antibod específicaIES. Si bien este es un enfoque clásico, que era importante visualizar el ECM en su totalidad y apreciar plenamente el efecto de los Crowders macromoleculares. Usando microscopía de interferencia de reflexión (IRM), fue capturado el alcance total de la matriz (Figura 3). Una superposición de la tinción de anticuerpos de la imagen de IRM con muestra la cantidad relativa de ese componente de ECM en relación con la cantidad total de ECM.
En un modelo 3D in vitro de la piel, MMC condensa el tiempo de cultivo a partir de 5 semanas a 3 semanas para obtener una piel de co-cultivo organotípicos madura (Figura 4). Una tinción con hematoxilina y eosina mostró que a las 3 semanas, el cultivo con Crowders macromoleculares consistía en una epidermis estratificada y pluri-dermis ricos del estroma, en comparación con los cultivos de control con poca gente que carecían de una epidermis completamente diferenciada. Además, se detectó la inmunotinción intensa y continua VII de colágeno en la dermisunión l-epidérmica de cultivos de células de hacinamiento, en comparación con una débil e irregular inmunotinción VII de colágeno en cultivos de control. Microscopía electrónica de transmisión (Figura 5) mostró la presencia de fibrillas de anclaje en cultivos organotípicos, mostrando VII de colágeno funcional.
Figura 1: aglomeración macromolecular mixto (MMMC) mejora la deposición de componentes de unión dermo-epidérmica in vitro (A) Colágeno I deposición se ve reforzada por MMMC (capa de células y la matriz) en sólo fibroblastos.. El hacinamiento de co-cultivos producen los más colágeno I y muestran que los queratinocitos estimula la producción de colágeno I por los fibroblastos. (B) El colágeno IV deposición por fibroblastos se ve reforzada por el hacinamiento. Esto se ve más claramente aún en hacinamiento o co-cultivos. Es de destacar que keratinocytES tinción para colágeno IV muestran su mayoría celular asociado o intracelular colágeno IV, pero no una matriz pericellular. En co-cultivos, ambos tipos de células segregan con colágeno IV predominantemente asociada con fibroblastos ahorradores islas de queratinocitos. Deposición (C) La fibronectina se observó sólo con fibroblastos, y en ella fuertemente reforzada por el hacinamiento (capa de células y de la matriz). En co-cultivos, una malla reticular de fi fibronectina se asoció con sólo fibroblastos, ahorradores de islas de queratinocitos. Barras de escala = 20 m. Esta cifra ha sido modificado a partir de Benny et al., 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mezclado aglomeración macromolecular (MMMC) facilita la deposición deel anclaje de colágeno VII edificio fi Bril. (A) Un patrón reticular de deposición de colágeno VII deposición es evidente con fibroblastos sólo bajo MMMC. En co-cultivos, extracelular de colágeno VII está fuertemente asociado con colonias fi broblastos de entre las islas de queratinocitos. Los queratinocitos muestran VII colágeno pericelular e intracelular expresa con más fuerza en la presencia de MMMC. Después de la lisis celular, huellas de colágeno VII se ven en una capa granular fi ne en cultivos de fi broblastos tratados con MMMC, pero una deposición fi brillar discernibles se recuperan de co-cultivos. (B) Análisis de inmunotransferencia de capas de células lisadas muestra que ambos llenos de gente fibroblastos y cultivos de queratinocitos contienen significativamente más colágeno VII en comparación con los controles con poca gente. El colágeno VII recuperada se deriva principalmente pericellular. (C) El análisis densitométrico de B muestra que MMMC aumenta la cantidad de células asociadod colágeno VII por un factor de 8 en fibroblastos y un factor de 2 en los queratinocitos. Barras de escala = 20 m. Esta cifra ha sido modificado a partir de Benny et al., 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fibroblastos huellas contienen más ECM total, como se visualizó por la interferencia microscopía de reflexión (IRM) En el análisis de los componentes de ECM individuales (colágeno IV y fibronectina fi), cultivo bajo MMMC mejoró el depósito extracelular.. Para visualizar el ECM total depositado, IRM se utilizó para cuantificar todos los ECM como la tinción de anticuerpos tenía sus limitaciones. IRM mostró claramente la cantidad total de la matriz y el patrón bajo MMMC en comparación con las condiciones de control. Barra de escala = 20 micras. Esta cifra ha sidomodificado de Benny et al., 2015. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Macromolecular Mixta hacinamiento (MMMC) durante la fase sumergida aumenta la maduración de la unión dermo-epidérmica (DEJ) en equivalentes de piel fibroblastos que contienen geles de colágeno se sembraron con los queratinocitos en la parte superior y se mantienen sumergidos durante 1 semana, y luego levantó a una interfase aire-líquido. En el protocolo clásico, colágeno VII (verde) estaba ausente después de un total de 3 semanas en cultivo, pero apareció en equivalentes de piel después de 5 semanas. Por el contrario, bajo MMMC, colágeno VII ya era muy evidente después de 3 semanas e incluso más fuertemente manchado después de 5 semanas en comparación con los cultivos convencionales. Hematoxilina y eosina (20 aumentos) c tinciónen fi rmó que con este protocolo rápido, la estratificación y la madurez del equivalente de piel se mantiene y se aceleró. Barra de escala = 100 micras. Esta cifra ha sido modificado a partir de Benny et al., 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Evidencia de la formación de novo de anclaje fibrillas en equivalentes de piel obtenidos en los estudios MMMC ultraestructurales de la naciente unión dermo-epidérmica de organotípicos co-cultivos después de un protocolo de cultivo de 3 semanas con MMMC (A, B) sugiere estructuras similares a anclar fibrillas (flechas) que están ausentes en los equivalentes de piel no lleno (c) después de 3 semanas de cultivo. Esta cifra se ha modificado from Benny et al., 2015. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
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