Abstract
Övervakning leddjur rörelse krävs ofta för att bättre förstå tillhörande populationsdynamik, spridningsmönster, värdväxtpreferenser och andra ekologiska samspel. Leddjur vanligtvis spåras i naturen genom att märka dem med en unik märke och sedan åter samla in dem över tid och rum för att bestämma deras spridningsförmåga. Förutom faktiska fysiska taggar, såsom färgade damm eller färg, har olika typer av proteiner visat sig vara mycket effektiv för märkning leddjur för ekologisk forskning. Proteiner kan administreras internt och / eller externt. Proteinerna kan sedan detekteras på recaptured leddjur med en proteinspecifik enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Här beskriver vi protokoll för externt och internt märkning leddjur med protein. Två enkla experimentella exempel demonstreras: (1) ett inre proteinmärke presenterad för en insekt genom att tillhandahålla en proteinberikade diet och (2) en yttre proteinmärke topiskt enpplied till en insekt med hjälp av en medicinsk nebulisator. Vi relaterar sedan en steg-för-steg guide för smörgås och indirekta ELISA metoder som används för att detektera protein märken på insekterna. I denna demonstration, är olika aspekter av förvärv och detektion av proteinmarkörer på leddjur för märke-release-återfångst, mark-capture, och själv pålägg fånga typer av forskning diskuteras, tillsammans med de olika sätt som immunomarking förfarandet har varit anpassas till ett brett utbud av forskningsmålen.
Introduction
Förflyttningar av leddjur skadedjur, naturliga fiender (parasitoider och rovdjur), och pollinatörer i naturen är en förutsättning för att bättre förstå hur man kan förbättra ekosystemtjänster. Nyckelkomponenten för de flesta typer av spridnings forskning är att ha en tillförlitlig metod för att märka leddjur (er) av intresse. En mängd olika material (t.ex. färger, färgämnen, färgade damm, taggar, sällsynta element, proteiner) har använts för att markera leddjur att bedöma deras populationsdynamik, spridningsfunktioner, utfodring beteenden och andra ekologiska interaktioner 1,2.
Lämpligheten i en markör som används för en viss spridning forskning kommer att vara beroende av vilken typ av studie genomförs. Det finns tre breda kategoriseringar för märkning leddjur: (1) märke-release-recapture (MRR), (2) mark-capture, och (3) själv mark-capture. För mark-frisättnings återta forskning, markerar utredaren vanligtvis leddjur kollektivt i laboratory och släpper dem på en central plats i fältet. De leddjur sedan återerövras vid olika rumsliga och tidsintervaller med olika strömavtagare (t.ex. svep netto, vakuum, klibbig fälla) 3,4,5. De återerövrades exemplar undersöks sedan för den specifika märket skilja frisläppta från infödda individer. För mark-capture forskning, utredaren gäller vanligtvis märket direkt på fältet med hjälp sprututrustning (t.ex. ryggsäck spruta, bom och munstycke spruta). De bästa markörer för mark-capture forskning är billigt och lätt appliceras på leddjur livsmiljö. För själv mark-capture forskning, utredaren gäller vanligtvis märken till ett leddjur bete 6,7 eller häckar entré 8. I sin tur, markerar leddjur själva internt genom att sluka det markerade bete eller externt med "borsta" upp mot märket som den lämnar boet.
Såsom nämnts ovan, har många typer av markörer varit ossed att märka en mängd olika leddjursarter. Men mycket få är användbara för alla tre av dessa spridningsforskningskategorier. Utvecklingen av proteinet immunomarking förfarandet var ett stort genombrott för märkning insekter. Immunomarking sätter en proteinetikett på leddjur antingen internt eller externt, som i sin tur detekteras av en anti-proteinspecifik enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). Den första proteinmarkörer som användes var kaninimmunoglobulin (IgG) och kyckling IgG / IgY 9,10. De har visat sig vara mycket effektiva poäng för MRR och själv mark-capture forskning (se diskussion). Tyvärr, IgG / IgY-proteiner är dyra och är därför inte praktiskt för mark-capture forskning och de flesta typer av själv mark-capture forskning. Därefter har andra generationens protein upptäckt ELISA utvecklad för proteiner i kyckling äggvitor (albumin), komjölk (kasein) och sojamjölk (trypsininhibitor protein). Varje analys är mycket känslig, specifik, och, mestviktigare, använder proteiner som är mycket billigare än de IgG / IgY-proteiner 11. Dessa proteiner har visat sig vara effektiva för MRR, markera-capture, och själv mark-capture forskning (se diskussion).
I den här artikeln, vi beskriver och demonstrerar hur man genomför protein markera laboratorie behålla studier. Sådana studier är den första fasen av forskning som krävs för alla typer av fält spridning studien. Närmare bestämt är det viktigt att utredarna vet hur länge märket kommer att behållas på de riktade leddjursarter innan inleder fältspridningsstudier. Här beskriver vi och visa hur man internt och externt markera insekter för MRR, pålägg capture, och själv pålägg Program fältstudier. Vi visar sedan hur man upptäcker närvaron av varumärken med indirekta och sandwich-ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Intern Mark, Retention, och Detection ordningen
- Intern märkning procedur
- Samla insekter av intresse (n ≈ 100 personer) från ett laboratorium koloni uppfödda på en konstgjord diet eller från fältet och dela i två rena uppfödnings behållare.
- Placera en vanlig 20 ml kost paket (omärkt negativ kontrollbehandling) i en av behållarna. Komplettera en andra 20 ml artificiell diet paket med 1,0 ml av en 1,0 mg / ml kyckling IgG / IgY-lösning, blanda väl och placera den i annan behållare.
Obs: Om insekten av intresse inte har en konstgjord diet, kan märket placeras på eller i vilken diet de normalt upprätt på (t.ex. gröna bönor, moth ägg, vatten, socker, honung). - Låt insekter att återuppta sin näring under 24 timmar.
- Intern märke retentionstid förfarande
- Ta bort dietpaketen från varje behållare och leverera insekterna wed en annan näringskälla för att upprätthålla dem under hela experimentet (t.ex. gröna bönor).
- Samla en kohort (n = 20) av insekter dagligen (eller vid någon önskad tidsintervall) från varje behandling och frysa omedelbart vid -20 ° C.
- Sandwich ELISA-procedur
- Tillsätt 50 ul av kanin-anti-kyckling IgY primär antikropp utspädd 1: 500 i Tris-buffrad saltlösning (TBS) till varje brunn i en ren ELISA-mikroplatta och inkubera i minst 1 timme vid RT (notera: mikroplattorna kan även inkuberas O / N vid 4 ° C).
- Kassera antikropp från plattan och blockera varje brunn med 300 ul av en 1,0% icke-fet torrmjölk lösning för 30 minuter.
- I väntan på de tidigare inkubationssteg, placera frysta insekter individuellt i 1,6 ml mikrocentrifugrör med 1,0 ml TBS.
- Grind varje insekt med en ren mortelstöt tills ordentligt homogeniserades och tillsätt 100 | il av varje prov till en individuell brunn av ELISAtallrik. Låt proven inkubera vid RT i 1 h.
- Tillsätt 100 pl av negativ (endast TBS) och positiva (äggvita i TBS) kontroller till brunnar i den första kolumnen i varje ELISA-platta. Dessutom, tillsätt 100 l av negativa insekts kontroller (omärkta insekter) till 8 brunnar i den sista kolumnen i varje platta (Figur 1). Låt kontrollproven inkubera vid RT i 1 h. Observera att mallen i figur 1 är den mall som vi använder för våra standardiserade analyser. Placeringen av proverna i brunnarna är upp till de enskilda forskaren.
- Tvätta varje brunn tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) -tween och sedan lägga 50 | il av kanin-anti-kyckling-IgG / IgY konjugerat med pepparrotsperoxidas späddes 1: 10000 i 1% mjölklösning och inkubera under 1 h vid RT.
- Tvätta varje brunn tre gånger med PBS-Tween och tillsätt 50 | il av tetrametylbensidin (TMB) till varje brunn.
- Efter 10 minuter, läsa brunnarnamed en mikroplatt spektrofotometer inställd på en våglängd av 650 nm.
Figur 1. En schematisk bild som visar de standardiserade och beteckningar som används för en typisk 96 brunnar ELISA mikro. Varje platta innehåller 7 brunnar tillägnad Tris koksaltlösning negativa kontroller (TBS), en väl tillägnad en positiv proteinkontroll (Pos Ctrl), 80 individuella brunnar tillägnad återerövras insekter (prov 1 ... 80) och 8 brunnar tillägnad omärkta (negativa) insekts kontroller (Neg Ctrl 1 ... 8). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Extern Mark, Retention, och Detection ordningen
- Yttre märkning förfarande
- Samla insekter av intresse (n ≈ 100individer) från en laboratoriekoloni eller från fältet och placera i två 1,0 L plastbehållare med en håldiameter 2,5 cm stansas ut från den sida av varje behållare.
- Spraya insekter i den första behållaren med 1,0 ml dH 2 O (negativ kontrollbehandling) med användning av en medicinsk nebulisator. Spraya insekter i den andra behållaren med 1,0 ml av en 5,0% lösning av kyckling äggvitor med användning av en medicinsk nebulisator.
- Fäst slangen av nebulisatorn till en standardlaboratorieluftutlopp och sedan infoga mynningen av nebulisatorn i 2,5 cm hål på behållaren. Slå sedan på luftutloppet gradvis tills nebulisatorn producerar en ånga.
- Fortsätt sprutning (märkning) tills lösning äggvita har matats ut (ca. 2-5 min).
- Avlägsna nebulisatorn och placera en kork i hålet i plastbehållare. Låt insekterna stå vid rumstemperatur till dess att lösningen har torkat helt.
- Extern märke retentionstid förfarande
- Placera varje behandling av torra insekter i en separat ren uppfödning behållare för att undvika ytterligare exponering till märket.
- Lägg till mat och vatten till rena behållare för att upprätthålla insekter under hela studien.
- Samla en kohort (n = 20) av insekter från varje behandlings dagligen och frysa omedelbart vid -20 ° C.
- Indirekt ELISA-procedur
- Placera frysta insekter individuellt i 1,6 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 1,0 ml TBS.
- Blötlägg prover för en timme på en orbital skakapparat vid 120 rpm.
- Lägg till negativa och positiva kontroller som beskrivs i steg 1.3.5.
- Efter blötläggning, pipett en 100 ul alikvot från varje prov i ett av de 80 utsedda provbrunnarna på en ny 96 brunnars ELISA-platta såsom visas i fig 1 Låt proverna inkuberas under 1 h vid RT (notera:. Mikroplattorna kan också vara inkuberades O / N vid 4 ° C).
- Tvätta brunnarna tre gånger medPBS-Tween och sedan lägga 300 pl fosfatbuffrad saltlösning innehållande 1% bovint serumalbumin (PBS-BSA) till varje brunn.
- Efter 30 min vid RT tvätta två gånger med PBS-Tween.
- Tillsätt 50 ul av kanin-anti-äggalbumin primär antikropp utspädd 1: 8000 i PBS-BSA-Silwet (0,05%) till varje brunn och inkubera under 1 h vid RT.
- Tvätta varje brunn tre gånger med PBS-Tween och sedan lägga 50 ul av get-anti-kanin-IgG konjugerat med pepparrotsperoxidas späddes 1: 2000 i PBS-BSA-Silwet (0,05%) för en timme vid RT.
- Tvätta varje brunn tre gånger med PBS-Tween och tillsätt 50 | il TMB-substrat till varje brunn.
- Efter 10 minuter, läsa brunnarna med en mikroplatta spektrofotometer inställd på en våglängd av 650 nm.
3. Data Analysis
- Beräkna Medelabsorbansvärdet av de 8 negativa kontroll insekter på varje ELISA-plattan och sedan beräkna standardavvikelsen baserad på de poolade negativa kontroller tillbakam alla ELISA-plattorna i en given studie 12.
- Lägg sex gånger den poolade standardavvikelsen och medelvärdet som erhållits för varje ELISA-platta för att erhålla en ELISA positivt tröskelvärde. Alla insekt prov ger ett absorbansvärde som är lika med eller högre än detta värde bedöms vara positivt för närvaron av proteinet varumärket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intern Märkning:
Resultaten av den interna återhållningsmärket test visas i figur 2A. Den beräknade ELISA kritiska tröskelvärdet var 0,054. Övergripande (alla fyra datumen kombinerat), insekterna behandlas utan protein gav genomgående låga ELISA-värden (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omvänt alla insekterna matade proteinet berikad kost gav gående starka ELISA-värden (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).
Yttre märkning:
Resultaten av den externa retentionen märket test visas i figur 2B. Den beräknade ELISA kritiska tröskelvärdet var 0.082. Sammantaget insekterna lokalt märkta med endast vatten gav genomgående låga ELISA-värden (x = 0,048 ± 0,007, n = 80). Omvänt alla insekterna topiskt märkta med lösning äggvitorna gav gående starka ELISA-värden (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).
Figur 2. Medelvärde (± SD) ELISA optiska densitetsvärden av (a) insekter märkta internt med kyckling IgY och (B) insekter märkta utvändigt med kyckling äggvita (albumin). Svarta fält är medelvärde ± SD ELISA optiska densitetsvärden som genereras av omärkta insekter. Insekt urvalsstorlek för varje daglig protein behandling var 20 personer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den leddjur protein immunomarking förfarande beskrevs först nästan ett kvarts sekel sedan 9. Sedan dess har det förfarande som anpassats för att studera spridningsmönster ett brett utbud av leddjur som använder både internt och externt administrerade IgG / IgYs. Dessa proteiner har visat orubbliga markörer för de många olika insektsarter som testades hittills. Emellertid, såsom nämnts ovan, är den huvudsakliga begränsningen för användning av IgG / IgYs att de är mycket dyra. Följaktligen IgG / IgYs är bara användbar för MRR och själv märkning typ studier där stora partier av insekter kan märkas i ett litet utrymme eller märken kan införlivas i en diet eller bete. Här, vi en enkel demonstration av hur en internpåslaget kan administreras genom att mata målinsekten en konstgjord diet berikad med kyckling IgG / IgY. I sin tur, var IgG / IgY detekteras med användning av en sandwich-ELISA. Detta system kan vara särskilt fördelaktigt för forskare som redan använder enkost som innehåller hönsägg eftersom analysen kommer naturligtvis detektera IgG / IgY finns i ägg. Dessutom kan små mängder av IgG / IgY-protein administreras topiskt till insekter med hjälp av medicinsk nebulisator beskrivits ovan (figur 3A). En nebulisator användes först till massmärke mycket ömtåliga och små parasiter med kanin-IgG för MRR typ forskning 3. Sedan dess har andra metoder använts för att administrera IgG / IgY märken leddjur för spridning forskning. Till exempel har en parfym atomizer använts för att applicera IgG / IgY märken på andra parasitoid arter 13,14. Andra har internt märkt olika insekter genom att mata dem (dvs själv märkning) kanin-IgG märkt honung 14,15 eller socker vatten 16 (figur 3B). Slutligen, Baker et al. 7 matas kartong för att termiter som impregnerats med kanin-IgG (figur 3C). Dessa termiter lätt själv markerats som de intas agnade matfoder.
Figur 3. Olika metoder används för att administrera en proteinmärke: (A) delikat parasitoider markeras med kyckling IgY med hjälp av en medicinsk nebulisator, (B) en parasitoid livnär sig på kanin-IgG-berikade honung lösning, (C) termiter livnär sig på en kanin-IgG-berikade kartong bete, (D) honungsbin själv märkning med torrmjölk när de går igenom en damning anordning placerad vid ingången till en bikupa, (E) inhemska insekter markeras med mjölk i en bomullsfält med hjälp av en konventionell traktor sprutrigg, (F ) inhemska insekter markeras med kyckling äggvitorna med en bom och munstycke sprayanordning monterad på en ATV, (G) inhemska insekter i en remsa av alfalfa markeras med kyckling äggvitorna med en backpack sprutanordningen, och (H, I) inhemska insekter i alfalfa markeras med kyckling äggvita med hjälp av flygbilder applikatorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
IgG / IgY proteiner har inte bara använts för att studera insekter spridning. De har också använts för att spåra trofiska länkar i leddjur livsmedelskedjan. Hagler och Durand 17 först föreslog begreppet märkning byte med IgG / IgY och i sin tur, att genomföra en IgG / IgY-specifik sandwich tarminnehåll ELISA på rovdjur som konsumerade den markerade byte. Denna teknik har nyligen vunnit popularitet bland forskare gut analys eftersom det är mindre tidsödande och kostsamt än att genomföra byten specifik ELISA eller polymerase chain reaction (PCR) typ tarminnehåll analyser molekyl (se Hagler 18 och et al. Fournier 19 omdömen om the och nackdelar med de olika tarmanalystekniker). Inom de senaste tio åren, har bytet immunomarking tekniken använts för att identifiera näring av bomull rovdjur på kanin IgG-märkta skadedjur 18,20,21, trophallaxis och utfodring relationer i termit kolonier med hjälp av en kanin-IgG-behandlat papper näringskälla 22 granivory av ett leddjur assemblage mot invaderande maskros ogräsfrön märkta med kanin-IgG 23, stinker bugg predation priser på IgG-märkta tomat hornworms som samlats in i tomter utsatts för olika semiokemikalie behandlingar 24, och rovdjur sophantering aktivitet på IgG / IgY-märkt kadaver 25.
En andra generation av protein upptäckt indirekta ELISA utvecklades nästan ett decennium sedan. Dessa ELISA utformades särskilt för att upptäcka proteiner i "off-the-shelf" livsmedelsprodukter, såsom äggalbumin protein i kyckling äggvitor, soja trypsinhämmare protein i sojamjölk, och kasein proteini komjölk. De andra generationens protein immunomarkers har visat sig vara användbara för MRR, pålägg avskiljning och själv märke typ forskning. Till exempel, al. Irvin et 26 visade att det var möjligt att lokalt markera känsliga parasitoider med dessa off-the-shelf proteiner. Dessutom, et al. Hagler 8,27 visade att honungsbin kan själv märket med äggvita och bovint mjölk torra pulver när de kommer ut genom ett protein dispenser placerad vid ingången till en bikupa (Figur 3D). Kanske den mest kreativa användningen av proteinet märkning involverat inriktning ko klappar med äggvita med hjälp av en stråle spruta 28. I sin tur förvärvade ansikte flyga vuxna själv varumärke som de dök upp från sin puppstadium och lämnat kon pat.
Den viktigaste egenskapen hos andra generationens protein immunomarkers är att de är lätt tillgängliga i stora mängder och till en bråkdel av kostnaden för IgG / IgY-proteiner 11. Denna funktion har revolutionized området sätt omfattande pålägg Program forskning bedrivs. Specifikt utredare har nu en tillförlitlig metod för att snabbt och enhetligt tag leddjur över stora områden inom hjälp av ett brett utbud av konventionell sprutrigg utrustning (figur 3E). Exempelvis har skadeinsekter märkts direkt i fruktträdgårdar och fält med hjälp av bärbara handen pistol typ sprutor 29,30, traktordrivna Airblast sprutor 31,32, och halk sprutor 33. Horton et al. 34 användes en elektrisk sprutanordning monterad på en all-terrain fordon att sätta fingret på tillämpningar av äggvita till insekter upptar täckgrödor inbäddade i en pearfruktträdgård (Figur 3F). På samma sätt, et al. Swezey 5,35 använde en ryggsäck spruta att tillämpa exakt användning av kyckling äggvita till rader av en alfalfa fälla gröda (en föredragen värdväxt) inbäddad i ett ekologiskt odlade jordgubbar fält för att markera en pest och dess naturliga fiender (
Vissa användare av andra generationens mark-capture förfarandet har ändrat det ursprungliga förfarandet något att uppfylla deras specifika forskningsbehov. Kroppen typ och storlek av than målinsekt, tillsammans med sina beteendemässiga egenskaper, kommer att diktera volym och koncentration av varumärket behövs och hur varumärket administreras 37. Dessutom kommer den metod som används för att återta insekter i området vara beroende av dessa faktorer. Hittills har nästan varje metod som används (t.ex. klisterfällor, svep nät, dammsugare) för att samla insekter har använts framgångsrikt för att samla markerade insekter 3,5,8,11,29,31,32,35,38. Men på grund av de extrema känsligheten hos proteindetektions ELISA, vi understryka att stor försiktighet måste vidtas för att säkerställa att omärkta prover inte kontamineras under insamlings eller sorteringsprocesser 38.
Den ursprungliga studien 11 det som beskrivits den andra generationen av proteinmärkning system (dvs., äggalbumin, mjölk kasein och soja trypsininhibitor) rapporterade faktorer som påverkar analysens känslighet kan variera bland de typer av markör. Specifikt visade de att difka vattenkällor, tillsatser (ytaktiva ämnen), och även vilken typ av ELISA-platta som används påverkas (antingen positivt eller negativt) analysen. Dessutom, denna undersökning och efterföljande studier 37,39,40 visade att tre proteinmärke detektionsanalyser varierar i effektivitet. Äggvitan markör bibehölls längre än den mjölkmarkör, som bibehölls längre än sojamjölk markör. Resultaten understryker vikten av att testa protein behålla märket på en viss insekt före igångsättning av fältarbete. Även dessa andra generationens indirekta ELISA visar ibland en låg nivå av bakgrundsbrus med vissa typer av insekter (t.ex. växtätare) (pers. OBS). Denna bakgrundsbrus kan minskas genom att tillsätta 100 pl av väteperoxid till varje brunn i ELISA-plattan i 30 minuter mellan steg 2.3.4 och steg 2.3.5 i protokollet ovan (opubl. Data).
Det bör noteras att de indirekta ELISA används för att detektera den andra generationens proteinmärkenär mycket effektiva vid detektering av proteinet på insekter indränkt i provbufferten. De indirekta ELISA är inte lika effektiv som sandwich-ELISA på att upptäcka interna protein märken eller bytes proteiner på insekter. Studier har visat att de indirekta ELISA är inte lika effektiv som sandwich ELISA på att upptäcka protein i homogeniserade insekts prover 34,41.
En viktig faktor att beakta med någon ELISA är att förfarandet visar ofta platta till platta (förklaras främst av dag-till-dag effekterna av att köra en analys) variabilitet 42,43. Därför är det viktigt att varje ELISA-plattan inkluderar: (1) en eller flera TBS bara negativa kontroller (2) en eller flera TBS + rena protein positiva kontroller, och (3) åtminstone åtta negativa insekts kontroller (dvs. individer kända inte att innehålla ett proteinmärke). Endast TBS, TBS + protein, och insekts negativa kontroller säkerställa att bufferten inte är en felkälla är reagenserna fungerar, ennd att det inte finns några proteiner i insekt som korsreagerar med ELISA reagenser, respektive. Dessutom är de insekts negativa kontroller är nödvändiga för beräkning av ELISA tröskelvärden (se nedan). Plattan designen som visas i denna demonstration ingår 7 TBS ämnen, ett protein + TBS positiv kontroll (i den första kolumnen) och åtta negativa kontroller (i den sista kolumnen) på varje ELISA-platta (Figur 1).
En annan viktig faktor att beakta vid hantering ELISA-data är att bestämma ett tröskelvärde för att göra mål en insekt med avseende på närvaro eller frånvaro av en proteinmärke. Metoden ursprungligen föreslogs av Stimmann 44 för att ha dödat rubidium-märkta insekter definierades som den genomsnittliga nivån av markör i en pool av omärkta insekter plus tre gånger standardavvikelsen för omärkta individer. Denna metod har också använts som den konventionella metoden för att ha dödat insekter för närvaron av proteinmärken 9,17. Men i vissa cases, har forskare intuitivt valt mer konservativa tröskelvärden för att minska risken för att få falska positiva. Det enklaste sättet är att bara lägga fyra till sex standardavvikelser med medelvärdet av de negativa kontrollerna i stället för tre 18,34. En mer sofistikerad metod för att ytterligare minska risken för att få falska positiva föreslogs av Sivakoff et al. 12. Denna metod innefattar att beräkna medelvärdet absorbansvärde av de åtta negativa kontroll insekter på varje ELISA-platta och därefter beräkna standardavvikelsen baserad på de poolade negativa kontroller från samtliga ELISA-plattorna i en given studie.
Sammanfattningsvis är en tillförlitlig metod för att märka artropoder kritisk för framgången för de flesta spridningsstudier. Olika metoder har använts för att markera leddjur med protein under de senaste två decennierna. Protein immunomarking och detektion av varumärkena är relativt enkla och billiga och mycket anpassningsbar till en myriad av studies. Framtida användare av immunomarking teknik bör se till att deras metod är lämplig för detaljerna i sin forskning. Koncentrationen och volym av varumärket behövs och hur varumärket används kommer att bero på faktorer som beteende, kropp typ och storlek av målarten 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omnämnandet av firmanamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte någon rekommendation från US Department of Agriculture. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Acknowledgments
Finansieringen kom från USDA CRIS 5347-22620-021-00D och delvis av jordbruks- och livsmedels Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant no. 2011-67009-30141 från USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi är tacksamma för tekniskt stöd från Johanna Nassif. Vi tackar också Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, och Frances Sivakoff för att ge några av de bilder som används i figur 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
- Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
- Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
- Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
- Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
- Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
- Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
- Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
- Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
- Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
- Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
- Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
- Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
- Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
- Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
- Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
- Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
- Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
- Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
- Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
- Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
- Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
- Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
- Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
- Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
- Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).
