Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.
Introduction
Preimpianto sviluppo embrionale può essere diviso in più fasi distinte, dalla fase unicellulare alla morula e blastocisti. Molte prove suggeriscono che la polarità e spunti di posizione hanno un ruolo nella determinazione presto il destino della cellula nella trophectoderm (TE) e la massa cellulare interna (ICM). Tuttavia, la natura dei segnali, come sono trasdotti in segnali cellulari e contesti fisiologici in cui tali segnali sono in grado di avviare differenziazione linea cellulare non sono noti. Queste cellule differenziate poi subiscono la specializzazione, cominciando ad assumere strutture caratteristiche e le funzioni necessarie per la corretta formazione dell'embrione e la crescita della placenta 1-3.
embrioni pre-impianto sono particolarmente suscettibili di manipolazione da parte di iniezione diretta del materiale genetico modificato come siRNA o cDNA bersaglio e, quindi, possono essere utilizzati per studiare specifiche molecole bersaglio. Vi è una crescente comprensione che geneticaanalisi degli embrioni dei vertebrati è fondamentale per far progredire la nostra comprensione dello sviluppo embrionale 4. introduzione precisa di un gene wild-type o una forma mutante in un embrione in un contesto tempestivo per realizzare GAIN- o la perdita di funzione del gene ha notevolmente facilitato lo studio dei geni evolutivamente regolamentati. In perdita e guadagno-di-funzione tramite microiniezione di materiale genetico in singoli embrioni non-mammiferi e mammiferi primi è relativamente semplice a causa delle loro grandi dimensioni e di grande ricettività 5. Microiniezione viene in genere eseguita utilizzando vettori non virali. Vantaggio particolare è stata presa la facilità di utilizzo di vettori non virali su vettori virali e transgeni. Una rapida in perdita o il guadagno-di-funzione sistema di espressione in embrioni di topo è stato sviluppato che ci permette di sezionare e capire le funzioni del gene in embriologia vertebrati 6,7.
etichettatura fluorescente di embrioni faciliterebbe notevolmente la selezione di MICRoinjected o geneticamente manipolati embrioni e allo stesso tempo garantire un mezzo per quantificare indirettamente il livello di espressione di microiniezione siRNA o cDNA basato su intensità di fluorescenza 8. Per fare questo l'etichettatura, cDNA proteina fluorescente, GFP o RFP, sono co-iniettata sia come costrutti di fusione o separatamente. L'intensità di fluorescenza di GFP o RFP rivela il grado di espressione di siRNA o il DNA estraneo a garantire che in perdita o guadagno-di-funzione è stato compiuto.
Qui, vi presentiamo un protocollo micromanipolazione per la tecnica funzioni in perdita e il guadagno-of che ci ha permesso di identificare neogenin come un recettore che trasmette segnali extracellulari importanti nella differenziazione delle cellule presto embrioni preimpianto mouse.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure per l'allevamento degli animali e le cure sono state condotte secondo le norme IACUC di Sahmyook University, Seoul, Corea del Sud.
1. Superovulazione, Allevamento e isolamento Ovidotto
- Mantenere inbred 6 topi C57BL / nelle seguenti condizioni: 22 ± 3 ° C, ~ 60% di umidità, 12 ore di luce / buio ciclo, e acqua e cibo ad libitum.
- Indurre superovulazione di 3-5 settimane di età topi di sesso femminile con un'iniezione intraperitoneale di 5 UI incinta siero di cavalla gonadotropina (PMSG) a 0,1 ml / testa seguita 48 ore dopo da un'iniezione intraperitoneale di 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) a 0,1 ml /capo.
- Immediatamente dopo l'iniezione di hCG, amico femmine superovulazione indotta con i maschi sessualmente maturi dello stesso ceppo mantenendoli nella stessa gabbia durante la notte.
- La mattina successiva, confermare accoppiamento successo dalla presenza di una spina di accoppiamento o la spina vaginale sul tratto genitale femminile.
- Sacrificio incinta topi di sesso femminileda CO 2 intossicazione seguita da cervicale dislocazione 18-20 ore dopo l'iniezione di hCG.
- Aprire la cavità addominale tagliando la pelle e poi lo strato peritoneale con forbici sottili.
- Raccogliete le corna uterine con una pinza sottile e tirare via l'utero, ovidotto, ovaio, e cuscinetto adiposo delicatamente dalla cavità del corpo.
- Tagliare l'area tra il ovidotto e dell'ovaio con le forbici sottili. Riposizionare la pinza e tagliare l'utero prossimità nell'ovidotto, lasciando almeno 1 cm dalla parte superiore dell'utero allegata.
- Trasferire l'ampolla tubarico di 35 mm piastra di Petri contenente medio M16 a temperatura ambiente. Si riuniscono gli ovidotti di diversi topi nello stesso piatto.
- Porre le capsule allo stereomicroscopio per il recupero degli embrioni.
2. Recupero e la cultura di 2 pronuclei (2-PN) Embrioni
- Tagliare la fine di un 30 o 32 G ago ipodermico, macinare in una punta smussata, e usarlo come un ago di lavaggio.
- Usopinza sottile di scivolare alla fine del ovidotto l'ago di lavaggio. Premere delicatamente la punta dell'ago di lavaggio contro il fondo del piatto per tenerlo in posizione. Lavare il ovidotto con ~ 0,1 ml di terreno M16 per liberare gli embrioni 2-PN in una capsula di Petri.
- Recuperare gli embrioni 2-PN con circostante masse cumuliformi dal mezzo M16 lavata con lo stereomicroscopio utilizzando una pipetta di vetro sterile e trasferirli in un nuovo piatto di Petri.
- Dissociare cellule del cumulo da embrioni 2-PN mediante digestione enzimatica con 1,0 ml di 0,1-0,5% ialuronidasi in tampone fosfato salino di Dulbecco (DPBS) a 37 ° C per 5-10 min.
- Spogliare embrioni pipettando delicatamente con una pipetta di vetro e la rimozione fisica delle cellule del cumulo.
- Lavare gli embrioni denudate tre volte con 30-50 ml di fresco tampone fosfato salino (PBS) per embrione.
- Incubare gli embrioni in 35 mm di plastica Petri nei media M16 integrato con 10 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA, Fraction V) a 37 ° C in 5% CO 2 in un incubatore umidificato finché non viene effettuata la microiniezione, che è di solito meno di 4 ore più tardi.
3. embrioni trascrizione inversa (RT) e Reazione a catena della polimerasi (PCR)
- Raccogliere almeno 10 embrioni da ogni fase fino alla fase di blastocisti e piscina in 4,0 ml di 5x trascrittasi inversa soluzione pre-miscela contenente trascrittasi inversa, inibitori della RNasi, oligo dT primer 6mers casuali, miscela dNTP, e il tampone di reazione in un provetta PCR.
- Aggiungere privo di RNasi H 2 O distillata O ad un volume totale di 20 microlitri e sonicare gli embrioni aggregati per 30 sec a 200 W. Iniziare la reazione RT immediatamente a 42 ° C per 1 ora seguito da 5 minuti di incubazione a 95 ° C.
- Per ogni 5,0 ml di soluzione di cDNA generato, condurre normale amplificazione PCR con primer per neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, o β-actina (sequenze di primer riportati nella tabella 1. PCR consiste di 40 cicli di incubazione 15 sec a 95 ° C, 30 sec a temperatura di ricottura (indicata nella Tabella 1), e 30 sec a 72 ° C.
- I prodotti di PCR separate mediante elettroforesi su gel di agarosio 2% e visualizzare il gel sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio.
- Normalizzare l'espressione del gene bersaglio contro i livelli di beta-actina.
4. Immunocitochimica di embrioni
- Fix embrioni di ogni fase con 4% paraformaldeide in PBS per 30 min a temperatura ambiente seguita da una breve lavaggio 3 volte con PBS contenente 0,01% BSA.
- membrane cellulari permeabilize incubando 10 embrioni in 1,0 ml di PBS contenente 0,1% di Tween 20 e 0,1% TritonX-100 a temperatura ambiente per 10 min.
- Per bloccare vincolante incubare gli embrioni permeabilizzate in 1,0 ml di PBS aspecifica supplementato con 10% siero di capra normale per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare la embrioni bloccato ingegnoh di coniglio anti-neogenin anticorpi a diluizione 1: 100 in PBS contenente 0,1% BSA notte a 4 ° C.
- Dopo tre lavaggi per 30 sec ciascuno in gocce di PBS, incubare embrioni sia con Alexa 488 coniugato IgG di capra anti-coniglio o Alexa 568 coniugato capra anti-IgG di coniglio a diluizione 1: 500 in soluzione PBS / BSA notte a 4 ° C .
- Per visualizzare filamenti di actina, incubare gli embrioni in 1 ug / ml falloidina in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Stain nuclei aggiungendo 5 ml di PBS contenente 1 mg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) per 5 min a temperatura ambiente.
- Lavare embrioni tre volte brevemente con PBS.
- Trasferire gli embrioni di un vetrino e coprire con una goccia di olio minerale.
- Prendere immagini a 1,000X ingrandimento con un microscopio confocale ad eccitazione della lunghezza d'onda appropriata.
5. Preparazione di Neogenin-RFP e Neogenin-siRNA GFP Plasmidi
- Subclone cDNA codificante neogenin del mouse in una proteina fluorescente rossa (RFP) -contenenti vettore, con conseguente neogenin-bandiera-RFP.
- Sottoclone piccoli RNA tornante mira neogenin in una proteina fluorescente verde smeraldo (EmGFP) -contenenti vettore, con conseguente pcDNA-EmGFP-miR-neogenin (figura 1).
- Amplificare sia neogenin-bandiera-RFP e plasmidi pcDNA-EmGFP-miR-neogenin e purificare con i metodi convenzionali.
- Regolare le concentrazioni finali di plasmidi a ~ 1,0 mg / ml in tampone sterile Tris-EDTA (TE).
6. microiniezione di plasmidi in 2-PN embrioni
- Lavare le spoglie 2-PN embrioni una volta, brevemente, con i media M16 freschi.
- Centrifugare embrioni 2-PN per 10 min a 1000 xg in una centrifuga da tavolo per consentire l'osservazione della pronuclei.
- Incubare gli embrioni in un micro goccia di 20-30 ml di M16 mezzi per embrione in olio minerale a 37 ° C in 5% CO 2 per un additionale 1-2 ore.
- Fabbricazione pipette di iniezione e pipette in possesso tirando tubi di vetro al borosilicato capillare (OD = 1,2 mm, ID = 0.94 mm) con un estrattore meccanico.
- Realizzare pipette di iniezione di avere punte smussate e levigate aperture di <lunghezza della punta di 500 micron e diametro interno 1-2 micron punta usando un Micromacinatore e un microforger.
- Realizzare tiene pipette tale che essi hanno punte smussate e aperture lucidati con un diametro interno di 20 micron e un diametro esterno di 100 micron.
- pipette di iniezione di carico con una quantità sufficiente (> 200 nl) di soluzione plasmide a 1.0 mg / mL.
- Microinject ~ 10 pl di soluzione di plasmide per ogni embrione 2-PN in uno dei pronuclei utilizzando una microinjector collegato a un micromanipolatore motorizzato; durante questo processo, mantenere gli embrioni in posizione applicando pressione negativa con una pipetta tenuta.
- Dopo microiniezione, lavare gli embrioni 2-PN 3 volte con i media M16 fresca per less di 1 min ogni volta.
- Culture embrioni 2-PN in una goccia di supporti M16 fresche su un piatto di coltura di plastica ricoperto di una goccia di olio minerale per prevenire l'evaporazione media.
- Osservare gli embrioni a 24 intervalli hr sotto un contrasto interferenziale differenziale (DIC) microscopio invertito a 200X ingrandimento.
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Representative Results
Abbiamo scoperto che neogenin è transitoriamente espresso durante le prime fasi di sviluppo di embrioni di topo preimpianto, che appare già nel allo stadio di 2 cellule e duratura fino agli inizi del morula, ma diventare carente al fine morula e blastocisti fasi (Figura 2A). Inoltre, la distribuzione spaziale dei neogenin era limitata principalmente a celle esterne. I risultati delle analisi RT-PCR sono stati coerenti con la natura precoce e transitoria di espressione neogenin, con un picco nella fase 4 celle ma completamente privo allo stadio di 16 cellule o versione successiva (Figura 2B). Per contro, F-actina non ha rivelato un tale modello di espressione transiente e polarizzata.
Abbiamo poi studiato se i livelli neogenin potrebbero essere manipolati dal microiniezione di entrambi i vettori neogenin cDNA (guadagno neogenin) o vettori ospitano shRNA mira neogenin (neogenin loss) nel zigote 2-PN. Per differenziare visivamente guadagno neogenin dalla perdita neogenin, RFP e GFP sono stati co-espressi come indicatori (Figura 3), e la risultante neogenin livello di espressione è stata confermata sia mediante immunofluorescenza e mediante immunoblotting (Figura 4).
La Figura 5 mostra immagini rappresentative di embrioni in ogni fase, dopo aver ricevuto sia neogenin shRNA o neogenin cDNA nella fase 2-PN. Non ci sono state differenze morfologiche lordi apparenti tra perdita neogenin ed embrioni di guadagno neogenin, e nessuna differenza potenziale di sviluppo almeno fino allo stadio di blastocisti (Tabella 2). Infatti, sia il numero di embrioni sopravvissuti ad ogni stadio e il numero di embrioni arrestati non erano significativamente differenti.
Tuttavia, lo sviluppo ICM è stato meno pronunciato in perdita neogenin di neogenin embrioni guadagno comeevidenziato da una più alta espressione di ICM-specifici Oct3 / 4 in embrioni di guadagno neogenin (figura 6A) e da un numero maggiore di cellule ICM Oct3 / 4-positivi per blastocisti in guadagno neogenin di embrioni perdita neogenin (figura 6b). Inoltre, l'analisi RT-PCR ha rivelato una forte correlazione tra il livello di espressione di tre fattori di trascrizione e quella di neogenin. In blastocisti perdita neogenin, poco Oct3 / 4, Sox2, e Nanog sono stati rilevati, che è in netto contrasto con un aumento significativo l'espressione di tutti e tre i fattori di trascrizione in guadagno neogenin su embrioni di controllo (Figura 6C). Inaspettatamente, i livelli di espressione di Cdx2 e Tead4, fattori di trascrizione implicati nella differenziazione TE / manutenzione 6,7, sono stati meno influenzati dal livello di espressione di neogenin, convalidando che up-regolazione di neogenin porta all'attivazione di regolatori trascrizionali specifici per ICM, ma non per l'istituzione TE. Tutti i dati riportati sono m odified da riferimento 9.
Figura 1: La struttura della pcDNA-EmGFP-miR-neogenin. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Espressione di Neogenin Durante embrionali di topo per lo sviluppo (A) immagini microscopiche confocale di espressione neogenin in embrioni preimpianto a diversi stadi di sviluppo. (B) La trascrizione polymerase chain reaction inverso neogenin mRNA in embrioni preimpianto a diversi stadi di sviluppo. β-actina è stato utilizzato come controllo interno.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Green Fluorescent Protein (GFP) e di proteine rosso fluorescente (RFP) Espressione come indicatori per la perdita Neogenin e Neogenin guadagno rispettivamente Dopo microiniezione di un neogenin-targeting shRNA vettore ospitare GFP coniugato o microiniezione di un vettore cDNA neogenin ospitare RFP in 2-PN zigoti, l'espressione della GFP e RFP stato visualizzati sotto un microscopio a fluorescenza nelle fasi 2-cellula e cellula-4. pannello di sinistra, le immagini a contrasto di fase; pannelli centrali e di destra, le immagini di fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Espressione di Neogenin in una blastocisti dopo la microiniezione di uno shRNA Targeting Neogenin o Neogenin cDNA (A) Dopo la microiniezione di un neogenin-targeting shRNA vettore in zigoti 2-PN, il livello di espressione di neogenin nelle cellule blastocisti individuali è stata valutata immunocolorazione con anticorpi anti-bandiera. Nel pannello di sinistra, strapazzate neogenin vettori shRNA sono stati microiniettati (controllo). Nel pannello di destra, vettori shRNA neogenin-targeting sono stati microiniettati. DAPI, DAPI (blu) è stato utilizzato per colorare il nucleo; Anti-Flag, la visualizzazione del tag bandiera sulla neogenin (rosso); GFP, la proteina fluorescente verde (verde); fuse, sovrapposizione di DAPI, Anti-Flag, e GFP. (B) lisati cellulari intere di blastocisti sono stati immunoblotted con anticorpi anti-bandiera. GFP è stato usato come controllo di caricamento. Strapazzate shRNA, strapazzate neogenin iniezione shRNA; Ng shRNA, neogenin-targeting shRNA INIEZ zione. (C) I vettori neogenin cDNA o le neogenin-targeting vettori shRNA sono stati microiniettato nelle zigoti 2-PN e le blastocisti risultanti sono stati sottoposti a immunocolorazione con anticorpi anti-neogenin per misurare il livello di espressione neogenin. Nel pannello superiore, neogenin targeting shRNA stato iniettato. Blastocisti sono stati immunostained con anticorpi anti-neogenin (rosso). GFP, la proteina fluorescente verde (verde); Uniti, sovrapposizione di DAPI, anti-neogenin, e GFP. Nel pannello inferiore, vettori di cDNA neogenin stati microiniettati. Blastocisti sono stati immunostained con anticorpi anti-neogenin (verde). DAPI, DAPI colorazione nucleare (blu); RFP, proteina fluorescente rossa (rosso); Uniti, sovrapposizione di DAPI, RFP, e anti-neogenin. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5: effetti della perdita di Neogenin o guadagno su sviluppo embrionale. 2-PN embrioni di topo sono stati microiniettati sia con piccoli RNA forcina (shRNA) mira neogenin (neogenin perdita) o con i vettori che ospitano neogenin cDNA (guadagno neogenin) e sono state coltivate fino a raggiungere lo stadio di blastocisti. Per differenziare la perdita neogenin da embrioni di guadagno neogenin, GFP e RFP sono stati co-espressi, rispettivamente. A contrasto di fase immagini di embrioni a diversi stadi di sviluppo sono mostrati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Neogenin sovraespressione di favori ICM differenziazione delle cellule (A) ICM in blastocisti sono state viste da immunocolorazione per Oct3 / 4.. DAPI è stato utilizzato per STAnel nucleo. (B) Il numero di celle ICM / 4-positive Oct3 in una blastocisti controllo, perdita neogenin e embrioni guadagno neogenin sono rappresentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti con almeno 10 embrioni utilizzati in ogni esperimento. * Differenze significative dal controllo a p <0,05 per t-test di Student. Analisi (C) RT-PCR di Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2, e Tead4 mRNA da blastocisti di perdita neogenin, guadagno neogenin, e gli embrioni di controllo. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Le sequenze dei primer e le condizioni di PCR utilizzati per RT-PCR.
Tabella 2: Il numero di embrioni di topo Sopravvivere ad ogni Stadio di sviluppo dopo la ricezione Neogenin shRNA o Neogenin cDNA a 2-PN Stage.
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Discussion
Nel presente protocollo, dimostriamo nuovi metodi di microiniezione del materiale genetico, sia cDNA o shRNA, nelle embrioni 2-PN mouse per esplorare il ruolo di neogenin nella differenziazione delle cellule precoce durante l'embriogenesi mouse. La modificazione genetica degli embrioni preimpianto è una tecnica potente nello scoprire informazioni chiave su meccanismi di base molecolari per, ad esempio, la prima determinazione linea cellulare. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati per l'accertamento la funzione del gene. Con relativamente grande receptibility degli embrioni 2-PN per materiali genetici estranei e la fattibilità di microiniezione di cDNA e shRNA nelle embrioni 2-PN, questa tecnica di manipolazione embrione può essere implementato con il minimo disturbo fisico all'embrione, per non parlare del intrinseca complementarità associato a questa manipolazione genetica.
Considerando che l'iniezione citoplasmatica è più facile e meno dannosoper la sopravvivenza di iniezione nucleare, ma, comunque, una elevata espressione di DNA estraneo associata con iniezione nucleare, un miglioramento che va sottolineato è l'uso di centrifugazione per posizionare i pronuclei prima microiniezione nel nucleo. Il passo più sofisticati ed esigenti è la microiniezione di DNA estraneo nel pronucleo di un ovulo fecondato. Questo passaggio è fondamentale e richiede una notevole competenza tecnica e la formazione estesa a padroneggiare la procedura di microiniezione. Una volta che questa abilità è acquisita tuttavia, la variabilità tecnica e gli errori diventano minimi. La sopravvivenza di routine degli embrioni microiniettati è tra il 80-90% nella nostra struttura.
A differenza di questo studio, altri ricercatori posizionati embrioni tenendo la pipetta tale che un pronucleo prossimità della membrana plasmatica era vicino alla microago. Il micro-ago viene poi inserito nel pronucleo 10,11. Abbiamo sperimentato qualche difficoltà visualizzare la pronucleo correttamente sotto il microscopio, senza centrifugazione. Ovviamente, centrifugazione porta il nucleo vicino alla membrana plasmatica per una migliore identificazione. Allo stesso tempo, dovrebbe esserci un margine di miglioramento per una migliore visualizzazione così un posizionamento più del pronucleo.
Contrariamente alla produzione di topi transgenici, il nostro protocollo per la microiniezione di plasmidi in embrioni è una trasfezione transiente per natura, e quindi adatto per sezionare la funzione del gene durante lo sviluppo embrionale preimpianto. Pertanto, il nostro protocollo per un in perdita e la tecnica guadagno-di-funzione potrebbero essere ulteriormente generalizzate per identificare molecole coinvolte nella sviluppo embrionale precoce segnalazione.
Inoltre, la segnalazione neogenin potrebbe essere di grande beneficio per lo sviluppo di linee di cellule staminali embrionali dato che neogenin ed i suoi ligandi sono suscettibili di migliorare i fattori di trascrizione specifici di cellule staminali, come Oct3 / 4, Sox2, e Nanog.
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Disclosures
Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari di rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano inoltre ringraziare il gruppo del Dr. Xiong presso la Georgia Health Sciences University per la produzione e la condivisione dei costrutti per neogenin cDNA e shRNA vettori. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Science Research Program di base (2013R1A1A4A01012572) finanziato dalla Fondazione coreana di ricerca e da un assegno di ricerca da Sahmyook University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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