Protocol
1. הגדרה ראשונית
- הגדרת ריכוזי גז טמפרטורה
- באמצעות התוכנה, לחץ על הכרטיסייה "האורח" הממוקמת בפינה השמאלית העליונה של הממשק הגרפי. התחברות למערכת באמצעות שם משתמש וסיסמא מיועדים. ודא לכל משתמש יש שם משתמש וסיסמה משלהם.
- לחץ על מודול להתאים (איור 1). בתוך החלון החדש המציג את ההגדרות הנוכחיות, לחץ על ערך הנקודה להגדיר קיימת O 2 להלן "נקודת גדר" והזן את רמת ריכוז הנדרשת O 2 עבור מודול זה. זן 5% O 2 אם תאי גזע פלוריפוטנטיים יתבגרו או מניפולציות במודול זה, ו -9% O 2 אם תאי גזע עצביים יתבגרו או מניפולציות. לחץ על סימן הביקורת הירוק כדי לאשר את הנקודה להגדיר.
הערה: שני מודולים אינם גז מתכוונן: מכסה המנוע למינרית, ובית הנבחרים מיקרוסקופ. ריכוזי הגז בשכונת הזרימה למינרית הם whil אטמוספרידואר אלה בתא מיקרוסקופ נשמרים באופן פסיבי על ידי ריכוזי הגז בתא בתהליך. - חזור על שלב זה עבור CO 2. זן נקודת קבוצה של 5% CO 2 עבור כל המודולים למעט בתאי החיץ, אשר ניתנים להתאמה רק עבור O 2.
- צג את ריכוז הגז הקיים, אשר מתויגים "ערכי תהליך", כדי לוודא שהם מגיעים לנקודות הקבוצה החדשות.
- התאם את הנקודות להגדיר גז של כל המודולים לערכים המתאימים. התאם את רמות ה- CO 2 ו- O 2 של תאים כי יהיה חשוף זה לזה. לדוגמא, להתאים את קאמרית התהליך עד 5% O 2 לפני פתיחת באינקובטור שגדל תאים ב 5% O 2. כמו כן להסתגל 5% O 2 כל תא חיץ כי משמש להוספת פריטים לתא התהליך במהלך הזמן הזה.
- הגדר את הטמפרטורה של חדר התהליך עד 37 ° C באמצעות המסך הזהה עבור התאמות גז. כמו כן להגדיר את f הקאמרית התהליךטמפרטורת loor ל -37 מעלות צלזיוס.
- לחץ על גדות מודול הדגירה מתחת לכל חממה. כוונו את הטמפרטורה של הבנקים ל -37 מעלות צלזיוס.
- מבצע של הצפת צ'יימברס
- לאסוף את כל האספקה הנדרשת למשימה המסוימת (האכלה, פיצול, המכתים, וכו ') בתחילה למנוע עיכוב בזרימת העבודה. לרסס את כל החומרים בנדיבות עם אתנול 70% ולאפשר להם להתייבש בשכונה למינרית. אין לרסס צלוחיות או צלחות של תאים - לנגב אותם בעדינות עם ספוג גזה סטרילי רווי 70% אתנול.
- ודא שתי הדלתות החיצוניות והפנימיות של החדר חיץ סגורות היטב. לאחר מכן, פתח את הדלת מבחוץ, ומניח את הפריטים בפנים.
- סגור את הדלת החיצונית. בתוך התוכנה, לבחור את מודול החיץ, ולחץ על הכרטיסייה גורם לדילול. זן 1 לתוך תיבת גורם יומן. לחץ להתחיל.
הערה: "גורם לדילול" משמעו כי אווירת מודול החיץ יהיהלהתפנות והחליף פעם 1 עם גז נקי, מסונן-HEPA. - לאחר בממשק הגרפי הפסיק להבהב "גורם לדילול", פתח את הדלת הפנימית של תא החיץ ולהביא את החומרים בתוך חדר התהליך.
זהירות: אל תאפשרו הדלתות הפנימיות והחיצוניות אי פעם להיות פתוח בעת ובעונה אחת ואל תפתח את הדלת הפנימית אם תא חיץ שלא עבר גורם לדילול. - כדי להסיר פריטים מאולם התהליך, קודם להבטיח כי קאמרי החיץ עבר גורם לדילול. לאחר מכן פתח את הדלת הפנימית, למקם את הפריטים להסירו מבפנים, ולסגור את הדלת הפנימית. לאחר מכן פתח את הדלת החיצונית ופינוי הפריטים.
הערה: גורם לדילול אינו צריך להתנהל לפני פתיחת הדלת החיצונית.
2. היכרות עם האכלת תאים
- הגדרת חממה
- מניחים 3 צלחות פטרי במחבת מים בבסיס בכל חממה. מלאו הכלים האלה עם sterilמים ה. אין למלא את סיר המים ישירות. לשמור על רמת מים במנות אלה, כפי שהם קריטיים לשמירה על לחות יחסית נקודת להגדיר (RH) בחממות.
- בתוך הממשק הגרפי, לחץ על החממה. הקש על הערך הקיים עבור לחות יחסית (RH) תחת נקודה להגדיר וזן 85%. לחץ על סימן הביקורת הירוק כדי לקבל את הערך הזה.
- הכנת מתקן ייצור תאים עבור תאים
- אם לא עשה זאת, להתאים את תאי חיץ, לתא התהליך, באינקובטור לנקודות סט גז הדרוש הסוג של תא המונהג.
- נקו את פני השטח של תא תהליך עם גזה סטרילית חיטוי שאינם דליקים. אין להשתמש בכל חומר חיטוי peracetic מבוסס-חומצה, כמו מערכת סגורה החזק, אדי התמהמהות רעילים בתאי יונקים. במקום זאת, להשתמש במוצרים benzalkonium מבוססי כלור.
- המשך חיטוי. נקה את הכפפות ומשטחים כי הם commonly נגע, כגון ידיות דלתות. השתמש החיטוי ביסודיות אך במשורה, כמו נוזל עודף בתא התהליך יתרום לחות, עיבוי וצמיחה של חיידקים אפשריים.
- נקו את פני השטח של מכסה מנוע הזרימה למינרית ו החוצץ קאמרי עם אתנול 70%, ולאפשר לו להתייבש. מניחים את הבקבוק או צלחת של תאים (במקרה שלנו, PSCs או NSCs) בשכונה, בקצרה לנגב המשטח החיצוני שלה עם ספוג גזה סטרילי רווי אתנול.
- שים את הבקבוק או צלחת בתא החיץ, ולהפעיל גורם לדילול (שלב 1.2.3).
- עם השלמת גורם לדילול, לעבור מיד את הבקבוק או הצלחת אל האינקובטור המתאים. כמו החממות הן בחלק האחורי של חדר התהליך, לשלוף מדף לתא התהליך עבור מיקום תא. הימנע מפתיחת דלתות החממה שלא לצורך או לפרקי זמן, כמו האוויר של תהליך התא יבש מאוד בהשוואה לזו של החממות, תגרום משמעותיאובדן הלחות בחממה.
- האכלת תא תרבויות
- לאסוף רכיבים בינוניים, טפטפות סרולוגיות, גידול פיפטור אלקטרונית, גזה חיטוי. גם לאסוף מיכל פסולת עבור תרבית תאים בינוניים בילו, אבל לא למלא אותו עם אקונומיקה. תביא את החומרים לתוך תא התהליך דרך תא חיץ כמפורט בסעיף 1.2. כן בינוני תרבית תאים בתא בתהליך, כפי שתואר לעיל 9,10 (ראה גם לוח חומרים)
- מסדרי חומרים באופן שיאפשר מרחב עבודה אופטימלי. יש להימנע מהנחת פריטים שאינם בשימוש במרכז חדר התהליך.
- אפשר עבור המדיום לאזן עם רמות CO 2 ו- O 2 הנוכחיות בתוך המערכת על ידי השארת את מכל התקשורת הסיר את המכסה מעט. חלק מהיצרנים הבינוני PSC מצביעים לא לחמם תקשורת ב 37 ºC; אם זה המקרה, להשתמש בתא חיץ כדי לאזן את המדיום. אפשר ליdium כדי לאזן במשך 20 דקות.
- הסר את המדיום הישן מבאר בעזרת פיפטה stereological מתאימה וכן פיפטור אלקטרוני. לקבלת PSCs, להסיר את כל אלא סכום נותר קטן של המדיום הישן, מספיק כדי למנוע התייבשות במהלך תהליך ההאכלה. לקבלת NSCs, להסיר וחצי של המדיום הישן. Pipet הפסולת לתוך מיכל פסולת.
- מניח את פיפטה המשמש בחזרה לתוך באריזתו המקורית ולהעביר אותו לצד של חדר התהליך, או לתוך תא חיץ המיועד לפינוי פסול. עם טפטפת טרי סרולוגיות סטרילי, להוסיף בינוני טרי לתא צלחות תרבות במקום צלחות בחזרה לתוך החממה המיועדת שלהם.
- בסוף ההאכלה, לרסס גזה עם חיטוי וניקוי ידיות רצפת דלת של חדר התהליך יסודי. אם יש שורות תאים מרובים המגודלים במערכת, לעקר בין האכלה כל קו התא. זה עוזר להקטין את הסיכון של זיהום צולב.
- בסיום, להסיר פסולתאו פריטים לא נחוצים אחרים דרך אחד חדרי החיץ.
3. תא תרבויות פיצול
- אנזימתי Passaging של PSCs או NSCs
- לאסוף את כל הפריטים הדרושים passaging. זה כולל תקשורת, אנזים או חיץ ניתוק תא הלא אנזימטי (האחרון הוא עבור NSCs בלבד), DPBS, צלחות או צלוחיות, תאי מטריקס (ECM), צינורות חרוטים, ו טפטפות סרולוגיות. הביאו אותם לתוך המערכת באמצעות תא חיץ.
- צלחות טריות מעיילות או צלוחיות עם ECM, כפי שתוארו לעיל 9,10. ECMS חלק -such כמו אלה שמקורם שורות תאי העכבר סרקומה - הם נוזלים רק בין 4 ל 15 מעלות צלזיוס, כך להשתמש שקית קרח ג'ל או לחסום קרה מעוקרת כדי לשמור על קור ECM תוך כדי עבודה בתא התהליך המחומם.
- Pipet את המדיום בילה מן התרבות להיפטר ממנו את המכולה.
- יש לשטוף את המשטח היטב או בקבוק באמצעות 1 מ"ל של DPBS / היטב ולסלק את DPBS.
- להוסיף 1 - 2מיליליטר של אנזים חם זה טוב. רק מאוד תרבויות צפופות דורשות 2 מיליליטר.
- מייד להעביר את מנת התרבות או בקבוק לתא מיקרוסקופ, ולבחון את התרבות בזהירות. Watch עבור סימנים של תאים בודדים מתחילים לשחרר את המנה. אל תחכו עד שהתאים לצוף לתוך השעיה לפני שתמשיך לשלב הבא.
- מחזירים את התאים לתא התהליך העיקרי. בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, להוסיף 4 מ"ל של DPBS לכל 1 מ"ל של האנזים, ואז בכוח pipet למעלה ולמטה כדי לסלק את התאים מפני השטח היטב. אם passaging בארות רבות בתוך צלחת multiwall, מוסיפים את DPBS היטב כל לפני פירוק תאים מבארות הפרט.
- מעביר את אנזים השעית תא PBS על צינור חרוטים בגודל מתאים.
- אם בצנטריפוגה אינו זמין במתקן ייצור תאים, בחוזקה לאטום את צינור חרוטי, ומניחים אותו בתוך תא חיץ ולאטום את הדלת סגורה.
- הסר את צינור חרוטי מן bufתא fer מצד הזרימה למינרית ספין התאים ב 100 XG במשך 5 דקות ב RT.
- רסס את צינור החרוטים עם 70% אתנול, ולהביא אותו לתוך תא התהליך באמצעות תא חיץ גורם לדילול.
- Pipet את supernatant, ו resuspend התאים 2 מ"ל של PSC או בינוני המל"ל. אם passaging PSCs, הקפד לכלול מעכב ROCK במדיום בריכוז של 10 מיקרומטר, כפי שתואר לעיל 9,10.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer, ולקבוע את מספר הבארות או הצלחות נדרשו. PSCs פלייט ב 5 x 10 4 - 1 x 10 5 תאים / 2 ס"מ. פיצול NSCs ביחס של 1: יחס 2.
הערה: NSCs לעתים קרובות גוש ולהתנגד ספירה מדויקת ב hemocytometer. - אם cryopreservation של התאים נדרש, בצע את הפרוטוקול המתאים 9,10, אך עליך לוודא שכל האספקה ומדיה הקפאה ערוכות מראש והניחו בתוך חדר התהליך. DMSO הוא רעיל מאוד תאים ב 376; C, ולכן לעבוד מהר מאוד. שמור את המיכל הקפאת במקטורן isopropanol ב RT ברדס זרימה למינרית. לאחר צלוחיות cryopreservation מלאות וחתומים, להסיר לאלתר את הבקבוקונים מאולם התהליך על ידי העברת אותם באמצעות תא חיץ.
- Passaging ידני של PSCs
- ודא התרבות צריכה להיות passaged, כפי שתוארה לעיל 8. אם כן, להכין צלחות או צלוחיות טריות צופה תאי מטריקס. ואז לשנות את המדיום לחלוטין.
- נקה את תא מיקרוסקופ עם גזת סטרילית טבולה חיטוי חוסך סכום שאינו דליק - יותר מדי יגרום אדים עודפים בתא. רק לנקות את הכפפות, שטח רצפה, ועל הבמה. תביאו כמה 200 μl או 1,000 μl עטוף בנפרד טיפים pipet החדרה.
- תביא את הצלחת של PSCs לתוך תא מיקרוסקופ, להסיר את המכסה, ומניח אותו עם פנים כלפי מטה על הרצפה נוקתה לאחרונה. השאיר את המכסה חושף את dir התחתוןectly לזרמי אוויר, זיהום פוטנציאלי.
- לגולל טיפ pipet, ושימוש מיקרוסקופ כדי להמחיש את התרבות, להפריד בין מרכיביו מושבות שיש מורפולוגיה טובה באמצעות קצה pipet.
הערה: טיפ pipet ניתן מצורף pipet אם משתמש פרט מוצא נוח יותר זה. - החלף את המכסה על הצלחת, ולהעביר את הצלחת בחזרה אל תא התהליך.
- Pipet את ECM העודף מהצלחת החדשה, ולהעביר את התקשורת מהצלחת הישנה (המכילה חתיכות מושבת השעיה) לצלחת החדשה. אם הצלחת הישן עדיין מכיל מושבות כי אינם מוכנים להיות נטל, להאכיל אותו גם כן.
4. טכניקות תרבות Specialized
- התמרה של פיברובלסטים Sendai לתוך PSCs
- בתוך מתקן ייצור תאים, להרחיב פיברובלסטים עור אנושיים 1 במדיה פיברובלסטים המכילים DMEM / F12, 10% FBS, ו 20 ng / ml FGF2, בריבית של 5% O 2. השתמש dishe תרבות 6 היטבשעות מצופות 0.1% ג'לטין.
- הכן את התאים להיות transduced ידי מתנער מהם עם 1 מ"ל של טריפסין 0.25% בכל טוב. להשבית טריפסין עם המדיום פיברובלסטים 1 מ"ל. ספין ב 200 XG, resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום פיברובלסטים, ולספור אותם באמצעות hemocytometer.
- Resuspend 2.0 x 10 5 תאים במדיום פיברובלסטים 2 מ"ל, ומוסיפים את ההשעיה תא 1 גם צלחת גם 6 מצופה ג'לטין (2.1 x 10 4 תאים / 2 ס"מ). שים את התאים בחזרה בחממה.
- אפשר 24 שעות עבור התאים לצרף בתחתית הצלחת.
- מניחים בינוני פיברובלסטים טריים בתוך החדר תהליך (1 מ"ל של מדיום לכל טוב של תאים להיות transduced), ולאפשר לו לאזן את הגזים.
- לעקר גוש קר מראש מקורר עם 70% אתנול ו למקם אותו בתא חיץ. השתמש שקית קרח ג'ל עם חורים לשתי הידיים אם בלוק לקירור מסחרי אינו זמין.
הערה: ישנם 3 - 4 סנדאי נפרדוירוסים (בהתאם לגרסה של ערכת התמרה), אשר חייב להיות מופשרת במהירות, אך הותירה את הגוש הקר המופשר פעם. - טובל את החצי התחתון של הצינורות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות (לא להטביע את הצינורות), ומייד לנקות את לחיצוניות הצינור עם 70% אתנול. מניחים את הצינורות על הבלוק קר מעוקר בתא חיץ ולהפעיל גורם לדילול.
- עבודה במהירות, להוסיף את הנפח של כל וירוס תכנות מחדש סנדאי למדיום equilibrated 2. כרך זה נקבע על ידי שלושה משתנים - את מספר התאים, כייל של כל וירוס, ואת ריבוי הרצוי של זיהום לכל וירוס. התייעץ במדריך ערכת מומלץ משרד הפנים. הנוסחה היא:
[(מספר התאים להיות transfected) (ריבוי של זיהום) (1,000)] / (כייל הנגיף) = נדרש μl של וירוס - הסר את supernatant מן הבאר (ים) של תאים כדי לתכנת מחדש. עבור כל טוב, להוסיף 1 מ"ל של התרופהאממ המכיל וירוסים. נער בעדינות את הצלחת, נזהרת שלא לשפוך תקשורת, ומניח את הצלחת בחזרה בחממת 5% O 2.
- אחרי שעה 2 בעדינות לטלטל את הצלחת שוב וחזור שוב אחרי עוד 2 שעות.
- לאחר 24 שעות (יום 1 שלאחר התמרה), להאכיל את היטב עם 1 מ"ל של מדיום בתאי גזע פלוריפוטנטיים. חזור על יום 2, אבל לא להסיר בינוני מהבאר.
- בימים 3 ו -4, לשנות וחצי של המדיום.
- ביום 5 ומעבר, לשנות את המדיום כולו.
- כאשר מושבות להופיע, להכתים את התרבות באמצעות נוגדנים סטריליים כדי לאשר לפיה ההתנחלויות הן אכן פלוריפוטנטיים, כפי שתואר לעיל 2. כמו תאי האכלה, להבטיח שהתקשורת PSC המכיל נוגדנים כבר equilibrated לגזי במתקן ייצור תאים.
הערה: בתוך תכנות מחדש מוצלח, מושבות iPSC צריך להיות נוכח כשבועיים לאחר התמרה 1. - כאשר המושבות גדלו גדולותמספיק, השתמש במיקרוסקופ כדי לסמן מעבר מכנית אותם לצלחת ECM מצופה, כמפורט בסעיף 3.2.
- הרחב את המושבות באופן ידני או enzymatically, כפי שתואר לעיל 9,10.
5. לנקות אחרי שימוש יומי
- מניחים את כל חומרי פסולת, כולל בקבוק פסולת נוזלית, לתוך תא חיץ סטרילי. נגבו את פני השטח של תא עיבוד בכל התחומים אשר באים במגע ידי אספקה עם גזה סטרילי וחיטוי שאינם דליקים.
- הסר את כל חומרי הפסולת מוצקים מאולם החיץ וזורק את מכל הפסולת המתאים.
- מחק פסולת נוזלית במכל פסולת מתאים, או פשוט לערבב עם אקונומיקה ושופכים ירדו לטמיון. נקו את מיכל פסולת עם סבון ומברשת. לעקר את המיכל עם 70% אתנול ו תזיז אותו בחזרה לתא התהליך באמצעות תא חיץ.
הערה: לא מומלץ להשתמש אקונומיקהמיכל הפסולת בזמן שהוא בתוך המערכת, כמו אדי אקונומיקה עשוי recirculate ולפגוע בתרביות תאים. - משיקולים היגיינה, לנגב את משטח הפלסטיק הקדמי של חדר העיבוד של המערכת עם אתנול 70%. זה עוזר לנקות את שמנים זיעה על העור מפני המצח של המשתמש.
- אם העיבוי בנה בתוך חדר התהליך, להפעיל גורם לדילול כדי לנקות את ההתעבות. אפשר לפחות שעה 1 על זה כדי להשלים.
6. משימות ללא סדר יום
- לחדש את הכלים מים בחממות תרבית תאים עם מים סטריליים, מזוקקים במידת הצורך. המכסה את הכלים לפחות פעם בשבוע. עם זאת, שיעור האידוי ישתנה בהתאם לתדירויות שימוש דלתות החממה נפתחות, הנפח של נוזל בתרבויות, ואת הגדרות החממה.
- פעם בחודש, לכייל מחדש את הגדרות O 2 ו- CO 2 בכל החדרים. זה מחייב שימוש SPAN (כיול) גז, אשר המשךains ידוע רמות ריכוזיות O 2 ו- CO 2 כסטנדרט הפניה. ודא שיש אספקת גז SPAN נאותה לפני תחילת הכיול. המערכת משתמשת בחיישני גז ספציפיים, הממוקמים בכל מודול, כדי לזהות ריכוזי גז; לפיכך, השימוש של גזים באיכות גבוהה SPAN מבטיח כי החיישנים להניב מהימן ריכוזי גז מדויק.
- החלף את הכפפות בתא התהליך הקאמרי מיקרוסקופ על בסיס קבוע. החלף את הכפפות כל 2 חודשים, ללא קשר לתדירות השימוש במערכת הוא מנוצל. לפני ההתקנה, לעקר את הכפפות החדשות עם חומר חיטוי. הפעל גורמים לדילול על חדר התהליך לאחר הכפפות הוחלפו.
הערה: כאשר נמתח על האזיקים של המערכת, כפפות ניטריל יש נטייה לפתח חורים באזורים חשופים ללחץ וחום פיזי. זוהי תופעה רגילה בלאי בלתי נמנעים. - שנה את מסנני מזרק בכל התאים כל 6 חודשים.
- החלף או לשטוף tהוא prefilter על מכסה המנוע זרימה למינרית ברגע שהוא מתחיל להופיע מלוכלך.
- עיין במסמכי היצרן בקביעות לקבלת מידע על החלפת חלקים עיקריים.
7. ניקוי של המערכת
- במקרה של אירוע זיהום עיקרי המשפיע על רוב בתרביות תאים, להזיז שום בתרביות תאים ששרדו מתוך המערכת, או (אם אפשר) באינקובטור מעושה.
- כבה את שליטת הגז לכל תאי פרט לכך חממות מעושה.
- הסר את הלוח הקדמי הגמיש של המנגנון, ולהסיר את מדפי נירוסטה מן חממת תרבית תאים הפגועה. כמו כן מוציאים את התבנית במים.
- חיטוי מדפי החממה והפאן מים, ולשים אותם בחזרה לתוך החממה. נגב את גרעינו של חממה עם 70% אתנול. אפשר אתנול להתאדות, ולסגור את דלת החממה.
- נגבו את פני השטח של תא התהליך מיקרוסקופ עם 70% ethanol. החזר את הלוח הקדמי של המכשיר.
- נגב את גרעינו של המנגנון, כולל זה של החממה הפגועה, עם חומר חיטוי שאינו דליק. השאר את הדלת הפתוחה החממה הפגועה, ולהפעיל גורם לדילול על חדר התהליך. ודא דלתות מיקרוסקופ החדר גם פתוחות.
- עבור ניקוי שיגרתי של חממות תרבית תאים, להבטיח כי החממה הקאמרית תהליך היא באותו גדרות אטמוספרי. פתח את דלת החממה, ומניח כל כלי תרבית תאים על פני השטח של חדר התהליך.
- נגב את המדפים חממו ומשטחי פנים עם חיטוי שאינו דליק. אפשר חיטוי להתאדות, ולהעביר את בתרביות תאים בחזרה אל האינקובטור. עבודה מהר ככל האפשר, כדי למנוע dessication של תרביות תאים.
Representative Results
כתב יד זה מתאר בפירוט מתקן ייצור תאים, ואת ההיבטים הייחודיים של תאי culturing בתוך מערכת סגורה. חלק הארי של מתקן ייצור תאים כולל מנגנון תרבות מחוייט, סגור, תא שבו יש טביעת רגל קטנה והוא יכול להיות מאוחסן בקלות בתוך 6 x 7.5 מ '2 חדרים (איור 2). באותו זמן לא הוא התאים בתוך המנגנון חשוף אנשי מעבדה או סביבה. המנגנון מורכב של מספר מודולים: תא תהליך, במנדף זרימה למינרית, 2 תאי airlock חציצה בין מכסה המנוע ואת תא התהליך, שתי חממות תרבית תאים, וחדר מיקרוסקופ סמוך לתא התהליך (איור 3). המערכת נשלטת על ידי תוכנה המאפשרת משתנים סביבתיים להיות מבוקר תחת פיקוח (איור 1). המחשב פועל תוכנה זו היא על-פסק. גזים מוזנים לתוך המערכת דואר על ידי קבוצה של סעפות עבור חמצן, חנקן ופחמן דו חמצני (איור 4). גזים עבור ההתקן מסופקים על ידי מערכות סעפת שיש שתי קבוצות של טנקים כל - סט פעיל ומערכת מילואים. כאשר הערכה הפעילה מופנה כלפי מטה, הסעפת עוברת אוטומטית המילואים להגדיר וצוות הטנקים החלופיים. הכוח נמצא על מערכת גנרטור גיבוי.
פלוריפוטנטיים ותאי גזע עצביים ניתן לגדל בתנאי חוסר חמצן במתקן זה באמצעות הפרוטוקולים שפותחו בעבר 9, עם סיבוכים הוסיף אינהרנטי ציוד הרומן. תאי גזע פלוריפוטנטיים ניתן לגזור באמצעות וירוס סנדאי, באמצעות נוגדנים ספציפיים pluripotency לזהות מושבות טרנספקציה מלאה, אשר מבודדות אז והרחיבו. (איור 5 א 'וב'), מ iPSCs אלה, תאים ונוירונים גזע עצביים ניתן לגזור באמצעות עיכוב הסמאד כפול, ואת הפנוטיפ שלהם אומת usi ng נוגדנים המל"ל ספציפיים (איור 5 ג ו-ד).
איור 1. ממשק גרפי את הייצור במתקן הנייד. (א) הייצוג הגרפי של ע.מ. הוא למסך ברירת המחדל ותואם את ציור CAD שמוצג באיור 3. לחיצה על העכבר מעל 1 מודול החוצץ (2F באיור 1) נפתח מסך שליטתה (B) שבו O 2 ערכים מוגדרים כדי להתאים את תא עיבוד (3 באיור 3). באופן דומה, לחיצה על התהליך קאמרי או חממת 1 מעלה מסכי הבקרה שלהם (C ו- D, בהתאמה), שבה ערכים עשויים להשתנות או פיקוח על פי צורך. r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מתקן ייצור תאים. (א) המערכת כפי שניתן לראות מנקודת מבט ימני קדמי. הערה את חיבורי החשמל והגז בתקרה והעגלה עם אביזרים מיקרוסקופ והמחשב ימינה. (ב) מכסה המנוע זרימה למינרית עם דלתות גישה מודולים חיץ לראות בצד ימין. (C) תא התהליך עם שתי חממות (דלתות שחורות) לראות בחלק האחורי. (ד) מבט דרך הצד הימני של המערכת מראה את המיקרוסקופ ולנטר עם הדלתות לתאי החיץ נראים מרחוק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. CAD שרטוט של מתקן ייצור תאים. כל הפריטים הזנת המכשיר נמחקים למטה הראשון עם אלכוהול ואוויר מיובש למכסה המנוע זרימה למינרית (1). פריטים מכן יועברו אל האווירה המתאימה במודול החיץ מול (2F) בטרם עבר לתוך מודול UCPC, או תהליך קאמרי (3). הם תאים בתרבית בתוך שתי החממות (4, 5). מכתים תא חי, מושבת קטיף, הערכת מורפולוגיה תאית כללית וניתוח הגירה מתרחשת במודול UPC, או לשכת מיקרוסקופ (6). לבסוף, פסולת יוצאת המערכת באמצעות מודול החיץ האחורי (2R). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. < / P>
מקורות איור 4. גזי הכח. (א) סעפת 2 CO היא התקנה 4 x 4 כפי שהיא מספקת את כל החממות של המעבדה. (ב) סעפת O 2 היא התקנת 2 x 2 ואספקה למתקן ייצור תאים בלבד. חנקן למערכת נוצרת מאדה (C, ממש מתחת שלט היציאה) מחוברת סעפת חנקן נוזלי (ימינה) כי גם ממלא באופן אוטומטי cryofreezers (למטה משמאל). הסעפת היא התקנה 2 x 2 להיות מסופקת על ידי שני זוגות של טנקי חנקן נוזל 160 L. CO 2, O 2, ו- N 2 מסופקים מהתקרה דרך shutoffs (D). ואקום בית מסופק גם במיקום זה. נראה ממש מאחורי shutoffs גז אספקה הם זוג כבלי חשמל המספקים חשמל למערכת.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. תאים פלוריפוטנטיים גזע שמקורם ב היפוקסיה בווירוס סנדאי. (א) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (המינוח נמצא סטובר et al. 9), לעומת שלב 10X. (ב) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs חי מוכתם AF-594 שכותרתו Tra-1-60, 1: 100 דילול בתקשורת. כל iPSCs היו transduced במתקן הייצור תא 5% O 2 עם וירוס סנדאי. (ג) בניגוד שלב של SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 NSCs iPSC נגזר, גדל ב 5% O 2 ב שקופיות קאמריות. התאים היו קבועים אז paraformaldehyde 4% ו מוכתם נוגדן ראשוני אנטי אנושי Nestin, ואלכס-488 נוגדנים משני. כל הברים בקנה המידה נמצאים 1001;. מ ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
תאים שגודלו בתוך ע.מ. רואים שום שינויים בריכוזים דו חמצן או פחמן, כאשר הם עוברים מן החממה כדי עיבוד בתא עד מיקרוסקופ חדר ובחזרה. זה קריטי, כי תנאים בתא אחד מותאמים בחממה המסוימת שבה התאים נשמרים לפני התאים יוסרו מן החממה. האווירה בתוך המנגנון היא ברציפות HEPA-מסוננת ניתן להתאמה אישית בכל נוגע ריכוזי דו תחמוצת חמצן ופחמן. תאים ניתן לגדל בריכוזי תקן PSCs או NSCs, 5% ו -9%, בהתאמה; או ניתן לבחור ריכוזים חלופיים תאים מסוגים שונים או עבור ניסויים ספציפיים. לפיכך, המנגנון מסופק עם מקורות מתמידים של חמצן כיתה רפואית, פחמן דו חמצני, חנקן (איור 4). כל שלושה גזים אלה מסופקים על ידי מערכות סעפת ספציפית-גז המבטיחות אספקה מתמדת. המנגנון מסופק גם עם תערובת גז כיול מורכבת10% (± 0.01%) פחמן דו חמצני לחמצן. מערכות סעפת שוכנות מחוץ למתקן ייצור תאים והגזים נשמעים ברקע לתוך המתקן דרך התקרה. גז הכיול שוכן בתוך המתקן. המנגנון מסופק גם עם ואקום הבית, גם דרך התקרה. באמצעות מערכת ניטור אלקטרונית ואלחוטי יחידות שליחה, לחצי הפלט של כל הסעפות מנוטרים באופן קבוע. במקרה שכל לחץ נופל מחוץ לטווח, מפעילי מתקן ייצור תאים הם טלפנו באופן אוטומטי הודעה כזו פעולה מתאימה ניתן לקחת.
דרישות הכח של המנגנון שלו ממומנות על ידי שישה 120 ייעודי V מעגלים יורדים מהתקרה ומחוברות מחוללי הגיבוי של בית החולים על מנת להבטיח אספקה קבועה. מבצע של המנגנון נשלט באמצעות תוכנה במחשב PC המבוסס מופעל באמצעות אספקת חשמל פסק. הסדרי כוח ומחשב אלהלהבטיח כי פונקציות המערכת ברציפות גם במקרה של כשל במערכת חשמל ציבורי. תוכנת השליטה במנגנון בעלת ממשק גרפי ידידותי למשתמש (איור 1) אשר מאפשר השליטה הריכוזית דו תחמוצת חמצן והפחם וכן טמפרטורה, לחות, ולחצים קאמריים. הערכים של כל הפרמטרים הללו נרשמים באופן רציף על מנת ליצור רשום מצטבר של כל פרמטרי המנגנון. נתונים אלה מגובים על גבי שרת מרוחק מדי לילה כדי להגן על שלמותם. המחשב והתוכנות ניתן לגשת מרחוק על ידי משתמשים מנהליים להעריך ו / או לשנות כל פרמטר. בנוסף, המחשב ותוכנות ניתן לגשת מרחוק, המאפשרים הערכה אינטראקטיבית של פרמטרי מנגנון ופתרון בעיות עם משתמשים מקומיים. יחידת שליחת אזעקה נוספת מחובר למנגנון כזה מפעילי מתקן ייצור תאים מקבלים הודעה על כל out-of-טווח במצב של המנגנון. ג הגישה מרחוקapabilities לאפשר להתחבר והעריך את הפרטים של המצב מחוץ לטווח.
המנגנון נועד כמערכת מודולרית הן מאקרו ותחושה מיקרו. מודולים תרבית תאים בודדים, כגון חממות ותאי עיבוד, יכול להיות מותאם אישית בכל הנוגע לממדים ודרישתם וכן בפריסה שלהם ביחס לזה. בנוסף, מרבית הפונקציות השליטות על מודולים הבודדים הם עצמם כאלה מודולרי בוקר גז האטמוספרי פרט, למשל, עשויים להיות מוחלפים בקלות ללא הפרעה משמעותית למערכת.
תאי עיבוד מיוחדים, כגון אחד עבור להדמיה מיקרוסקופית ומניפולציה של תרביות תאים, ניתנים להתאמה בקלות למערכת. שני השלב בניגוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הם בתוך המערכת (איור 6), כך תאים יכולים להיות מוכתם חי, ומושבות יכולות להיות גזורות באותם תנאים אטמוספריים כמו בתוך tהוא אינקובטורים. ניתוב של כבלים דרך grommets חתום הקירות הצדדיים של חדר העיבוד מאפשר ציוד כגון ספקי כוח ומחשבים להישמר מחוץ המנגנון, בדרך כלל על עגלה (איור 6).
לתאי העיבוד במתקן ייצור תאים יש דפוס זרימת אוויר שונה מאשר BSCs הקונבנציונלי. בשנת BSCs הקונבנציונלי, זרימת אוויר זורם במורד מתוך פורקן פליטה מרכזי מתפצלת לשני זרמים נפרדים, אשר נלקחים מכן על ידי שני פתחי צריכה שונים בחלק קדימה ומאחור של הרצפה של הארון. לעומת זאת, ע.מ. יש פורקן יחיד בחלק הקדמי של התקרה. האוויר זורם כלפי מטה לכיוון החלק האחורי של החדר, שם הוא נמשך מכן כלפי מעלה לתוך פורקן צריך. למרות ע.מ. הוא מטבעו מאוד נקי, דפוס זרימת אוויר ייחודי זה אומר טכנאים צריכים להתאים את הטכניקה שלהם מעט כדי להפחית את הסיכון לזיהום. כמו עם BSC מקובלת, עובד במעבדהhould להימנע מלהציב את ידיהם נגד זרם של צלחות תרבית תאים פתוחות ובקבוקי תקשורת. עם זאת, כיוון שהוא הזרם השתנה ב ע.מ.
המעבדה מתקן ייצור התאים עצמו הוא סטנדרטי למדי ו מגיע מאובזר עם מקפיא -20 ° C, -80 ° C במקפיא, מקרר 4 ° C., בצנטריפוגה, ואמבט מים. המעבדה גם יש כיור עם דוושות מבצע דיבורית נוח. על מנת במעבדה הזאת להפוך למתקן ייצור תאים קליני תפקודי, אולם מספר שינויים נוספים עדיין חייבות להתבצע. ראשית, המנגנון עצמו יש לשדרג כדי לקבל את היכולת לפקח על תרכובות אורגניות נדיפות, חלקיקים, וריכוזים של דו תחמוצת כלור המשמש טיהור. שנית, תא עיבוד המכיל מכונה FACS ניתן שוכן ומחובר שאר המנגנון באמצעות מודול חיץ. זה יאפשר מיון תא וטיהור trאוכלוסיות תאי ansplantable בתנאים הסביבתיים המתאימים. לבסוף, המנגנון כולו צריך להיות שוכן בתוך חדר נקי חומה רכה. זה מספק ארגון התקינה הבינלאומי הסביבה (ISO) בכיתה 8 למנגנון 5.
על סטריליות הגבוהה וטבע מבוקרת מחשב של ע.מ. עושים את זה מערכת אידיאלית עבור יישומים עתידיים עם טיפול מבוסס תאים ותהליכי ייצור נאותים. הסיכון של זיהום היא מיתנה מאוד, אבל יותר חשוב, את התנאים של הרחבת התא נרשמות באופן אוטומטי לארכיון על ידי מערכת המחשב. סטיות בריכוזי גז, טמפרטורה, לחות, וכל אירועי גישה למערכת מתועדות בקפדנות. זה יכול לעזור מאוד כאשר חוקר בעיות איכות המוצר. עם זאת, ישנם עדיין מגבלות. השימוש של כל וכל ריאגנטים ואספקה (למשל, רכיבי תקשורת, טפטפות, צלחות) חייב להיות מתועד בנפרד. לְהוֹסִיףitionally, יש שפע של בעיות פוטנציאליות (כולל צורות רבות של טעות אנושה) שיכול להתעורר אשר אינם קשורים זה לזה לחלוטין כדי המשתנים מתועד על ידי מערכת הניטור של CPF. לפיכך, את הצורך צוות מקצועי מהשורה הראשונה ותיעוד מדריך מפורט של משימות נשאר במקום.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לצוות Biospherix על עזרתם ללמוד להשתמש במערכת תרבית תאים סגורים Xvivo, במיוחד מאט פרימן; צוות של חברת בניית Miles & קלי, Inc עבור עבודתם בהקמת תשתית המעבדה, במיוחד ראס יוז; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת אורנג 'קאונטי של מתקנים ושירותים תמיכה עבור עבודתם בתיאום לשפץ מעבדה, במיוחד אדם Lukhard ודווין Hugie; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת Orange County של מערכות מידע על עזרתם בהקמת התשתית לניהול נתונים וגישה מרחוק, במיוחד וייט טראן; בית החולים של צוות הניהול הבכיר של מחוז אורנג 'של ילדים לתמיכה ארוכת השנים שלהם של הפרויקט, במיוחד ד"ר מריה Minon וברנט Dethlefs. עבודה זו מומנה על ידי בית החולים לילדים של מחוז אורנג 'המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואהדואר דרך TR3-05476 מענק PHS. כל המחברים תרמו באופן שווה על עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Xvivo System | Biospherix | custom made | |
| Xvivo Software | Biospherix | version i.o.2.1.2.1 | |
| O2 Manifold | Amico | P-M2H-C3-S-U-OXY | |
| CO2 Manifold | Amico | M2H-C3-D-U-CO2 | |
| N2 Manifold | Western Innovator | CTM75-7-2-2-BM | |
| Microscope with DP21 camera and fluorescence | Olympus Corporation | CKX41 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 Glutamax | Life Technologies | 10565-018 | |
| StemPro hESC Supplement | Life Technologies | A100006-01 | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Phosphate-Buffered Sodium | Hyclone | 9236 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 | R&D Systems | AFL233 | |
| Dimethyl sulfoxide | Protide | PP1130 | |
| Hank's-based Cell dissociation Buffer | Life Technologies | 13150-016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | AFL236 | |
| Oct-3/4 Antibody | Millipore | AB3209 | |
| TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4260 | |
| SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| BIT-9500 Serum Supplement | Stemcell Technologies | 9500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable Supplies | |||
| 2 ml Serological pipet | VWR | 89130-894 | |
| 5 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-102 | |
| 10 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-104 | |
| 25 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-106 | |
| 50 ml Serological pipet | Olympus Plastics | 12-107 | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| 12-well plate | Corning | 353043 | |
| T25 flask | TPP | 90026 | |
| T-75 flask | TPP | 90076 | |
| 20 µl pipet tips | Eppendorf | 22491130 | |
| 200 µl pipet tips | Eppendorf | 22491148 | |
| 1,000 pipet tips | Eppendorf | 22491156 | |
| Cryovials | Thermo Scientific | 5000.102 | |
| 70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
| Sanimaster 4 | Ecolab | 65332960 | |
| Bleach | Clorox | A714239 |
References
- Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
- Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
- Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
- Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
- Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
- Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
- Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).
