Summary
초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.
Abstract
우리 연구소는 최근 자연 살해 (NK) 세포가 암 세포가 β - 갈 락토 - 결합 렉틴 galectin의 발현에 결함이 렌더링되는 경우 두개 내 생착 후 CNS-1 악성 신경 교종 곧 동소 이식 마우스 GL26과 쥐를 박멸 할 수 있음을 보여 주었다 -1 (GAL-1). 최근의 연구는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 인구는이 효과에 중요한 것을 알 수있다. 더 NK와 골수 세포가 우리가 단리 교종 함침 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)의 분석을위한 광범위한 프로토콜을 개발했다 GAL-1 결핍 종양 거부를 부여하기 위해 협력하는 메커니즘을 이해하기. 이 방법의 종양 미세 환경 내로 침투 PBMC를 비교하여 여기에서 설명된다 shRNA를 녹다운 통해 GAL-1 결핍 렌더링하는 것과 GL26 교종을 GAL-1 발현. 프로토콜에 대한 설명으로 시작하는 방법 문화와 GL26 가전을 준비동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접종에 대한 재편. 그러므로 초기 뇌 종양 미세 환경에서 신경 교종 함침 된 PBMC의 분리 및 유세포 분석에 관련된 단계를 설명한다. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 실험 디자인에 적용 할 수있다. 교종 함침 된 PBMC는 독립적 인 실험 내내 시점 유사한 종양에서 관찰 유사한 세포 수와 24 시간 후 종양 생착 자마자 두개 내 종양으로부터 분리 될 수있어서, 민감하고 재현성이다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출에서 방법을 수행 할 수있다. 대안 교종 모델 및 / 또는 셀 특정 검출 항체는 또한 몇몇 다른 immun의 침윤을 평가 experimentalists '판단에 사용될 수있다전체적인 절차 변경 없이도 관심 E 세포 유형.
Introduction
신경 교종은 중추 신경계 (CNS)에서 발생하는 변형 신경교 neuroepithelial 뇌암의 클래스이다. 모든 신경 교종의, 세계 보건기구 (WHO) 등급 IV 신경 교종, 또는 아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 1 치명적이다. GBM은 테모 졸로 마이드 2 방사선 플러스 수반과 보조 화학 요법 다음에 가능한 범위에 종양 절제술로 구성되어 현재의 표준 진료에 매우 내화입니다. 이 치명적인 암 5 년 3 후에 질병을 생존 환자의 5 %와 초기 진단의 시간에서 생존의 15-18개월의 실력 예후를 수행한다.
혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재는, 전문적인 항원 제시 세포의 부족 (장갑차) 및 뇌 내에서 4 선의 림프 구조의 존재는 이전 미확인 특권 면역 GBM의 개념을 이끌어왔다. 그러나, 많은 연구가 지금 SHO이러한 뇌 암은 참으로 단핵구, 대 식세포 및 골수 유래 억제 세포 (MDSCs) (5)를 포함 기원에 주로 골수 있습니다 주변 면역 세포의 채용을 발생시킬 것을 승. GBM은 6,7 프로 종양 될 뇌 상주 미세 아교 세포의 활동에 영향을 미친다. 이러한 CD8 + T 세포 (8)과 CD56 + 자연 살해 세포 (9) 등의 림프 세포는 종양 미세 환경 내 존재하지만 훨씬 적은 숫자 생각 사실 (인해 종양 연관된 대 식세포에 신경 교종 - 유래 요인에 의해 유발 면역 기능 할 TAMS) 10. CD4 + T 세포는 GBM도 존재하지만이 인구의 대부분은 CD25 및 Foxp3를, 면역 T 규제 (T의 REG) 셀 (11)의 업체를 표현한다. GBM의 전반적인 면역 억제 상태는 면역 탈출 및 종양 진행 (12)의 증진에 절정.
13-19을 개발하기 위해 뇌 종양 immunosuppresson의 메커니즘을 극복하기 위해 노력하고있다. 이 작품의 절정은 이제 새로 진단 GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov 식별자) 환자 결합 된 세포 독성 및 면역 자극 치료를 평가하기위한 임상 시험을 주도하고있다.
가장 최근의 연구는 마우스 GL26 쥐 CNS -1- GBM 셀 β - 갈 락토 시드 - 결합 렉틴 galectin-1 (GAL-1) ~ (20)의 대량 생산함으로써 항암 NK 세포의 면역 감시를 차단하는 것으로 나타났다. 이것은 shRNA를 매개 유전자 녹다운을 사용하여 신경 교종 세포의 GAL-1의 발현을 억제함으로써 입증되었다. 시험 관내 experimenTS는 GAL-1 결핍 신경 교종 세포 배양에 정상적으로 증식 것으로 나타났다, 아직 동계 C57BL / 6J 또는 RAG1에 두개 내 생착 후 곧 빠른 거절을 시행 - / - 마우스, 따라서 이러한 형태에 T- 또는 B- 세포의 독립성을 확립 종양 제거. 안티 아시 알로 GM 1 항혈청 또는 GAL-1 결핍 신경 교종 제거에서 NK 세포의 역할을 설정하는 두개 GAL-1 결핍 교종 성장의 완전한 회복되었다 모노클 NK1.1 항체와 NK 세포 immunodepletion. 우리는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 immunodepletion 표시하는 따라서 NK 매개 GAL의 돕는데 골수 세포를위한 필수 불가결 한 보조 역할을 드러내는, NK 세포의 존재에도 불구하고 GAL-1 결핍 신경 교종 제거를 방지하기에 충분한 -1 결핍 종양 용해 (게시되지 않은 데이터). 이는 예기치 않은 결과는 말초 혈 단핵 세포의 분리 및 분석 (한 PBMC)를위한 광범위한 프로토콜을 개발할 주도했음을우리는 더 나은 GAL-1 결핍 신경 교종 거부 조건부 면역 침투 이벤트를 특성화 할 수 있도록 즉시 두개 내 생착 후 뇌 종양 미세 환경에 침투.
방법은 GL26-CIT를 불리는 구조적 익스프레스 mCitrine 형광 단백질은, 형광 현미경 (21)에 의해 직접 종양 세포의 가시화를 허용 GL26 마우스의 신경 교종 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 이 세포들은 정위 동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접목하고, 이전에 마우스 안락사에 24, 48, 또는 72 시간 동안 성장을 사용할 수 있습니다. 신경 교종-침투 PBMC를 다음 항 -CD45를 사용하여 격리 및 immunolabeled되어, -GR-1, -CD11b과 그랜 자임 B의 세포 내 immunolabeling와 함께 -NK1.1 세포 표면 항체 (GzmB). 항체의 이러한 특정 조합이 우리가 B가 종양 침윤 GR-1 + / + CD11b를 골수 세포의 식별 및 NK1.1 +, NK 세포, 세포 유형을 허용EEN는 GAL-1 결핍 종양 제거에 관여. GAL-1 결핍 GL26-CIT의 신경 교종의 면역 침투 프로파일, GL26-CIT의-gal1i 여기에 언급하고 비를 포함 GAL-1 GL26-CIT의-NT 호출의 정상 수준을 발현하는 신경 교종의 것과 비교된다 제어 shRNA를 머리핀을 대상으로. 프로토콜 동소 동계 C57BL / 6J 마우스의 선조체로 이들 세포를 접목하는 방법에 대한 설명이 뒤 따른다 시험 관내 배양 방법 GL26-CIT의 신경 교종 세포에 대한 설명으로 시작한다. 그러므로 분리 및 유세포 분석 교종 함침 된 PBMC의 immunolabeling 관련된 단계를 열거 진행한다. 표준 프로토콜은 데이터 분석 및 그래픽 표현의 설명으로 종결.
데모는 밝혀 그 모두 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포와 NK1.1 + NK 세포 우선적으로 48 내 여자-1 결핍 뇌 종양 미세 환경 내에서 축적종양 주입,이 종양이 빠른 속도로 완전한 종양 용해 약 일주 후 종양 생착 (20)를 받아야하는 이유를 설명하는 데 도움이되는 결과의 시간. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 다양한 실험 디자인에 용이하게 적응할 수있다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출로부터 프로토콜을 수행 할 수있다. 방법은 또한 특히 종양 미세 환경에 의해 유도 된 면역 표현형을 식별하도록 뇌 침투 것들과의 비교를 위해 종양 함유 마우스에서 PBMC를 순환 프로파일을 특성화하기 위해 실험 목적과 결합 될 수있다. 이것과 유사한 방법을 적용 뇌 종양 미세 환경 내로 말초 면역 세포의 거래에 관련된 요인의 더 나은 이해를 용이하게한다.
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Protocol
참고 : 실험을 수행하기 전에 전체 프로토콜을 검토하십시오. 동물의 사용과 복지의 해당 기관위원회에서 척추 동물의 사용에 대한 승인은 진행하기 전에 취득해야합니다.
두개 내 생착에 대한 종양 세포의 1. 준비
- 클래스 II 생물학적 안전 캐비넷에서 작동하는 (10 % 멸균 여과 열 활성화 된 우 태아 혈청으로 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)의 500ml의 병을 보충하여 GL26-CIT의-NT / gal1i 세포 배양 배지를 제조하여 FBS를 시작할 ), 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, mCitrine 발현 벡터의 선택 / ㎖의 G418 설페이트 (600 μg의) 및 비 선택 용 퓨로 마이신 염산염 (3 ㎍ / ml의 ) 타겟팅 또는 GAL-1-shRNA를 특정.
- 문화 GL26-CIT의-NT 및 / 또는 GL26-CIT의-gal1i 세포 (그림 1A 및 1B 2 1-2 일 전에 종양의 생착 과정 또는까지 공동 조직 문화 캐비닛 세트의 플라스크 50-80%의 포화 상태에 도달한다.
- 수술 당일에, 10 ㎖의 혈청 피펫 및 피펫 총을 사용 교종 세포로부터 세포 배양 배지를 제거하고 폐기 비이커에 미디어를 폐기.
- - 위쪽 다운 플라스크 전환 및 10 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여 플라스크의 위쪽에 DPBS 10 ㎖를 추가합니다. 천천히 DPBS에서 세포를 충당하기 위해 플라스크를 반전 한 후 플라스크를 수직으로 팁을 제거하고 폐기물 비커에 DPBS를 폐기합니다.
- 추가 각 T75 조직 배양 플라스크에 EDTA와 DPBS 비 포유 동물 트립신 대안 (자세한 내용은 자료의 목록 참조)의 3 ~ 4 mL 및 2-5 분 동안 다시 조직 문화 캐비닛에 넣습니다. 밝은 필드 현미경을 사용하여 모든 셀이 바닥면의 사전 절차에 떨어지지 있는지 확인하십시오.
- furthe 금지DPBS 6 mL를 트립신 대안을 희석하여 R 효소 활성. 피펫 최대 플라스크의 바닥면을 씻어 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 기계적으로 어떤 세포 집계를 떼어 놓다 아래로. 세포를 대기음 각각 표시 15 ml의 원심 분리기 튜브에 배치합니다. 4 ° C (그림 1C)에서 5 분 동안 550 XG (최대 RCF)에서 세포를 스핀 다운.
- 상층 액을 제거하고 부드럽게 않은 보충 DMEM의 1 ml의 세포를 재현 탁. 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해 P-1000 마이크로 피펫으로 위아래로 철저하게 세포를 피펫해야합니다.
- 종양 세포 현탁액을 2 μL를 첨가 한 후 0.6 ml의 원추형 폴리 프로필렌 마이크로 튜브로 보충되지 않은 DMEM 18 μL를 넣어 1.6 발생 얻어진 세포 현탁액의 1:10 희석액을 만든다. 최대 피펫 철저히 세포를 균질화 P-10 마이크로 피펫을 사용하여 아래로.
- 10 μl를 추가 &# 160; 0.6 ml의 분리 된 폴리 프로필렌 원추형 마이크로 튜브에 1.7에서 생성 1시 10분 종양 세포 희석 후 튜브로 트리 판 블루 염색의 10 μL를 추가한다. 철저히 P-10 마이크로 피펫과 혼합 기포 (그림 1D)를 소개 않도록주의하면서 혈구의 상단에 배치 유리 커버 슬립 아래의 결과 종양 세포 / 트리 판 블루 용액 10 μl를 추가합니다.
- 주어진 혈구와 연관된 특정 프로토콜에 따라 10 배 대물를 사용 명 시야 현미경으로 세포를 카운트. 원래 1 ML의 나누어지는 정확한 세포 추정을위한 세포의 준비 중에 원래의 종양 세포 현탁액의 20 배 희석 감안해야합니다. 세포의 총 수를 계산하기 위해 다음과 같은 수식을 사용하여 총 세포 / ㎖ = [((Σcells 평방 당 계산) / 계산 사각형의 #)이 20 (즉, 희석 배수)이 10,000 세포 / ㎖ X X]를.
- D 후,주어진 실험에 사용 된 각 세포주에 대한 세포의 총 수를 etermining, 4 ° C에서 5 분 동안 550 XG (최대 RCF)에 그들을 다운 스핀. 다음 식에 따라 각각의 세포주에 대해 3 × 104 세포 μL 당 1의 목표 농도를 달성하기 위해 비 - 보충 된 DMEM의 적절한 부피의 세포 상등액을 분리하고 재현 탁 (세포의 총계를 / 30,000).
- 얼음에 각각 표시 0.6 ML 원뿔 폴리 프로필렌 튜브와 장소에 각각의 세포주 (그림 1E)의 동등한 볼륨을 놓습니다. 별도의 T75s 이전에 접종되지 않은 경우 각 셀 라인을 전파 계속 몇 가지 세포를 저장해야합니다.
C57BL / 6J 마우스의 선조에 신경 교종 세포의 생착 정위 2. 절차
- 다음과 같이 수술하기 전에 수술 마취, 진통, 마취 반전의 솔루션을 작업 준비 :
- 케타민 / 덱스 메데 토미 딘 s의urgical 마취 : 멸균 된 0.9 % NaCl을 주입 10 ㎖ 바이알에서 1.4 ml의 제거와 케타민 히드로 클로라이드 100 ㎎ / ㎖ 스톡 용액 600 μL 및을 수득 덱스 메데 토미 딘 염산염 0.5 ㎎ / ㎖ 스톡 용액 800 μL로 대체 케타민 히드로 클로라이드 (6 ㎎ / ㎖) 및 덱스 메데 토미 딘 염산염 (0.04 ㎎ / ㎖)의 혼합 작업 용액.
- 부 프레 노르 핀의 진통 들어 : 멸균 된 0.9 % NaCl을 주입 10 ㎖ 바이알에 1 ml의 제거 및 0.03 ㎎ / ㎖ 작업 용액을 수득 한 0.3 ㎎ / ㎖ 스톡 프레 노르 핀 염산염 앰플의 전체를 1 ㎖의 용적으로 대체.
- atipamezole 수술 마취 환입 : 멸균 된 0.9 % NaCl을 주입 10 ㎖ 바이알에 1 ml의 제거 및 0.5 ㎎ / ㎖ 작업 용액을 수득 atipamezole 히드로 클로라이드의 5 ㎎ / ㎖ 스톡 용액 1 ㎖로 교체한다.
- 마우스 생존 초 동안 승인 된 위치에서 작업urgery, 다음 연구를 위해 필요한 충분한 8-10주 된 암컷 C57BL / 6J 마우스 (GL26 교종과 동계)을 얻었다 (도 2A)에 도시 된 바와 같이 비드 또는 소독 멸균 된 수술 도구 및 기타 시약을 설정함으로써 시작한다; 음식과 물에 자신의 지속적인 액세스를 보장합니다.
- 75 ㎎ / ㎏ 케타민 0.5 ㎎ / ㎏ 덱스 메데 토미 딘 (20g 마우스에 대한 약 250 μL)의 용량을 제공하여 작업 마취 솔루션의 단일 복강 내 (IP) 주입을 가진 첫번째 마우스를 마취. 다음으로, 카프로 펜의 5 ㎎ / ㎏ 피하 (SC) 주사를 제공 (20g 마우스에 대한 약 100 μL). 마우스를 진행하기 전에 발가락과 꼬리 핀치에 응답하지 있는지 확인하십시오.
- 수술 가위를 사용하여 두개골에서 모피를 면도. 면도 지역에 포비돈 - 요오드 살균 솔루션을 적용, 70 % 이소 프로필 알코올 준비 패드 스크럽 후 포비돈 - 요오드 소독액을 다시 적용. 다음에, steri 소량 적용제작은 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 안과 용 연고를 바셀린.
- 다음의 프로토콜에 따라 정위 프레임 두개골을 확보 :
- 조심스럽게 부드럽게 혀를 당겨 질식 방지하기 위해 입 한쪽으로 이동 곡선 해부 포셉 한 쌍에 도달하여 입을 엽니 다. 집게가 정위 프레임의 치아 바의 열쇠 구멍에 상단이 앞니를 열고 턱을 전파하고 안내하는 입에 동안을 철회 할 수 있습니다. 각각의 나사를 조정하여 수평 또는 수직으로 선회에서 치아 막대를 고정합니다. 마우스의 두개골은 벤치 상단 레벨인지 확인하십시오.
- 안전하게 파쇄 방지하기 위해 두개골에 너무 안쪽으로 압력을 가하지 않도록주의 두개골의 postorbital 뼈에 귀 막대를 놓습니다.
- 주둥이를 통해 코 줄을 놓고 아늑한 때까지 조입니다. 부드러운 압력을 적용하여 머리에는 수직 / 수평 이동이 없다는 것을 확인엄지 손가락과 검지 손가락으로. 제대로 정위 프레임에 배치 마우스 (그림 2B)에 표시됩니다.
- 메스 블레이드를 사용하여, 뒤통수 뼈에 정면 뼈의 두개골을 통해 1cm의 중간 선 절개를합니다. 콜리 블리 견인기를 사용하여 피부 절개에 후퇴.
- 직접 브레 그마의 위치 (도 2C) 상기 정위 프레임의 수직 아암 (33)에 연결된 G 바늘을 갖춘 마이크로 리터 주사기를 낮출. 여기에서 종양 주입 표적 부위에 도달하는 바늘 +0.5 mm의 AP의 위치, +2.5 mm ML을 조정한다. 부드럽게 골막을 통렬하게 비판하여이 위치를 표시하기 위해 26 G 바늘이 장착 된 1 ML의 투베르쿨린 주사기를 사용합니다.
- 1/32 "(0.8 mm) 비트 갖춘 무선 정밀 전원 드릴을 사용하여 기본 뇌경막에 도달 할 때까지 목표 부위에서 두개골에 구멍을 뚫는다. 드릴링 동안 DRI 제거하여 간헐적 인 압력을 적용두개골의 표면에서 LL 비트는 달리 기본 뇌 조직을 천공 드릴 비트의 원인이 과도한 열과 힘을 방지 할 수 있습니다.
- 바늘은 폐색되지 않도록 1.7 ml의 원추형 폴리 프로필렌 마이크로 튜브에 0.9 % NaCl을 가진 마이크로 리터 주사기 플러시. 부드럽게 세포를 재현 탁하는 종양 세포를 여러 번을 함유하는 0.6 ml의 원추형 폴리 프로필렌 마이크로 튜브를 가볍게.
- 기포가 주사기로 도입되지 않도록 보장 마이크로 리터 주사기로 세포의 2 μL를 그린다. 주사기 내에 잔류 종양 세포의 정확히 1 μl를 떠나는 70 % 이소 프로필 알코올 준비 패드 상에 셀 1 μL 분주.
- 이 뇌경막에 닿을 때까지, 다음 -3.5 mm의 복부 뇌에 바늘을 소개하고 0.5 mm 정도 철회 아래 바늘을 가져와. 천천히 부드럽게 1-2 분에 걸쳐 주사기 플런저를 누름으로써 세포를 제공한다.
- 세포가 settl 허용5 분 전에 천천히 바늘을 인출하기위한 주사 부위 E. 깨끗한 70 % 이소 프로필 알코올 준비 패드 바늘의 끝에서 어떤 응고 된 혈액이나 뇌 물질을 닦습니다. 바늘을 씻어 바늘이 다음 주입 막힌되지 않도록 단계 2.6에서 0.9 % NaCl로 철저하게 주사기.
- 콜리 브리의 견인기를 제거하고 세 3-0 나일론 모노 필라멘트 봉합사를 사용하여 두피를 봉합. 정위 프레임에서 마우스를 제거하고 염산염 피하 (SC) 부 프레 노르 핀의 0.1 ㎎ / ㎏을 투여 (약 20g 마우스의 0.03 ㎎ / ㎖ 작업 용액 67 μL) 2.5 mg의 다음 / ㎏ atipamezole 염산염 근육 (IM) 수술 후 통증과 마취 반전을위한 (20g 마우스에 대한 0.5 ㎎ / ㎖ 작업 용액의 약 100 μL). 다시 복구하는 가열 램프 아래에 자신의 새장에 수술 후 마우스를 놓습니다.
3. 마우스 Transcardial Perfus뇌의 이온 및 수확
- 다음 프로토콜에 따라 헤파린 타이로드의 솔루션을 준비합니다 :
- 1 L 유리 스크류 캡 저장 병에 자기 교반 막대를 넣고 초순수 탈 이온수로 볼륨을 작성하십시오. 교반 접시에 병을 놓습니다.
- 교반하면서 체중 및 유리 병에 다음의 화학 물질을 추가 8g의 염화나트륨, 0.264 g의 염화 칼슘 (CaCl2를 • 2H 2 O), 0.05 g의 인산 나트륨 일 염기 (NaH를 2 PO 4 • 2H 2 O), 1.0 g D- 글루코스 (C 6 H 12 O 6), 1.0 g의 중탄산 나트륨 (NaHCO3), 0.2 g 염화칼륨 (KCl). 염이 용해 후 타이로드의 솔루션에 헤파린 나트륨의 1,000U / ㎖의 원액 100 μL를 추가 할 수 있습니다.
- 교반 판에서 컨테이너를 제거하고 자기 지팡이를 사용하여 교반 막대의 압축을 풉니 다. 4에서 헤파린 타이로드의 솔루션을 저장기음.
- 다음과 같이 터미널 마취에 대한 작업 솔루션을 준비합니다 :
- 케타민 / 자일 라진 단말 마취 : 멸균 된 0.9 % NaCl을 주입 10 ㎖ 바이알에서 1360 μL를 제거하고 케타민 히드로 클로라이드 100 ㎎ / ㎖ 원액 1200 μL 및 자일 라진 100 ㎎ / ㎖ 원액 160 μL로 대체 염산염 케타민 하이드로 클로라이드 (12 ㎎ / ㎖)와 자일 라진 하이드로 클로라이드 (1.6 ㎎ / ㎖)의 혼합 작업 용액을 얻었다.
- 멸균 된 플라스틱 용기에 초순수 탈 이온수 (3.93x) 264 ml의에 90 ml의 10 배의 PBS를 배치하여 밀도 원심 분리 미디어 믹스 솔루션을 준비합니다. 염산으로 pH 7.0-7.2로 적정하고 0.22 μm의 필터를 통해 살균 필터. 4 ℃에서 보관하십시오.
- 재료의 목록을 볼 (밀도 원심 매체 30 ml의 밀도 원심 미디어 혼합 용액 18 mL를 조합하여 70 % 농도를 원심 분리 매체를 준비50 ㎖ 폴리 프로필렌 원심 분리 관에서 세부 사항)에 대한. 4 ℃에서 보관하지만, 사용하기 전에 실온으로 가져온다.
- 50 mL의 원심 분리 튜브에 10.4 ml의 70 % 밀도 원심 매체와 DPBS 9.6 mL를 조합하여 37 % 농도를 원심 분리 매체를 준비한다. 4 ℃에서 보관하지만, 사용하기 전에 실온으로 가져온다.
- 50 mL의 원심 분리 튜브에 DPBS (~ 1 % FBS)을 50ml로 FBS 500 μl를 배치하여 유동 버퍼를 준비한다. 4 ° C에서 상점에 저장
- 얼음 칩 용량 4.5 L 폴리 우레탄 얼음 양동이를 입력합니다.
- 10 ㎎ / ㎖ DNase의-I 원액 1:10 50 mg을 희석하여 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 1 밀리그램 / 연구에서 뇌 샘플 당 1 ml의 충분한 양의 DNase-I ML의 통합 솔루션을 확인 / 하나의 15 ml의 폴리 프로필렌 원심 분리 관에 멸균 DPBS와 ML의 콜라겐 원액 1:50. 부드럽게 피펫 팅과 P-1000 마이크로 피펫과 함께 아래로 솔루션을 섞는다. polyureth에 얼음에 저장단계 3.7에서 메탄 버킷.
- 두 7 mL 유리 다운스 조직 분쇄기를 얻습니다. 한 "NT"와 "gal1i"다른 레이블. 얼음 통에 조직 분쇄기를 놓고 각 DPBS 1 ㎖를 추가합니다.
- 얼음 양동이에 연구와 장소에 각 마우스에서 뇌 물질을 수집하기에 충분한 15 ML의 원심 분리기 튜브를 얻습니다.
- 얼음 통에 세 50 ㎖ 원심 분리기 튜브 사이 DPBS의 장소 ~ 150 ml의.
- 연구에서 각각의 마우스에 대한 충분한 폴리스티렌 육각 무게 요리 (위 내경 (ID) 115mm, 기본 ID 85mm, 203 ml의 볼륨)을 얻습니다. 해부와 마우스 뇌의 분쇄를위한 완벽한 셋업이에 표시됩니다 (그림 3A)
- 선택된 시점에서, 150 mg의 단일 IP 주입을 이용한 연구에서 제 담암 마우스를 마취 / 케타민 히드로 클로라이드 kg 및 20 밀리그램 / kg 자일 라진 하이드로 클로라이드 (합성 12 ㎎ / ㎖ 케타민 약 250 μL / 1.6 mG 20g 마우스에 대한 솔루션을 작동 / ㎖ 자일 라진)의 깊은 마취를 유도합니다. 마우스가 이전 절차에 발가락과 꼬리 핀치에 비 응답이 있는지 확인하십시오.
- 이전에 준비 타이로드의 솔루션을 검색하고 단말기 동물 수술에 전념 층류 후드에 배치합니다. 타이로드의 솔루션으로 carbogen 탱크에 부착 된 가스 투과성 고분자 튜브를 놓습니다. 솔루션에 지속적으로 거품에 95 %, O2 / 5 % CO 2 carbogen을 허용하도록 탱크 밸브를 엽니 다.
- 연동 펌프에 연결된 추가 가스 투과성 고분자 튜브의 끝에 20 G 알루미늄 허브 무딘 바늘을 연결합니다. 타이로드의 솔루션에 연동 펌프의 다른 쪽 끝에서 튜브를 삽입하고 튜브가 산소와 헤파린 타이로드의 솔루션을 기입 할 수 있도록하기 위하여 펌프를 켜십시오. 마우스 transcardial 관류에 대한 설정 (그림 3B)에 표시됩니다.
- 네 26 G 바늘을 사용하여, 아래로 핀층류 후드에서 처리 흡수성 수건으로 덮여 압출 발포 폴리스티렌 블록의 앞면과 뒷 발에 의해 마취 마우스 복부 측면까지.
- 복강 위의 피부 무딘 해부 포셉 한 쌍을 사용하고, 해부 가위의 큰 쌍에 종료 할 수있는 흉골에서 용 분기 다음, 다이아 프램에 구멍에 cephalically 절단, 복막 벽을 관통하여 "Y"절개를 사용을 잡고 좌우 겨드랑이.
- 흉골을 고정하고 마우스의 왼쪽 어깨 너머로 흉곽을 반영하기 위해 지혈제를 사용합니다. 무딘 해부 포셉의 쌍 심낭을 제거합니다.
- 산소 및 헤파린 타이로드의 솔루션 (약 2.3-2.5 ml / 분)의 꾸준한 물방울을 시작 연동 펌프를 켭니다.
- 심장의 좌심실에 무딘 바늘을 삽입합니다. 방혈 수 있도록 우심방을 싹둑 해부 가위의 작은 쌍을 사용하여 (그림3C).
- 간, 폐 완전히 인해 혈액 부족 희게까지의 타이로드 용액 철저 마우스 순환 시스템을 관류 할 수있다. 혈액에는 총 금액은 좌심실에서 20 G 알루미늄 허브 무딘 바늘을 제거하기 전에 우심방을 종료 계속 없는지 확인하십시오.
- 압출 발포 폴리스티렌 블록에서 마우스를 고정 해제 아래로 마우스 복부 측면을 켭니다. 해부 위 큰 쌍을 사용하여, 넥의 수준에서 본체의 나머지 헤드를 분리한다.
- 해부 위 작은 쌍을 사용하여, 두개골을 노출시키기 위해 작동하는 주둥이를 향해 전진 후두골에서 시작하여 중앙선에서 두피를 잘랐다.
- 엄지와 집게 손가락을 사용하여 두개의 양측에서 피부를 수축 안전하게 두개골을 잡아. 완전히 지느러미와 측면을 노출 뒤통수 뼈에서 시작 두개골을 통해 휴식과 앞으로 일을 뼈 Rongeurs 한 쌍을 사용하여뇌의 표면. 뇌의 손상을 최소화하기 위해주의해야합니다.
- 두개골 뼈가 제거되고 나면, 마우스 복부 쪽이 위의 머리를 켜고 두개골에서 해방하기 위해 뇌의 기지에서 두개골 신경을 잘라 해부 가위의 작은 쌍을 사용합니다.
신경 교종 - 침투 PBMC를 4. 분리
- 깨끗한 단일 양날 면도날을 사용하여, 두 개의 반구를 이등분하는 뇌의 시상 중심 다운 컷함으로써 종양을 포함하는 뇌 영역을 격리. 아래 동측 반구 내측 측의 전원을 켜고 소뇌 종양 임플란트 (그림 4A)를 포함하는 표적 조직을 분리 할 수있는 후각 망울의 수준에서 두 개의 코로나 컷을합니다. 반대쪽 반구의 상당 부분은 또한 단리 및 음성 대조군으로서 사용될 수있다.
- 1㎖를 함유 각각 표시된 유리 다운스 조직 분쇄기로 표적 조직을 배치; DPBS의, 조직을 처음을 방해하는 7 번 모든 방법을 아래로 플런저와 트위스트를 밀어 넣습니다. 플런저는 액체가 조직 분쇄기의 바닥으로 다시 정착 할 수 있도록 리프트. 세 번이 단계를 반복합니다; 그러나 단지 조직을 분쇄하여 이상 피하기 위해 마지막 반복시 플런저에게 다음 두 반복하는 동안 4 번과 3 번을 비틀.
- P-1000 마이크로 피펫을 사용하여, 순차적으로 조직 분쇄기로 헹구 플런저의 측면을 따라 (3.11 제조) 빙냉 DPBS 세 1ml의 볼륨을 적용한다.
- 로 pipetting하여 분쇄 뇌의 문제를 재현 탁하고 아래 얼음에 표시된 15 ㎖의 원심 분리 관에 배치합니다. 얼음처럼 차가운 DPBS 1 추가 mL로 다운스 조직 분쇄기의 측면을 씻어 같은 15 ML의 원심 분리기 튜브에 추가 할 수 있습니다. 모든 샘플이 처리 될 때까지 얼음 분쇄 뇌 물질을 포함하는 모든 튜브를 유지합니다.
- 반복 연구에서 각각의 마우스 3.13-3.25 및 4.1-4.4 단계를 반복합니다.
- 모든 샘플 하 일단4 ℃에서 20 분 동안 740 XG (최대 RCF)에서 15 ml의 원심 분리기 튜브에 분쇄 뇌 물질을 스핀 다운, 처리했습니다.
- 10 ㎖의 혈청 학적 피펫과 피펫 총 뜨는을 제거하고 이전에 제조 된 콜라게나 제 / 1 ml의 펠렛 뇌의 문제를 재현 탁 DNase의-I는 P-1000을 사용하여 효소를 소화. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 테스트 튜브 랙과 장소에 15 ml의 원심 분리기 튜브를 놓습니다.
- 부드럽게 조직 세분화를 용이하게하기 위해 튜브를 쓸어 넘겨 인큐베이션 기간 동안 두 샘플을 교반.
- 소화 효소를 희석하기 위해 각 튜브에 10 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여 얼음처럼 차가운 DPBS 6 ML을 추가합니다. 피펫 위아래로 재현 탁, 그리고 얼음에 새로운 레이블이 15 ml의 원심 분리기 튜브로 멸균 70 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 전체 볼륨을 필터링 할 수 있습니다.
- 을 달성하기 위해 4 ℃에서 20 분 동안 740 XG (최대 RCF)에서 뇌 세포 현탁액을 스핀 다운단일 세포 펠렛 (도 4b). 원심 분리기에서 15 ml의 튜브를 제거한 후 얼음에 배치하고 다음 단계에 대비하여 약 21 ℃로 원심 분리기에 설정 온도를 증가시킨다.
- 어느 정도의 뇌 세포를 함유하는 각각의 튜브로부터 상청을 제거하고 초기에 P-1000 마이크로 피펫을 사용하여 70 % 농도를 원심 분리 배지 1 ㎖에 펠릿을 재현 탁. 그런 다음 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 각 튜브에 70 % 밀도 원심 분리 미디어의 4 개의 추가 밀리리터를 추가합니다. 안전 캡을 나사 부드럽게 여러 번 튜브 반전하여 세포 현탁액을 균질화.
- RT에서 테스트 튜브 랙에서 70 % 밀도 원심 얼음에서 미디어 및 장소에 재현 탁 뇌 세포를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브. 한 번에 하나의 신중 교류를 형성하는 P-1000 마이크로 피펫으로 70 % 밀도 원심 매체 5 ㎖에 2 ㎖의 밀도 원심 미디어 용액 37 %의 오버레이두 밀도 원심 분리 미디어 층 (그림 4C) 사이 린 인터페이스를 제공합니다.
- 구분이 덜 명확하게 할 때 쉽게, 원심 분리 후 식별 할 수 있도록 인터페이스의 위치를 표시하기 위해 뾰족한 마커를 사용합니다.
- 인터페이스를 방해하지 않도록 절단없이 실온에서 20 분 동안 740 XG (최대 RCF)에서 15 ml의 원심 분리기 튜브를 스핀 다운.
- 원심 분리 후, 조심스럽게 지방층 우회 측면을 따라 튜브에 P-200 마이크로 피펫을 도입함으로써 두 밀도 원심 매체 층 (도 4d) 사이의 계면에 축적 된 PBMC를 모은다.
- 일단 PBMC 대역의 레벨에서 천천히 70 % 밀도 원심 매체 층의 표면으로부터 200 μL를 추출하고 얼음에 각각 표시된 폴리 프로필렌 FACS 튜브에 배치했다. 샘플 당 400 μL의 총 부피에 대해 한 번 반복합니다.
- 충분히 후, 밀도 원심 매체 희석 4 ℃에서 20 분 동안 660 XG (최대 RCF)에서 세포를 스핀 다운 한 PBMC 400 μl를 각각 함유 FACS 튜브 유동 완충액 3 mL로 추가한다.
신경 교종 - 침투 PBMC를 5. Immunolabeling
- 어떤 실험 PBMC 시료를 분석하기에 앞서, 기준 게이트를 설정하기 위해 하나의 독립적 인 세포 표면 이소 제어 실험을 수행있어서 교종 함침 PBMC를 평가 전용 유세포 데이터 분석 템플릿 내의 고정 PMT 전압들의 세트와 관련 될 다음 프로토콜 :
- , 종양 성장의 72 시간 후 부 (2)에 설명 된 절차에 따라 GL26-CIT의-NT와 GL26-CIT의-gal1i 다른 하나의 C57BL / 6J 마우스를 접목 모두 쥐를 안락사 및 절차에 따라 종양 침투 한 PBMC를 분리 섹션 3과 4를 통해 설명했다.
- 두 PBMC 샘플을 결합 (NT의차 하나의 볼륨 (즉, 100 μL)에 gal1i은) 다음에, 또 세 외과 튜브 (즉, 33.3 "CD45의 이소"라는 레이블이 붙은 튜브 당 μL), "GR-1 / CD11b를 이소 타입"및 "NK1 사이에 균등하게 샘플을 나눕니다. 1 이소. " (1 각 : 100 희석 및 흐름 버퍼 200 μL의 총 부피로 희석) 다음과 같은 항체를 추가 각각 분류 FACS 튜브에 "CD45의 이소"알렉사 플 루어 700 복합 쥐의 IgG2b, κ (클론 : RTK4530을 ); "GR-1 / CD11b를 이소 타입"알렉사 플 루어 700 - 복합 쥐 항 - 마우스 CD45 (클론 : 30-F11), PE-결합 된 쥐의 IgG2b, κ (클론 : eB149 / 10H5),과를 PerCP / Cy5.5 공역 쥐의 IgG2b, κ (클론 : RTK4530); "NK1.1 이소 타입"알렉사 플 루어 700 - 복합 쥐 항 - 마우스 CD45 (클론 : 30-F11), PE - 복합 쥐 항 - 마우스 GR-1 (클론 : RB6-8C5)를 PerCP / Cy5.5 - 복합 쥐 항 - 마우스 CD11b를 (클론 : M1 / 70), 및 APC-접속사비공 액 마우스의 IgG2a, κ (클론 : eBM2a).
- PBMC를 20 분 동안 어둠 속에서 얼음에 immunolabel하도록 허용합니다. 부드럽게 섞어 배양 기간을 통해 한 번 중간 튜브를 가볍게. 흐름 완충액 1 ㎖로 씻어 4 ° C에서 10 분 동안 660 XG (최대 RCF)에서 스핀 다운 및 유동 완충액 200 μL와 PBMC를 FACS를 포함하는 각 튜브를 재현 탁.
- 85 μm의 집적 노즐 장착 플로우 사이토 미터를 사용하여, CD45 간격 게이트 기준선을 설정하는 제 "CD45 이소 타입"튜브를 분석한다. 다음에, 입력으로 만 진정한 CD45 + 세포를 사용하여 기준선 GR-1 / CD11b를 사분면 게이트를 설정하기 "GR-1 / CD11b를 이소 타입"튜브를 실행. 마지막으로, 유일하고 진정한 CD45 입력으로 + / GR-1 낮은 / CD11b를 +/- 세포를 사용하여 기준 NK1.1 간격 게이트를 설정하기 위해 "NK1.1 이소 타입"튜브를 실행합니다.
- 이후의 모든 실험에 대해 다음 절차를 사용하여alysis :
- (GzmB 이소 타입의 플러스 (+) 1) 200 μL 샘플 당 볼륨을 달성하기 위해 유동 완충액 세포 표면 항체의 100 희석 : (1)의 충분한 양을 알렉사 형석 700 공역 생쥐 - 항 마우스 CD45 (클론 : 30-F11 ), PE - 복합 쥐 항 - 마우스 GR-1 (클론 : RB6-8C5)를 PerCP / Cy5.5 - 복합 쥐 항 - 마우스 CD11b를 (클론 : / 70 M1), APC - 복합 마우스 항 - 마우스 NK1.1 (클론 : PK136).
- 메 니스 커스가 바로 세포 손실을 방지하기 위해 각 FACS 튜브 (~ 50 μL)의 바닥 위에까지 조심스럽게 4.15에서 스핀 다운 PBMC를의 상층 액을 제거합니다. P-200 마이크로 피펫으로 잔여 유동 완충액을 이용하여 각각의 FACS 튜브 내의 한 PBMC를 재현 탁하고 각 FACS 튜브에서 (샘플 1 / #) 볼륨의 가치를 삭제하고 "풀링 이소 타입"이라는 새로운 FACS 튜브에 결합한다.
- 각 PBMC 시료를 제조 5.2.1 세포 표면 항체 칵테일 200 μL를 추가한다. PBMC를 20 분 동안 어둠 속에서 얼음에 immunolabel하도록 허용합니다. 톡 T잠복기를 통해 중간 부드럽게 혼합하면 그는 튜브.
- 흐름 버퍼 1 ㎖로 세척; 660 XG (최대 RCF)에서 스핀 다운은 4 ° C에서 10 분 X.
- 어둠 속에서 얼음에 15 분 동안 시판되는 포르말린 기반 정착액의 200 μL에서 PBMC를 (자세한 내용은 자료의 목록 참조)가 포함 된 모든 외과 튜브를 재현 탁. 부드럽게 섞어 배양 기간을 통해 한 번 중간 튜브를 가볍게.
- 시중에서 판매하는 1X의 투과성으로 / 세척 버퍼 1 ㎖ (자세한 내용은 자료의 목록 참조)로 세척하고 4 ℃에서 10 분 동안 660 XG (최대 RCF)에서 스핀 다운.
- 샘플 당 200 μL 부피를 달성하기 위하여 (GB11 클론) 1X 투과성으로 / 세척 완충액에 세포 내 항체 퍼시픽 블루 접합 마우스 항 - 마우스 GzmB 100 희석 : PBMC를 아래로 회전하고있는 동안, 하나의 충분한 양을 준비한다.
- 퍼시픽 블루-CON 100 희석 : 별도의 튜브에, 1의 단일 200 μL 볼륨을 준비고도로 시알 릴화 된 쥐의 IgG1, κ (클론 : MOPC-21) 이소 타입 대조군 항체.
- 이소 타입 항체의 100 희석 : 1의 200 μL 부피 "풀링 이소 타입"이라는 단일 FACS 튜브 항 마우스 GzmB 항체 100 희석 및 재현 탁 : 1의 200 μL와 실험 PBMC 시료를 각각 재현 탁.
- 모든 PBMC 샘플을 20 분 동안 어둠 속에서 얼음에 immunolabel하도록 허용합니다. 부드럽게 섞어 배양 기간을 통해 한 번 중간 튜브를 가볍게.
- 흐름 버퍼 1 ㎖로 세척; 분석을위한 흐름 버퍼 200 μL 4 ° C와 재현 탁 PBMC를에서 10 분 동안 660 XG (최대 RCF)에서 스핀 다운.
- 이전 5.1 절 22 년에 설립 된 신경 교종-침투 85 μm의 통합 된 노즐을 사용하여 PBMC를하고 게이트와 PMT 전압을 분석 cytometrically 흐름. 사이토 교종-infilt 총수의 공정한 비교를 위해 흐름에 각 시료의 전체 볼륨을 실행해야각 샘플의 평가 PBMC를.
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Representative Results
다음 게이팅 전략은 일반적인 실험에 사용되는 : FSC-SSC-대 → SSC-H 대 SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 대 대 카운트 → GR-1 대 CD11b를 → 카운트 대 NK1.1. 게이트는 GzmB 표현 (도 5a)에 기초하여 층화 GR-1 + / + CD11b를 골수 NK1.1 + 세포 및 NK 세포에 배치. NK1.1 + NK 세포 및 GR-1 + / CD11b를 SSC-A는 NK 세포의 작은 림프 크기 및 골수 세포의 비교적 큰 크기를 확인 대 FSC-A 상 실험에서 + 골수 세포 (식별 해당 셀을 백 게이트 그림 5B). 원 데이터 파일 (예., FCS 파일) 등으로서 시판 Flowjo 유세포 데이터 분석 소프트웨어에 의해 분석된다.
18 C57BL / 6J 마우스의 총이 방법을 보여주기 위해 사용되었다. 나인 (9) GL26-CIT의-NT에 접목하고, 9는 같은 D에 GL26-CIT의-gal1i와 접목 된바깥 세포 (3 × 4)의 해당하는 번호를 사용하여. 각 그룹의 마우스는 24 세, 48 안락사, 및 72 시간 후 - 종양 생착되었다. 데이터는 동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 GL26-CIT의-gal1i 신경 교종 세포의 생착이 빠르게 CD45 + PBMC를 (그림 6A)의 채용을 유도하는 것으로 나타났다. 증명에서 사용 된 특이 적 항체 칵테일에 기초하여 그것을 더욱 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포 및 NK1.1 + NK 세포를 특이 적 종양 생착 48 시간 (도 내에 GAL-1 결핍 종양 미세 환경을 입력 할 것을 표시 할 수있다 6B 및 6C); 멀리 NK 세포의 신경 교종 능가 함침 골수 세포의 총 수 있지만.
그림 1 : 두개 내 생착에 대한 GL26-CIT의 셀의 제조 (.) 대표 10 배 밝은 필드와 GL26-CIT의-NT (왼쪽 이미지)와 GL26-CIT의-gal1i (오른쪽 이미지) 문화에서 자란 세포의 표면 형광 현미경 사진. (B) GL26-CIT의-NT (왼쪽 차선)과 GL26-CIT의-gal1i (오른쪽 차선) 전체 세포 용 해물의 웨스턴 블롯. 감마 튜 불린은 (γ-욕조.) 부하 제어로 표시됩니다. 4 ℃에서 5 분 동안 550 XG (최대 RCF)에서 원심 분리 후 약 50 %의 합류 T75 조직 배양 플라스크 (C) GL26-CIT의 세포 펠렛. 세포 수 및 생존력을 평가하기 위해 트립 판 블루로 1 : (D) GL26-CIT의 셀 (흰 점)를 포함하는 혈구의 시야보기 1 희석. 세포는 재생 가능한 종양의 성장을 보장하기 위해 90 % 가능한>이어야한다. 1-5으로 표시된 사각형에서 세포 수의 평균 세포 수 추정의 정확도를 증가시키기 위해 취해 져야한다. 두개 내 impla 유엔 - 보충 DMEM에 3 × 104 세포 / μL에서 재현 탁 (E) GL26-CIT의 세포ntation. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. C57BL / 6J 마우스의 선조체 (A)에 필요한 수술기구 및 시약을 보여주는 외과 스위트 룸 레이아웃에 신경 교종 세포의 정위 생착. (B) 0.5 mm의 AP에서 적절한 바늘 배치와 정위 프레임에 밝혀 C57BL / 6J 마우스의보기를 닫습니다, 2.5 mm의 ML, 그리고 브레 그마에 -3.0 밀리미터의 DV 상대. 브레 그마의 위치와 종양 세포의 생착의 대상 사이트를 보여주는 마우스 두개골 (C) 느 러 미보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 마우스 Transcardial 관류 (A) 해부, 분쇄 및 마우스 뇌 조직의 효소 분해에 필요한 시약. (B) 단자 마우스 수술에 전념 층류 후드에 표시된 산소 및 헤파린 Tyrodes의 솔루션 transcardial 관류 마우스에 필요한 장비 및 시약의 레이아웃입니다. (C) 적절한 장비 및 transcardial 관류에 필요한 게재 위치를 보여주는 마음의 도식 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 신경 교종 함침의 분리PBMC를. 초기 단계 소성을 신경 교종 임플란트를 포함하는 마우스 뇌 조직의 해부 용 (A) 전략. 상단 패널이 떨어져 반대쪽 반구에서 동측 반구의 시상 양분을 보여줍니다. 바닥 패널 (자주색으로 표시) 종양 임플란트를 포함하는 표적 조직을 분리하는 데 필요한 두 가지 추가 코로나 컷을 보여준다. 효소 분해 후 (B) 단일 셀 뇌 조직 펠렛 (흰색 화살표), 70 ㎛의 나일론 메쉬를 통한 여과 및 원심 분리. (C) 전에 원심 제대로 붓고 밀도 원심 분리 배지 구배. 흰색 화살표는 두 밀도 원심 매체 층 사이에 형성되는 깨끗한 인터페이스를 나타낸다. (D) 37 % 밀도 원심 매체 층 흰색 화살표의 상단에 형성 지방층)과 PBMC 대역을 보여주는 밀도 원심 분리 후 원심 분리 배지 구배 (번째로 약술두 층 사이의 계면에서의 전자 점선 검은 선). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 유세포 게이팅 전략 식별하는 데 사용되는 신경 교종-침투 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포와 NK 세포 (A) 1 단계 :. 밀도 원심 분리 미디어 그라데이션의 PBMC 밴드에서 분리 된 총 immunolabeled 세포에에 문이있다 세포 파편을 제외 (FSC-이하 K 50 ~ 이하). 2 단계와 3 겹 차별 게이팅 셀룰러 집계를 필터링 할 수 있습니다. 단계 4 : CD45 게이트 교종 함침 면역 세포의 동정을 행 하였다. 이소 제어 회색 실루엣으로 도시된다. 5 단계 : CD45 + 세포 GR-1 및 CD11b를 기반으로 성층. 모두 GR-1과 CD에 대한 이소 제어 11b는 플롯에 오버레이와 골드 원으로 묶여 있습니다. 빨간색 원은 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포를 나타냅니다. 단계 5 ': GzmB 식에 기초하여 계층화 GR-1 + / 골수 세포는 CD11b +. 전제, 이러한 세포는 이소 제어 (회색 실루엣)을 통해 안티 GzmB 항체 레이블하지 않습니다. 6 단계 : GR-1 5 단계에서 검은 색 사각형으로 설명 낮은 세포 NK1.1 식을 기준으로 층화. 이소 제어 회색 실루엣으로 도시된다. 6 단계 'NK1.1 높은 세포 GzmB 식을 기준으로 층화. 이 세포들은 실제로 아이소 타입 컨트롤 (회색 실루엣) 위 반 GzmB 항체 레이블. NK 세포는 작은 림프 크기를 갖는 것을 SSC-A 시연 대 FSC-A 상 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포 (B) 백 게이트 큰 크기 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포에 비해."_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 두개 내 종양 성장의 3 일 이상 GL26-CIT의-gal1i 종양 미세 환경 대 GL26-CIT의-NT로 PBMC 침투의 비교 (A) 총 CD45 + 면역 세포.. (B) CD45 + / GR-1 + / 골수 세포는 CD11b +. (C)는 CD45 + /NK1.1 + NK 세포. GL26-CIT의-gal1i의 신경 교종에서 분리 된 PBMC의 데이터 포인트는 부드러운 선으로 연결되어, 그런데 GL26-CIT의-NT의 신경 교종에서 고립 된 사람들이 점선으로 연결되어있다. 세 마우스의 신경 교종 함침 PBMC를 각 시점에서 종양 유형별로 분석 하였다. GL26-CIT의-gal1i 곡선의 각 데이터 포인트와 관련된 숫자는 GL26-C1 내지 통해 특정 PBMC 유형의 배 유도를 나타냅니다T-NT 지정된 시간 후 종양 주입시 (HPI). 데이터는 평균 (SEM)의 ± 표준 오차 계산 면역 세포의 평균 개수를 나타낸다. 통계 분석은 분산의 2 방향 분석에 의해 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 초기 마우스 뇌 종양 미세 환경에 침투 한 한 PBMC의 분리 및 유세포 분석을위한 견고하고 재생 가능한 방법을 설명한다. 신경 교종 세포 현탁액 정위 마우스 뇌의 선조체에 접목 된 실험자에 의해 지정된 농도로 생성된다. 마우스는 다음 실험 디자인에 의해 지정된 소정의 시점에서 안락사 그들의 뇌를 수거하고, 형광 접합 된 일차 항체의 조합으로되어 immunolabeled 교종 함침 한 PBMC를 분리하기 위해 처리된다; immunolabeled 세포를 유동 세포 계측법에 의해 정량화된다. 여기에 제시된 시위 초기 시점에 초점을 맞추고 있지만, 신경 교종-침투 PBMC를 마우스 사망 분석까지 어느 시점 이후 종양 생착 최대로 평가 될 수있다. 다른 항체 조합의 임의 개수이자 난의 면역 세포를 검사하는 데 사용될 수있는 방법으로는 뛰어난 모듈T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 대 식세포를 ncluding. 프로토콜이 여성 C57BL / 6J 마우스 시대의 8~10주에서 사용하도록 최적화되어 있습니다. 이 연령대의 외부 마우스는 여기에 제시된 데이터를 대표하지 않습니다 상응하는 시점에서 세포 수로 이어질 수 순환 PBMC를,의 비율을 변경할 수 있습니다. (잭슨 연구소; 마우스 Phenome 데이터베이스 Jaxpheno6) 다른 종양 모델을 사용하거나 B6 배경 이외 생쥐 때문 사용된다면 균주들은 PBMC 프로파일이 다를 수있는 경우 특성화 실험은 또한 요구 될 수있다. 성별 및 환경 조건은 PBMC 주파수와 비율 간의 차이의 원인이 될 수 있습니다.
이 방법의 검출을 가능하게 네 세포 표면 항체의 조합을 사용하여 입증되었다 GR-1 + 골수 세포 및 NK1.1 + NK 세포, 세포 유형은 GA의 거부에 관여 + / CD11b를L-1 결핍 교종. 세포 GzmB 항체의 포함은 상기 NK 세포의 세포 독성 서브셋 전위의 검출을 가능하게한다. 대표 결과는 하나 때문에 shRNA를 매개 유전자 최저에 수준을 감소 GAL-1의 정상 수준을 명시 적 또는 동계 C57BL / 6J 마우스 초기 GL26-CIT의 신경 교종에 면역 세포의 침윤을 위해 제공됩니다. 데모 교종 함침 PBMC를 단리 및 재현성이 즉시 24 시간 후 종양 생착로서 정량화 될 수 있음을 보여줌으로써 기술의 감도와 재현성을 나타낸다. 이외에도 종양 침투 GR-1 높은 / CD11b를가 + 골수 세포의 인구를 드러내는에서, 데모도 GR-1 INT의 인구를 보여 정체성 현재 정의되지 않은 / CD11b를가 + 세포.; 추가적인 실험이 상기 세포 집단의 문자를 해독하는데 필요하다. 우리는 또한 우리가 CD45의 쉽게 구별 인구를 준수하지 않는 점에 유의
안티 GR-1 항체는 다형 각각 25 단핵 골수 세포에 특정 Ly6G과 Ly6C 세포 표면 단백질을 모두 인정한다. 안티 GR-1 antibod 사용이거 따라서이 두 세포 집단 사이의 차이를 배제. 우리의 실험실에서 예비 결과는 지금 여자-1 결핍 신경 교종의 미세 환경에 침투 초기 GR-1 + /는 CD11b + 세포의보다 정확한 설명을 밝혀하기 시작했다. (: 1A8 복제) 및 안티 Ly6C (클론 : AL-21) 항 Ly6G 통합 실험 방지 CCR2 항체와 함께 항체는 이제 GR-1 높은 / CD11b를가 + 세포는 초기 GAL-1 결핍 종양 미세 환경을 침투하는 것을 나타냅니다 추가 실험은이 결과를 확인하기 위해 필요하다하더라도, 높은 Ly6C / CCR2 높은 염증성 단핵구와 일치한다 (데이터는 미도시).
때문에 셀에 그 신경 교종-침투 PBMC를 분리 관련된 반복 원심 분리 및 재 부유 단계에서 발생할 수있는 손실, 그것은 세포 수 실제로 그대로 뇌에 존재하는 그 무엇 낮은 사실에 관찰 가능성이있다. 전자 사이 그러나 차이xperimental 기는 70분의 37 밀도 원심 미디어 인터페이스의 동등한 양을 추출하는 경우 유지되어야하고, 각 샘플의 전체 부피 유동 세포 계측기에 의해 분석되는 경우. 이 단계를 준수하지 않을 경우 샘플 사이의 불공정 한 비교에서 발생하고 공정한 분석을 배제합니다. 뇌 종양 미세 환경을 입력 한 PBMC의 정확한 수를 정량화 할 수없는이 프로토콜에 대한 제한 특정하지 않습니다. 이러한 면역 조직 세포 계수 전략 등의 다른 방법으로 인해 배경 염색의 자신의 수준에 차이가 발생할 수 stereological 수와 조직 절편 현미경에 해당하는 이미지 임계 값의 요구 사항을 기반으로 총 세포 수의 외삽, 잠재적으로 false로 선도에도 오류가 될 수 있습니다 -negative 또는 위양성 신호. 그럼에도 불구하고, 상이한 분석법 간의 시간 코스의 비교 분석은 유사한 형상 전체와 시간 의존 면역 유입 곡선을 표시한다.면역 조직 화학적 방법에 관한 추가적인 단점 계측법 포르말린 고정 뇌 조직 절편의 맥락에서 동등한 항원 에피토프에 결합하는 흐름에 대한 특정 항체의 유효성 없다는 것이다.
그 방법론에 익숙하지 않은 사람들을 위해 제한이 될 수도 있습니다 프로토콜의 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 하나의 이러한 단계는 손상없이 두개골로부터 뇌의 수확이다. 우리는 이전에 적절한 실험을 실행하는 방법을 여러 번 연습하는 것이 좋습니다. 결국 뇌 분쇄한다 때문에, 뇌의 표면층에 경미한 손상이 신경 교종 함침 된 PBMC의 정확한 정량을 대수롭지 쉽다. 미숙 한 연구자가 처음에 어려운 찾을 수있는 제 2 단계는 밀도 원심 분리 미디어 그라데이션 붓는입니다. 위에 37 % 밀도 원심 매체 2ml의 위에 놓인 동안 깨끗한 계면을 형성하는 experimentalists 능력70 %의 층을 분리 한 PBMC의 재현성에 매우 중요하다. 본 공정은 초기에 도전 증명할 수 있지만, 크게 PBMC를위한 풍부 극적 여기서 전체 뇌 조직이 cytometrically 흐름을 분석 할 경우에 시간의 기간이 달리 시료 분석에 필요한 감소한다. PBMC 엔리치 또한 이와 .fcs 파일 크기를 줄이고 드문 뇌 침투 면역 세포 집단을 해결하는 데 도움을 유동 세포 계측기에 의해 캡처 된 이벤트들의 총 수를 감소시킨다. 깨끗한 밀도 원심 인터페이스 우리는 매끄러운 동작 플런저와 P-1000 마이크로 피펫을 사용하여 37 % 밀도 원심 매체를 쏟아 추천을 확립 최상의 결과. 15 ML의 원심 분리기 튜브 약 20 ~ 30 ° 벤치 탑 위의 각도. 70 % 밀도 원심 매체 층의 표면 위 튜브 3-5 ml의 마킹의면에 마이크로 피펫의 선단을 나머지. extru 그것으로 37 % 밀도 원심 분리 매체의 명백한 외부 모멘텀을 최소화하기 위해 천천히 그래서 꾸준히 부어순서에 마이크로 피펫 팁에서 DES는 기본 70 % 밀도 원심 분리 미디어를 방해 방지 할 수 있습니다. 마지막으로, 뇌 조직 구조가 반드시 분리하는 과정에서 파괴된다는 사실은 신경 교종 PBMC를 함침하여 마우스를 추가 시점 유사한 조직 학적 데이터를 얻기 위해 요구 될 것임을 의미한다.
정상 쥐 뇌 종양으로 플라스미드 DNA의 주입을 통해 생성 된 새로운 신경 교종 모델 26-32 최근 개발되어왔다. 이러한 "내생"종양 모델은 정위 생체 외 암세포를 더욱 밀접 engrafting 교종의 임상 학적 특징을 모방으로 인한 잠재적 인 아티팩트를 회피. 본원에 기재된 방법이 더 임상 적 모델 시스템을 특성화 면역 침투 이벤트의 연구에 매우 적합하다. 신생아 마우스에서 면역 유입에 대한 연구는 또한 신생아 MOUS의 밀도 비록이 방법을 사용하여 수행 될 수있다즉 뇌는 뇌 조직의 분해를 통해 방지하기 위하여 효소 소화 공정의 최적화가 필요할 수 성인의 경우보다 작다. 기술의 추가 응용 프로그램은 실험 알레르기 성 뇌척수염 (EAE) 및 바이러스 감염에 대한 면역 반응으로 옆으로 악성 종양에서 염증성 뇌 질환의 다른 클래스에 대한 조사를 포함한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) MGC에 R01-NS074387, R01-NS057711 및 R21-NS091555 부여의 / 국립 연구소 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다; NIH / NINDS는 PRL에 R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 및 R21-NS084275을 부여; 레아의 행복한 마음에서 보조금, MGC 및 PRL에게 수여 미시간 종합 암 센터의 대학; 신경 외과, 의학 미시간 대학의 대학의 부; NIH 보조금 2UL1-TR000433 지원하는 임상에 대한 미시간 연구소 및 건강 연구,; NIH / NCI (국립 암 연구소) 부여 T32-CA009676에 의해 지원되는 미시간 대학 암 생물학 교육 보조금; NIH / NINDS 지원하는 임상과 기초 신경 과학 미시간 교육 대학은 T32-NS007222을 부여; 그리고 NIH / NIGMS (일반 의학 과학의 국립 연구소)에 의해 지원 미시간 의료 과학자 교육 프로그램의 대학은 T32-GM007863을 부여합니다. 저자박사 카린 Muraszko 및 신경 외과의 부서에서받은 교육 리더십과 지원에 감사 재; M. 달 그렌, D. Tomford,과 최상의 행정 지원에 대한 S. 나폴리탄에; 뛰어난 기술 지원 M. Dzaman에; 그리고 자이스 3D 스캐닝 전자 현미경의 구입을 향해 관대 한 지원을위한 필 F. 젠킨스에. 우리는 또한 뇌 단핵 세포의 분리를위한 밀도 원심 분리 미디어 매개 전략의 수정 된 버전이 그려진하는 하버드 의과 대학에서 Kuchroo 실험실을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
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