Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en tap-og få-funksjon metode som er aktuelt å identifisere neogenin som en scene-spesifikk reseptor som fører til trophectoderm og indre cellemasse differensiering i preimplantation museembryoer.
Introduction
Før implantasjon embryoutvikling kan deles inn i flere forskjellige trinn, fra den ene celle-stadiet til morula og blastocyst. Mye tyder på at polariteten og posisjonelle signaler spille en rolle tidlig i cellen skjebne bestemmelse inn i trophectoderm (TE) og den indre cellemasse (ICM). Imidlertid er arten av de signaler, hvor de blir omformet til cellulære signaler, og de fysiologiske sammenhenger hvor slike signaler er i stand til å initiere celle avstamning differensiering er ikke kjent. Disse differensierte celler så gjennomgå fordypning, som begynner å ta på karakteristiske strukturer og funksjoner som er nødvendige for embryo riktig dannelse og vekst av morkaken 1-3.
Før implantasjon embryoer er spesielt mottagelig for manipulering ved direkte injeksjon av endrede genetiske materialer som siRNA eller mål-cDNA, og således kan benyttes for å studere bestemte målmolekyler. Det er en økende forståelse for at genetiskanalyse av virveldyr embryoer er kritisk til å fremme vår forståelse av embryonal utvikling 4. Nøyaktig innføring av en villtype-genet eller en mutant form til et embryo i en riktig sammenheng for å oppnå gevinst-eller tap-av-funksjon av genet har i stor grad studiet av utviklingsmessig regulerte gener. Taps og få-av-funksjon via mikroinjeksjon av genetisk materiale i enkelte tidlige ikke-pattedyr og pattedyr embryoer er relativt enkelt på grunn av sin store størrelse og stor mottakelighet 5. Mikroinjeksjon blir typisk utført ved anvendelse av ikke-virale vektorer. Særlig fordel er tatt av den enkle å bruke ikke-virale vektorer i løpet av virale vektorer og transgener. En rask taps eller gevinst-of-funksjonsuttrykk system i museembryoer har blitt utviklet som tillater oss å dissekere og forstå genet funksjoner i virveldyr embryologi 6,7.
Fluorescent merking av befruktede egg vil i stor grad forenkle valg av microinjected eller genetisk manipulert embryoer og samtidig gi et middel for å kvantifisere indirekte ekspresjonsnivået av mikroinjisert siRNA eller cDNA basert på fluorescerende intensitet 8. For å oppnå dette merking, fluorescerende protein cDNA, GFP eller RFP, er ko-injisert enten som fusjonskonstruksjoner eller separat. Fluorescensintensiteten av GFP eller RFP viser graden av ekspresjon av siRNA eller fremmed DNA for å sikre at taps eller gain-of-funksjon er blitt oppnådd.
Her presenterer vi en micromanipulation protokoll for tap-og gain-of-funksjon teknikk som tillot oss å identifisere neogenin som en reseptor som releer ekstracellulære signaler viktige i begynnelsen av celledifferensiering i preimplantation museembryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer for husdyravl og bekymringer ble gjennomført i henhold til de IACUC forskrifter Sahmyook University, Seoul, S. Korea.
1. superovulation, Avl og oviduct Isolation
- Oppretthold innavlede C57BL / 6 mus under følgende forhold: 22 ± 3 ° C, ~ 60% luftfuktighet, 12 timers lys / mørke syklus, og vann og mat ad libitum.
- Fremkall superovulation av 3-5 uker gamle hunnmus ved en intraperitoneal injeksjon av 5 IU gravid mare serum gonadotropin (PMSG) 0.1 ml / hode etterfulgt 48 timer senere av en intraperitoneal injeksjon av 5 IU humant choriongonadotropin (hCG) 0.1 ml /hode.
- Umiddelbart etter hCG-injeksjon, kompis superovulation-indusert kvinner med kjønnsmodne hanner av samme stamme ved å holde dem i samme bur over natten.
- Neste morgen, bekrefter vellykket parring av tilstedeværelsen av en parring plugg eller vaginal plugg på det kvinnelige kjønnsorgan.
- Sacrifice gravid hunnmusav CO 2 rus fulgt ved halshugging 18-20 timer etter hCG-injeksjon.
- Åpne bukhulen ved å skjære huden og deretter peritoneal lag med fine sakser.
- Plukk opp livmor horn med fin pinsett og dra vekk livmoren, oviduct, eggstokk, og fettpute forsiktig fra kroppens hulrom.
- Skjær området mellom eggleder og eggstokk med fine saks. Reposisjonere pinsett og kuttet i livmoren nær egglederen, slik at minst 1 cm fra den øvre delen av livmoren vedlagt.
- Overfør oviductal ampullen til en 35 mm petriskål inneholdende M16 medium ved romtemperatur. Pool egglederne fra flere mus i samme fatet.
- Plasser oppvasken under et stereomikroskop for gjenfinning av embryoer.
2. henting og kultur 2-Pronuclear (2-PN) Embryoet
- Skjær slutten av en 30 eller 32 G kanyle, male den i en butt spiss, og bruke det som en flushing nål.
- Brukfin pinsett for å skyve enden av egglederen på spyle nålen. Trykk forsiktig tuppen av spyle nålen mot bunnen av fatet for å holde den på plass. Spyl med tuber med ~ 0,1 ml M16 medium for å frigi de to PN-embryoer inn i en petriskål.
- Gjenopprette 2-PN embryoer sammen med omkringliggende cumulus masser fra bluss M16 medium under stereomikroskop med en steril glass pipette og overføre dem til en ny petriskål.
- Dissosiere haug celler fra de 2-PN embryoer ved enzymatisk spalting med 1,0 ml av 0,1-0,5% hyaluronidase i Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS) ved 37 ° C i 5-10 min.
- Denude embryoer ved forsiktig pipettering med et glass pipette og fysisk fjerning av cumulus celler.
- Vask utarmede embryoer tre ganger med 30-50 ml friskt fosfat-bufret saltvann (PBS) per embryo.
- Inkuber embryo i en 35 mm petriskål av plast i M16 media supplert med 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA, desimalplasser du skal brukeion V) ved 37 ° C i 5% CO2 i en fuktig inkubator inntil mikroinjeksjon er laget, som vanligvis er mindre enn 4 timer senere.
3. Embryo Revers transkripsjon (RT) og Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Samle minst 10 embryoer fra hvert trinn opp til blastocyststadiet og pool dem i 4,0 ul 5x revers transkriptase forhåndsblanding oppløsning inneholdende revers transkriptase, RNase-inhibitor, oligo dT primer, tilfeldige 6mers, dNTP-blanding, og reaksjonsbuffer i et PCR rør.
- Legg RNase-fritt destillert H2O til et totalvolum på 20 ul og sonikere de samlede embryoer i 30 sek ved 200 W. Initiere RT-reaksjonen umiddelbart ved 42 ° C i 1 time etterfulgt av 5 minutters inkubering ved 95 ° C.
- For hver 5,0 mL av cDNA løsning generert, gjennomføre normal PCR forsterkning med primere for neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, eller β-aktin (primer sekvenser gitt i tabell 1. PCR består av 40 sykluser med 15 sek inkubering ved 95 ° C, 30 sek ved glødetemperatur (vist i tabell 1), og 30 sek ved 72 ° C.
- Separate PCR produktene ved elektroforese på en 2% agarosegel og visualisere gelen under UV-lys etter farging med etidiumbromid.
- Normal mål genuttrykk mot p-aktin nivåer.
4. Immunocytochemistry av embryoer
- Fiks embryoer fra hvert trinn med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av en kort vasking 3 ganger med PBS inneholdende 0,01% BSA.
- Permeabilize Cellemembraner ved å inkubere 10 embryoer i 1,0 ml PBS inneholdende 0,1% Tween 20 og 0,1% TritonX-100 ved romtemperatur i 10 min.
- For å blokkere ikke-spesifikk binding inkuber permeabiliserte embryoene i 1,0 ml PBS supplert med 10% normalt geiteserum i 30 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber blokkert embryoer viddh kanin anti-neogenin antistoffer ved 1: 100 fortynning i PBS inneholdende 0,1% BSA over natten ved 4 ° C.
- Etter tre vaskinger i 30 sekunder hver i dråper med PBS, inkuberes embryoer med enten Alexa 488-konjugert geite-anti-kanin-IgG eller Alexa 568-konjugert geit-anti-kanin-IgG på 1: 500 fortynning i PBS / BSA-oppløsning over natten ved 4 ° C .
- For å visualisere aktin filamenter, inkuber embryoene i 1 ug / ml phalloidin i PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Flekk kjernene ved tilsetning av 5 ml PBS inneholdende 1 pg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask embryoer tre ganger kort med PBS.
- Overfør embryoene til et glass slide og dekk dem med en dråpe mineralolje.
- Ta bilder med 1,000X forstørrelse med en konfokalmikroskop med en eksitasjon av den aktuelle bølgelengden.
5. Utarbeidelse av Neogenin-RFP og Neogenin-siRNA GFP Plasmider
- Underklone cDNA som koder for mus neogenin inn i en rød fluorescerende protein (RFP) -inneholdende vektor, noe som resulterer i neogenin-flagg-RFP.
- Subklon liten hårnål RNA målretting neogenin i en smaragdgrønn fluorescerende protein (EmGFP) -inneholdende vektor, noe som resulterer i pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin (vist i figur 1).
- Forsterke både neogenin-flagg-RFP og pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin plasmider og rense dem med konvensjonelle metoder.
- Juster sluttkonsentrasjoner på plasmider til ~ 1,0 ug / ml i steril Tris-EDTA (TE) buffer.
6. Mikroinjeksjon av plasmider inn to-PN Embryoet
- Vask blottet 2-PN embryoer gang, kort, med friske M16 media.
- Sentrifuger 2-PN embryoer for 10 minutter ved 1000 x g i en bordsentrifuge for å tillate observasjon av pronuklei.
- Inkuber embryoene i en mikrodråpe 20-30 ul av M16 medium per embryo i henhold mineralolje ved 37 ° C i 5% CO2 i en additional 1-2 hr.
- Produksjon injeksjon pipetter og holder pipetter ved å trekke borosilikat-glass kapillarrør (OD = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) med en mekanisk avtrekker.
- Dikte injeksjon pipetter for å ha sløve tips og polerte åpningene <500 mikrometer tips lengde og 1-2 mikrometer tips indre diameter ved hjelp av en microgrinder og en microforger.
- Fremstill holder pipetter slik at de har butte tips og polert åpninger med en indre diameter på 20 um og en ytre diameter på 100 um.
- Load injeksjon pipetter med en tilstrekkelig mengde (> 200 nl) av plasmid løsning på 1,0 mikrogram / mikroliter.
- Microinject ~ 10 pl av plasmid oppløsning for hver 2-PN embryo i en av de pronuklei ved hjelp av en microinjector festet til et motorisert mikromanipulator; i løpet av denne prosessen, må embryoer i stilling ved påføring av negativt trykk med et holde pipette.
- Etter mikroinjeksjon, vaske to-PN embryoer 3 ganger med frisk M16 media for less enn 1 min hver gang.
- Kultur de to-PN embryo i en dråpe ferske M16 media på en plast kultur tallerken dekket av en mineralolje fall å hindre media fordampning.
- Observer embryoene ved 24 timers mellomrom i henhold til en differensial interferens kontrast (DIC) invertert mikroskop ved 200X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi oppdaget at neogenin er forbigående uttrykt i de tidlige utviklingsstadier av preimplantation mus embryo, som vises så tidlig som ved 2-cellers scenen og varte til tidlig morula men å bli mangelfull på slutten morula og blastocyst trinn (Figur 2A). I tillegg ble den romlige fordelingen av neogenin begrenset hovedsakelig til utenfor cellene. Resultatene av RT-PCR-analyse var i overensstemmelse med den tidlige og forbigående natur neogenin uttrykk, med en topp i 4-cellestadiet, men mangler fullstendig i 16-cellestadiet eller senere (figur 2B). I motsetning til dette, fikk F-aktin ikke viser en slik forbigående og polarisert uttrykksmønster.
Vi neste undersøkt om neogenin nivåer kan bli manipulert ved mikroinjeksjon av enten neogenin cDNA vektorer (neogenin gevinst) eller vektorer som bærer shRNA targeting neogenin (neogenin lose) inn i to-PN zygote. For å visuelt skille neogenin gevinst fra neogenin tap, RFP og GFP var co-uttrykt som indikatorer (figur 3), og den resulterende neogenin uttrykket nivået ble bekreftet både av immunfluorescens og ved immunoblotting (figur 4).
Figur 5 viser representative bilder av embryoer på hvert trinn etter å ha mottatt enten neogenin shRNA eller neogenin cDNA i 2-PN stadium. Det var ingen åpenbare brutto morfologiske forskjellene mellom neogenin tap og neogenin gevinst embryoer, og ingen utviklings potensielle forskjeller i hvert fall inntil blastocyststadiet (tabell 2). Faktisk, både antallet overlevende embryoer på hvert trinn og antall pågrepne embryoer var ikke signifikant forskjellige.
Men ICM utvikling ble mindre uttalt i neogenin tap enn neogenin gevinst embryoer somdokumentert av en høyere uttrykk av ICM-spesifikke Oct3 / 4 i neogenin gain embryoer (figur 6A) og ved høyere antall Oct3 / 4-positive ICM celler per blastocyst i neogenin gevinst enn neogenin tap embryoer (Figur 6b). Videre RT-PCR-analyse viste en sterk korrelasjon mellom ekspresjonsnivået av tre transkripsjonsfaktorer og som av neogenin. I neogenin tap blastocyster, lite Oct3 / 4, Sox2, og Nanog ble påvist, noe som er i skarp kontrast til en signifikant økning i ekspresjonen av alle tre transkripsjonsfaktorer i neogenin gevinst over styre embryoer (figur 6C). Uventet, uttrykket nivåer av Cdx2 og Tead4, transkripsjonsfaktorer involvert i differensiering TE / vedlikehold 6,7, ble mindre påvirket av ekspresjonsnivået av neogenin, validering at oppregulering av neogenin fører til aktivering av transkripsjons regulatorer spesifikke for ICM men ikke for TE etablering. Alle data som vises er m odified fra referanse 9.
Figur 1: Oppbygging av pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Uttrykk for Neogenin Under Mouse Embryonic Development (A) Confocal mikroskopiske bilder av neogenin uttrykk i preimplantation embryoer på ulike utviklingsstadier. (B) Den revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon av neogenin mRNA i preimplantation embryoer på forskjellige utviklingsstadier. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Grønt fluorescerende protein (GFP) og Red fluorescerende protein (RFP) Uttrykk som Indikatorer for Neogenin Tap og Neogenin Gain, henholdsvis etter mikroinjeksjon av en neogenin målretting shRNA vektor husing konjugert GFP eller mikroinjeksjon av en neogenin cDNA vektor husing RFP inn 2-PN zygoter, ekspresjon av GFP og RFP ble visualisert under et fluorescens-mikroskop ved 2-celle og celle-4 etapper. Venstre panel, fase-kontrast; midtre og høyre panel, fluorescens bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Expression of Neogenin i en Blastocyst Etter Mikroinjeksjon av enten shRNA Targeting Neogenin eller Neogenin cDNA (A) Etter mikroinjeksjon av en neogenin målretting shRNA vektor i to-PN zygotes, ble uttrykket nivået av neogenin i enkelt blastocyst celler evaluert av farging med anti-flagg antistoffer. I venstre panel, egge neogenin shRNA vektorer ble microinjected (kontroll). I panelet til høyre, ble neogenin målretting shRNA vektorer microinjected. DAPI, DAPI (blå) ble anvendt for å flekke kjernen; Anti-flagg, visualisering av flagget tag på neogenin (rød); GFP, grønt fluorescerende protein (grønn); fusjonert, overliggende DAPI, anti-flagg, og GFP. (B) Hele cellelysater av blastocyster ble immunoblottet med anti-flagg antistoffer. GFP ble anvendt som en kontroll lasting. Egge shRNA, egge neogenin shRNA injeksjon; Ng shRNA, neogenin målretting shRNA injec sjon. (C) De neogenin cDNA-vektorer eller de neogenin-målretting shRNA vektorer ble mikroinjisert inn i de to PN-zygotes og de resulterende blastocyster ble underkastet farging med anti-neogenin antistoffer for å måle neogenin ekspresjonsnivå. I den øvre panel, ble neogenin målretting shRNA injisert. Blastocyster ble immunostained med anti-neogenin antistoffer (rød). GFP, grønt fluorescerende protein (grønn); Fusjonerte, overliggende DAPI, anti-neogenin, og GFP. I den nedre panel, ble neogenin cDNA vektorer microinjected. Blastocyster ble immunostained med anti-neogenin antistoffer (grønn). DAPI, DAPI nukleær farging (blå); RFP, rød fluorescerende protein (rød); Fusjonerte, overliggende DAPI, RFP, og anti-neogenin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pload / 53696 / 53696fig5.jpg "/>
Figur 5: Virkninger av Neogenin Tap eller gevinst på embryoutvikling. 2-PN museembryoer ble microinjected enten med liten hårnål RNA (shRNA) rettet mot neogenin (neogenin tap) eller med vektorer som bærer neogenin cDNA (neogenin gain) og ble dyrket inntil nå blastocyststadiet. For å skille neogenin tap fra neogenin gain embryoer, GFP og RFP ble samtidig uttrykt henholdsvis. Fasekontrastbilder av embryoer på ulike utviklingsstadier vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Neogenin Overuttrykte favoriserer ICM Differensiering (A) ICM celler i blastocyster ble sett av farging for Oct3 / 4.. DAPI ble anvendt for å stai kjernen. (B) Antall Oct3 / 4-positiv ICM-celler i en blastocyst av kontroll, neogenin tap, og neogenin forsterknings embryoer er representert som gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter med minst 10 embryoer anvendt i hvert eksperiment. * Vesentlige forskjeller fra kontroll på p <0.05 av Student t-test. (C) RT-PCR analyse av Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2, og Tead4 mRNA fra blastocyster av neogenin tap, neogenin gevinst, og kontroll embryoer. β-actin ble brukt som en intern kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Sekvenser av primere og PCR-betingelsene som ble benyttet for RT-PCR.
Tabell 2: Antall overlevende mus embryoer på hvert utviklingsstadium etter å ha mottatt Neogenin shRNA eller Neogenin cDNA ved 2-PN Stage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den foreliggende protokollen, viser vi nye metoder for mikroinjeksjon av genetisk materiale, enten cDNA eller shRNA, i 2-PN museembryoer for å undersøke hvilken rolle neogenin tidlig i celledifferensiering under musen embryogenese. Genmodifisering av preimplantation embryoer er en kraftfull teknikk i å avdekke nøkkelinformasjon om underliggende molekylære mekanismer for, for eksempel, den første cellen avstamning besluttsomhet. Genmodifisering er en av de mest brukte metodene for å fastslå gen-funksjon. Med relativt stor receptibility av de to-PN embryoer for utenlandske genetiske materiale og muligheten for mikroinjeksjon av cDNA og shRNA inn i de to-PN embryoer, kan dette embryo manipulasjon teknikken gjennomføres med minimal fysisk avbrudd i embryo, for ikke å nevne den iboende komplementaritet forbundet med denne genetisk manipulering.
Tatt i betraktning at cytoplasmatisk injeksjon er enklere og mindre skadeligtil overlevelse enn atom injeksjon, men likevel er et høyere uttrykk av fremmed DNA i forbindelse med atom injeksjon, en forbedring som bør vektlegges bruk av sentrifugering for å plassere pronuklei før mikroinjeksjon inn i kjernen. Den mest teknisk avanserte og krevende trinn er mikroinjeksjon av fremmed DNA i pronukleus av et befruktet egg. Dette trinnet er kritisk og krever betydelig teknisk kompetanse og omfattende opplæring for å mestre mikroinjeksjon prosedyren. Når denne ferdigheten er ervervet imidlertid teknisk variasjon og feil blir minimal. Rutinen overlevelse microinjected embryoer er mellom 80-90% i anlegget vårt.
I motsetning til denne studien, andre forskere plassert embryoer ved å holde pipetten slik at en pronukleus nær plasmamembranen var nær Microneedle. Den mikro-nål settes deretter inn i pronukleus 10,11. Vi har opplevd noen problemer med å visualisere prokjernen riktig under mikroskopet uten sentrifugering. Selvfølgelig, sentrifugering bringer kjernen nær plasmamembranen for bedre identifisering. Samtidig bør det være et visst rom for forbedring for bedre visualisering således bedre posisjonering av pronukleus.
I motsetning til det transgene mus produksjon, vår protokoll for mikroinjeksjon av plasmider inn i embryoer er en forbigående transfeksjon av natur, og dermed egnet for å dissekere genfunksjon i løpet av preimplantation embryonal utvikling. Derfor kan vår protokoll for en tap-og gain-of-funksjon teknikken videre generaliseres til å identifisere signalmolekyler involvert i tidlig embryoutvikling.
I tillegg kan neogenin signale være svært gunstig for utviklingen av embryoniske stamcellelinjer som er gitt som neogenin og dets ligander er sannsynlig å forbedre stamcelle spesifikke transkripsjonsfaktorer som Oct3 / 4, Sox2, og Nanog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker også å erkjenne Dr. Xiong gruppe på Georgia Health Sciences Universitet for produksjon og deling av konstruksjonene for neogenin cDNA og shRNA vektorer. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) finansiert av den koreanske Research Foundation og med et forskningsstipend fra Sahmyook University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
