Summary
여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.
Abstract
생체 내 이미징 기능은 기능과 뇌 세포와 관심의 구조의 생리를 연구 할 수있는 강력한 방법이되고있다. 최근 발광 생물-GFP 리포터 쿼린 (GA)을 사용 -imaging 칼슘의 새로운 방법이 개발되었다. 그 팩터 코 엘렌 테라의 첨가 - - 광자 수집기를 통해 모니터링 할 수 밝은 발광을이 새로운 기술은 칼슘과 결합 할 수있는 분자의 제조, 및 GFP 쿼린 유전자 융합에 의존한다. GFP-쿼린 유전자를 운반하는 형질 전환 계통은 마우스 및 초파리 모두에 대해 생성되었다. 초파리, GFP-쿼린 유전자는 뇌 내에서 표적 발현 및 이미징을 허용 GAL4 / UAS 진 발현 시스템의 통제하에 놓여있다. 이 방법은 연속적으로 검출 할 수있는 것으로 나타났습니다 모두 칼슘 안쪽 2+ -transients과 칼슘은 내 상점에서 -released. 가장 중요한 점은 연속 촬영, 뇌 내에서 더 깊이에서 영상에 더 큰 기간 동안 허용하고, (8.3 밀리 초까지) 높은 시간 해상도로 기록. 여기에서 우리는 기록하고 칼슘에게 버섯 기관 내에서 2 + -activity, 플라이 뇌의 학습과 기억의 중심 구조를 분석하는 생물 발광 영상을 사용하기위한 기본적인 방법을 제시한다.
Introduction
기본적인 패턴과 뇌와 분리 된 구조 내에서 활동의 기능은 긴 신경 과학 분야 내에서 강렬한 연구의 영역이었다. 아마도 이러한 문제를 해결하는 데 이른 성공적인 방법 중 일부는 전기적 활성도의 변화를 직접 생리적 측정 하였다 -에 추가 기능을 가져왔다 (활동 프록시와 같은) 전압의 pH 또는 칼슘 농도의 변화의 라이브 영상을 허용하지만 다른 방법은 신경 활동 1의 연구. 이미징 기술은 감소 된 침습성 및 뇌 전체 구조물 내에 활동을 모니터하는 등의 장점을 가지고 다양한. 또한 과일을 포함하여 다루기 쉬운 유전학과 동물에 초파리, 같은 카멜레온, GCaMPs 등과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표의 개발을 비행 한 단일 신경 세포, 신경 세포의 인구 및 전체 뇌를 모니터링하는 연구를 허용 한구조. 전통적인 형광 칼슘 이미징 방법 (칼 모듈 린에 융합 CFP와 YFP) (칼 모듈 린에 융합 GFP) 또는 FRET을 GCaMPs를 사용하는 동안 좋은 공간 및 시간 해상도를 제공하는 유용한 기술을 입증 한 빛 여기의 기본 프로세스는 실험에 몇 가지 제한을 낳는다 응용 프로그램. 이에 의한 묘화 될 수 구조물의 깊이를 제한 불가피하게 생성되는 여기 광, 형광도, 광 표백제 및 광독성의 특성에, 녹화 시간뿐만 아니라 기록 실시간 연속성. 즉, 이러한 기록은 종종 바람직하지 않은 부작용을 방지하기 위해 간헐적으로 수행되어야한다.
이러한 어려움 때문에, 칼슘의 이미징 추가적인 다른 방법이 개발되었다. 가장 유망한 방법 중 하나는 칼슘 결합 후 효소 반응을 통해 제조 된 광 생물 발광 이미징에 의존한다. BioluminescenT 영상은 기존의 칼슘 이미징과 같은 문제가 발생하지 않습니다 결과적으로 빛 자극을 필요로하지 않습니다. 발광 생물 기자 쿼린 - 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 격리 λ (GFP는 isolated-되었던 같은 해파리는 세 EF 손 구조를 통해 칼슘을 결합하여 그 보조 인자의 코 엘렌 테라의 산화와 푸른 빛의 방출로 이어지는 구조적인 변화를 겪게 = 469 ㎚) 2,3. 에 쿼린은 거의 배경 잡음을 생성 및 세포 내 칼슘 버퍼링 시스템 (4)과 간섭하지 않기 때문에 칼슘 과도 모니터링 이상적 칼슘 (K의 D = 10 μM)에 대한 매우 낮은 친화도를 갖는다. 쿼린 나란히 Xenopus의 달걀 5 제조 비추어 신경 유도의 과정을 모니터링하는 데 사용되었지만, 신경 세포 활성도의 실시간 영상에 사용하기에 너무 희미하다. 이 도전 필립 브롬 및 해결하기위한 노력# 251; 파스퇴르 연구소의하자 동료들은 해파리 4에서 기본 상태를 모방, GFP 융합 유전자를 쿼린 유전자 구조를 만들었습니다. 이 융합 유전자 생성물은 GFP에 비방 에너지 전송 엘렌 테라, 산화 선도 형태 적 변화를 겪게 쿼린의 세 EF 손 구조를 통해 다시 칼슘을 결합한다. 대신 쿼린에서 푸른 빛의 GFP에서 녹색 빛 (λ = 509 ㎚)의 릴리스에서이 에너지 전달의 결과. GFP 및 쿼린의 융합은 혼자 4 쿼린보다 19-65 배 더 밝은 융합 단백질 생산 등을 돕는 큰 단백질의 안정성을 부여한다. 뇌 내의 생물 발광 방식을 사용하는 것은 연속적인 기록 기간 및 기록 할 수있다 뇌 내의 구조의 수의 관점에서 모두 칼슘 이미징 실험의 전류 프로그램을 확장한다. 대체로 기존 연구의 맥락에서 그것은 그 두 세계와 더 큰 의미뇌의 지역화 "활동"의 다양한 (칼슘 과도의 프록시를 통해) 모니터링 할 수 있습니다. 더 중요한 활성 용이 뇌 기저 함수의 완전한 이해를 추구라는 것으로 실시간으로 지속적에서는 이상을 감시 할 수있다.
지난 몇 년간, 본 연구실 및 다른 바이너리 발현 시스템의 통제하에 GFP-쿼린 (GAL4 / UAS-GFP-쿼린) -5,6- 발현 형질 전환 초파리을 개발 하였다. 우리는 직접 니코틴 응용 프로그램 (9)에 의해 아세틸 콜린 수용체 자극 다음 버섯 몸에 칼슘 -activity 변조 등의 향기 7, 8 등의 천연 자극뿐만 아니라 공부 세포 성분에 의해 생성 된 기록 활동에 GFP - 쿼린 생물 발광을 사용했습니다. 또한, 우리는 또한 장기간 같은 이전 해결 될 수 없었다 실험 질문들을 해결하기 위해 GFP-쿼린을 사용한자연 칼슘 과도 깊은 뇌 구조 (10)의 시각화의 영상. 더 최근에, 우리는 포유류 ATP 수용체 P2X 2 11 프로젝션 뉴런 양이온 채널 (PN 수)를 표현하는 GAL4 / UAS 시스템을 사용하고 (MB247-LEXA를 버섯 체에서 GFP-쿼린을 표현 LEXA 시스템을 사용한, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. 파이퍼, Janelia 농장, 미국)의 의례. 이것은 우리가 같은 냄새 자극에 대한 반응으로 자연 조건을 모방 차례로 버섯 기관 (PN이의 다운 스트림 대상)를 활성화 ATP의 응용 프로그램에 의해 PN을 활성화 할 수있다. 전반적으로이 P2X이 결합 기술과 GFP - 쿼린은 실험 가능성을 확장합니다. 넓게는 다른 자극과 섭동 활동의 기저 패턴을 변경할 수있는 새로운 방법에 대한 연구를 시작,보다 뇌 활동의 패턴을 이해할 수있는 기회를 제공한다.
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Protocol
샘플 1. 준비
- 솔루션의 준비 및 설정
- 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다.
- 유리 병에 10 명의 남성과 10 명의 여성을 처녀 추가, 그들이 짝짓기를하게하고 신선한 유리 병에 2 일마다 전송할. 파리 eclose 시작하면을 10 일 후, 매일 파리를 수확. 파리의 나이에 대한 정확한 기록을 유지하고 좋은 상태로 보관하십시오.
- 3 일에, 여성에서 남성을 분리하고 여성에게 유리 병 당 20 파리를 유지합니다. 4 오일 세에 파리를 기록합니다.
- 다음 농도의 링거액 조제 : 130 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 HEPES, 및 36 mM의 수크로오스를 정확하게 7.3으로 용액의 pH를 조정한다. 25 μ의 관류 솔루션을 준비; 링거액에 M 니코틴 100 밀리미터의 KCl.
- 경사에 (팁의 끝에서 약 35 °)를 면도날 모양의 팁을 사용하여 끝에서 1 ½ 센티미터 이상 초과베이스를 제거 : 1,000 μL 피펫 팁을 준비합니다.
- 배양하는 동안 시료의 저장 상자 (23cm X 17cm X 8.5 cm)를 준비합니다. 그 준비가 완료되는에 샘플을 배치하는 작은 랙 장치 아래의 [샘플 탈수를 방지하기] 바닥에 물과 포화 두 스폰지 (12cm X 8cm X 3cm)을 놓습니다.
- 그들은 GFP - 애큐 오린의 발현을 드라이브에 GAL4 라인의 UAS-GFP - 애큐 오린의 적어도 1 부 및 사본을 포함하도록 파리 샘플을 준비합니다. OK107 GAL4 라인 (주로 버섯 몸의 라인 구동 식)이 준비 UAS-GFP - 쿼린 교차된다.
주 : 상자의 내부를 방수이어야하고 외부는 배양 중에 코 엘렌 테라의 열화를 방지하기 위해 박스 들어가는 빛을 차단한다.
- 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다.
- 예습샘플 aration
- 얼음은 유리 바이알에 전달함으로써 초파리 마취 및 피펫 팁에 위치시키는 냉장 페트리 접시로 이동되기 전에 2 분 동안 얼음에 보관. 해부 현미경으로 얼음에 100 ml의 페트리 접시에 약간 적신 여과지에 피펫 팁을 준비합니다.
- 부드럽게 집게 장소에 피펫 팁의 내부에 비행.
- 부드럽게 밀어 머리가 팁의 가장자리를지나 완전히와 지느러미 영역이 부분적으로 팁의 형성 (그림 2B) 중에 제거 섹션에 의해 노출되도록 비행을 정렬 브러시를 사용하여.
- 치과 용 접착제의 두 성분의 작은 (약 3-4 μL) 부분을 결합한다. 피펫 팁의 가장자리 주위에 다시 아래로 머리와 목을 전면 주위에 조심스럽게 접착제를 적용하고 - 머리의 왕관을 피하는. 2 분 동안 접착제 건조하자.
- 기록 챔버 (그림 2D) 및 세대의 구멍을 통해 접착 플라이 장소 피펫 팁TLY 장소에 고정 키를 누릅니다.
- 실리콘 접착제 (약 3-4 μL)의 두 가지 구성 요소를 결합합니다. 챔버와 피펫 팁 만나는 링거액의 누출을 방지하기 위해 가장자리를 따라 챔버의 평평한면에 접착제를 적용합니다. 2 분 동안 접착제 건조하자.
- 해부
- 관류 채널 짧은 가장자리 위에 테이프를 부착하고, 챔버의 후면으로 연장.
- 형광 램프 현미경 회전에서 해부 블록에 비행과 챔버를 놓습니다. 챔버에 링거액 정확하게 취하여 1 ml의.
- 표피를 제거하는 미세 수술 용 칼을 사용합니다. 더듬이 지역에 머리 뒤쪽에서 평행하게 절개를합니다. 그런 다음, 이전 절개 접속 안테나 상기 수직 절개를 눈의 가장자리를 따라 절단. 머리 뒤쪽에 해당하는 최종 절개 평행 만든다. 표피 (그림 2C)를 제거하는 미세 날카로운 집게를 사용합니다.
- 부드럽게를 파악하는 좋은 날카로운 집게를 사용하여뇌와 [형광] 버섯 몸이 명확하게 가시화 될 때까지 떨어져 호흡기 조직을 노출 지워 거라고.
- 조심스럽게 잡고 코 엘렌 테라의 침투를 허용하도록 뇌를 덮고 neuroepithelial 조직 끼지 매우 날카로운 집게를 사용합니다.
참고 : 또는 파파인 neuroepithelia 9 Permeabilize 하시려면하는 데 사용할 수 있습니다. - 피펫을 사용하여 어두운 상자에 해부 및 장소 샘플에서 이물질을 제거하는 링거액로 두 번 씻어.
- 챔버 내로 5 μM 벤질 엘렌 테라 함유 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. 2 시간의 최소 실온에서 코 엘렌 테라와 배양을 상자를 닫고 있습니다.
2. 영상
- 설정
- 기록 시스템을 시작 : 25 ° C에 현미경, 컴퓨터, 카메라 및 배수 시스템과 설정 방에 환경 관리를 켭니다.
- 열기 측정 및 컴퓨터의 자동화 탐색기 프로그램. 클릭 “, 디바이스와 인터페이스 NI 모션 장치 "에 두 번 클릭" "와에 마지막으로 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭"PCI-7334 "하고"장치를 초기화 ".
- 광자 이미 저를 엽니 다. 새 폴더와 이름, 제 1 기록 파일을 만듭니다. 시스템이 작동하기 전에 카메라는 -80 ° C에 도달해야합니다.
- 설정 관류 시스템 - 저수지의 KCl, 니코틴, 그리고 링거액을 추가하고 2 ml / 분에서 그렇게 각 솔루션 방전을 조정합니다. 실험을 시작하기 전에 링거액과 함께 씻으십시오.
- 샘플을 준비
- 장소의 영상은 5 배 배율 현미경 마운트에 블록 접시를 탑재하고 구멍을 통해 채널로 관류 관을 삽입합니다.
- 형광등 모드로 설정 한 후 현미경 센터와 초점 버섯 몸 (MB들)을 가지고. 20X 재 중심과 초점을 조정합니다.
- 팁이되도록 배수 풀 위에 위치 배수 장치는 단지 abov 배수 션트의 높이를 조정전자 수영장, 적절한 배수를 보장하기 위해 30 초 동안 링거액을 실행합니다.
- 빛으로부터 장치를 봉쇄하기 위해 방패를 아래로 당깁니다. 광자 이미 저에서 자동화 된 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정과 매크로 블럭의 기준 형광 화상을 받아.
- 녹음
- 원하는 녹화 속도 (50 밀리 초에서 최대 1 초 또는 그 이상)에 광자의 속도를 조정합니다. 선택 광자 모드와 오픈 셔터. 로그 항목에 기록 유전자형, 성별, 연령, 시료 번호. 투자 수익 (ROI) 상자를 클릭하고 컨트롤을 누른 상태에서 드래그하여 위치 투자 수익 (ROI)의 꽃받침과 세포 기관 (CCB)를 통해 상자와 중간 엽을 조정합니다.
- (필요에 따라) 약 5 ~ 10 분 녹음 기준.
- 1 분 동안 니코틴을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 5 분 링거액과 함께 씻으십시오.
- 복구를 위해 5 분을 기다린의 KCl에게 로그 항목 및 타이머를 준비합니다.
- 1 분 동안의 KCl을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 1 분 링거액과 함께 씻으십시오.
- 스위치형광등 모드로, 최종 형광 이미지를 촬영하고, 링거액을 끕니다.
- 를 눌러 "정지". 대화 상자가 시스템을 차단 요청합니다. "아니오"녹음을 계속 선택합니다.
- 열기 방패, 이동 배수 시스템, 5 배에 스위치 렌즈 목적은, 관류 튜브를 제거합니다. 무대에서 샘플 / 기록 요리를 제거 세척과 물을 두 번 렌즈를 닦아 20X 렌즈를 청소합니다.
- 다음 촬영을 시작 프로그램 창 상단에있는 흰색 재생 버튼을 누릅니다.
3. 분석 및 비디오 제작
- 광자 값을 추출
- 광자 분석 프로그램을 엽니 다 (예를 들면, 광자 뷰어) 열린 첫 번째 샘플 스프레드 시트 파일.
- 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 컨트롤을 누른 상태에서 지역을 클릭하여 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. GFP 조명 CCB와 중간 엽을 포함하는 관심 지역의 크기, 방향 및 모양을 조정합니다.
- 또한 추가및 클릭 "투자 수익 (ROI)을 정의"를 클릭하고 새로운 투자 수익 (ROI)을 만들 화면에 끌어 등 투자 수익 (ROI).
- 광자 비디오를 재생할 수있는 "동영상"탭을 선택합니다. 원하는대로 "초 폭"과 "초 단계"를 조정합니다. 투자 수익 (ROI)의 배치가 필요에 따라 조정합니다.
- GFP의 형광, 니코틴 반응과의 KCl 응답의 대표 스크린 샷을 선택합니다. 나중에 분석 및 비교를위한 프리젠 테이션 슬라이드에 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지.
- "초 폭"과 초 기록 속도를 "초 단계"모두를 조정합니다. 자극 개시 전에 그냥 반응 종료 후 브래킷 영역으로 상단 패널에 회색 마커를 이동하여 분석의 길이를 선택합니다.
- "> PLAY"를 눌러 "<< REW"를 누르십시오 "를 재생하는 동안보기를 일시 중단"을 선택합니다. "속도 차트를 계산"원하는 라인의 색상이 투자 수익 (ROI)의 색상을 일치하도록 장치를 조정 탭을 선택합니다.
- 분석이 완료되면키를 눌러 "수출 속도 데이터를 계산합니다." 결합 기록의 CCB와 각 측면에서 관심의 중간 엽 영역의 선택 스크린 샷. 응답 이미지 슬라이드로 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. 이 슬라이드는 나중에 최종 분석에 사용됩니다.
- 예 분석 : 세부 광자 추출 데이터의 분석을위한 하나의 방법
- "속도 수출 카운트"폴더에 스프레드 시트 파일을 엽니 다.
- 세포에게 시간과 분으로 시간을 표시하는 첫 번째 열에 표시된 시간을 포맷.
- 샘플에 대한 해당 슬라이드를 참조. 시간과 두 대표의 ROI에 대한 열을 제외한 모든 값을 제거합니다.
- 니코틴 자극 시작 시간을 결정 - 주에서 로그 항목 파일에서 사용할 수있는 시작하거나 하이라이트 값 이전에 추가 데이터를 제거 폴더 -.
- CCB와 중간 엽과 마크 / 강조 모두 최고 / 최대 값을 찾습니다.
- 모두에 대한 응답의 시작 및 종료 시간을 결정에서 시점을 사용하여 견적을 작성하여 CCB와 중간 엽 슬라이드에 응답을 그래프와이 점에 근접한 값의 변화에 의해 실제 값을 선택 대응. CCB와 중간 엽 모두 이러한 점 사이의 영역을 강조 표시합니다. 또한, 9 매크로를 사용합니다.
- 새 스프레드 시트에 한 실험군의 모든 샘플을 결합합니다.
- 로우 값을 결정하여 피크에 맞추고 각 CCB 피크 값이다. 그 샘플 데이터를 다시 복사해야 대략 행 값을 결정하기 위해 가장 높은 로우 값에서 낮은 값을 뺀다. 모든 피크 값이 정렬되어 있는지 확인합니다.
- 시트를 두 번 복사 한 중간 엽 열 또는 만 CCB 또는 중간 엽 값의 페이지를 만드는 CCB 열 중 하나를 삭제합니다.
- 모든 CCB 응답이 끝난 후 데이터를 제거합니다. 4 행은 총 광자, 응답의 길이 (시간), 피크 진폭 및 응답 대기 시간을 표시 만듭니다. 복사하고 원본 아래에 다시 붙여 넣습니다.
- 응답 중 총 광자를 결정하기 위해 SUM 함수를 사용합니다. 응답의 길이를 결정하기 위해 COUNT 함수를 사용합니다. 복사 및 피크 진폭 값을 결정하는 가장 높은 값 셀을 연결합니다. COUNT 함수를 사용 - 응답의 시작 니코틴 관류의 선두로부터 선택 - 응답 대기 시간을 결정한다.
- 초 단위로 속도를 기록하여 (모든 피크 진폭 제외) 다중 연결 기능을 사용하여 복사 값.
- 그래서 (예 : 그림 5B, C, D)를 원하는 경우 바 / 박스 그래프 등 총 광자, 피크 진폭 및 응답의 길이로 계산 된 매개 변수에 대해 생성 될 수있다.
- 원시 데이터 광자 응답 후 열에서 평균 함수를 이용하여 각 시점에 대한 원시 데이터 포인트의 평균. 평균 (SEM)의 표준 오차를 결정하는 단계와, 원하는 열 다음 시점에서 평균 광자 값의 각각에 대한 경우.
- 평균 응답 PROFIL를 구성하는 평균 열을 사용CCB 샘플 그룹에 대한 전자 [그래프]. 이 x 축 값과 시간을 지정하는 열과 y 축으로서 평균 광자 값의 열을 선택하고 최종적 산점도 그래프 생성 도구를 선택 할까.
- 중간 엽의 데이터로이 분석 절차를 반복합니다.
- 비디오 이미지 만들기
- 열기 광자 뷰어.
- 선택 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 선택 제거 및 / 또는 그것을 최소화하기 위해 컨트롤을 유지하면서 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다.
- "초 폭"각 프레임의 콘텐츠를 결정하기 위해 원하는대로 (축적 시간)를 수정한다.
- 각 프레임의 오버랩을 정의하기 위해 "초 공정"수정한다.
- 프레스 "<< REW"다음 "재생하는 동안 수출 전망"을 "재생>"를 선택합니다. 비디오 이미지는 .PNG 파일의 일련의 "보기 수출"폴더에 수출됩니다.
- 비디오 C위한 하나의 방법 : 가상 신참을 사용하여 비디오를 만들려면자세한 reation
- 이미지를 포함하는 뷰 수출 폴더에 "resultats"라는 새 폴더를 만듭니다.
- 이미지의 폴더에 스크립트 (renommer.VBS)를 준비한다.
- renommer.VBS 두 번 클릭하여 실행합니다.
- 이미지는 자동으로 숫자로 이름을 변경하고 "resultats"폴더에 복사됩니다.
- 열기 VirtualDub.exe.
- 열려있는 비디오 파일을 선택합니다 - (연속 된 이미지가 자동으로로드됩니다) 첫 번째 이미지를 선택합니다.
- 선택 비디오 - 원하는대로 선택 프레임 속도 조정.
- 선택 비디오 - 선택 압축 반경으로 Cinepak이 코덱을 선택합니다.
- 파일에서 동영상이 자동으로 생성됩니다 AVI로 저장을 선택합니다.
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Representative Results
쿼린에 GFP의 융합은 우리가 현미경 (그림 3A, 4A, 6A, 6E)에 형광 모드에서 GFP의 여기를 통해 이전에 생물 발광 영상에 관심이 우리 지역을 시각화 할 수 있습니다. 버섯 체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온 성 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 통해서이다. 아세틸 콜린이 수용체의 내인성 리간드이지만 우리는 니코틴이 버섯 몸에 더 재현 반응을 생산하는 것으로 나타났습니다. 그들은 특히 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체를 발현하고, 따라서 니코틴을 이용하여 우리가 다른 뇌에서 발현 무스 카린 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 방지 할 수 있기 때문 부분이다. 더욱이, 니코틴 아세틸 콜린보다 안정적이고, 따라서,보다 효율적이고 신뢰성있는 자극 제어를 허용한다. 전형적인 응답은 (그림 4 참조 꽃받침, 세포 기관 (CCB)과 중간 엽 (ML) 모두의 빠른 활성화로 시작표지 이미지). 일반적 CCB 응답 길게 지속되고 응답 순차 패널에 도시 된 바와 같이 돌출부보다 큰 생물 발광 응답을 나타낸다 (도 3c-H)은.도 4b는 100 밀리의 시간적 해상도 기록 광자 10 초 축적 (10 나타낸다 25 μm의 니코틴의 1 분 관류에 대한 응답의 피크시 Hz에서). 우리는 우리의 샘플의 가능성을 확인할 수 있습니다 100 밀리미터의 KCl의 1 분 관류의 두 번째 자극이 시작되는 10 분 (도 4C, E)의 세척 및 복구 기간에 따라. 양적 응답은 광자 뷰어에서 분석 기간 동안 투자 수익 (ROI)을 선택하여 분석 할 수 있습니다. 광자 뷰어에서 분석을 실행하면 그 값의 두 시간 (그림 4D와 E)를 통해 선택한 투자 수익 (ROI)에서 방출되는 광자의 수를 표시 한 그래프뿐만 아니라 내보낼 스프레드 시트를 생성합니다. 그림 4D는 examp입니다제작 투자 수익 (ROI) 2 [녹색]에서 방출되는 광자를 플로팅 광자 뷰어 (오른쪽 CCB) 및 투자 수익 (ROI) 4 [블루] (오른쪽 중간 엽)에 의해 생성 된 그래프. 그림 4E에서 표현의 KCl 응답에 대한 유사 데이터. 보낸 데이터가 응답 (도 5a)의 곡선을 재구성뿐만 아니라 시간, 피크 진폭 및 전체 응답 (도 5B-D)과 같은 다양한 파라미터에 대한 추가 데이터를 추출하는데 사용될 수있다. 최근 우리는보다 자연스러운 반응을 유도하는 방법을 고안했다 GAL4-UAS 및 LEXA 시스템을 사용. 간단히, ATP-문이 P2X 2 양이온 채널 (PN)로 투사 신경 세포에서 발현되며, GFP - 쿼린 (GA)는 버섯 몸으로 표현된다 - PN을 목표; 이것은 우리가 선택적으로 PN을 차례로 버섯 기관에서 응답 (그림 6)를 생산할 수있는 ATP의 생각 응용 프로그램을 자극 할 수 있습니다.
상류 활성화 서열과 발광 생물 기자 (GFP - 쿼린) GFP의. (A) 도식과 쿼린 융합 유전자의 그림 1. 특징. 칼슘의 높은 수준에 대한 응답으로 쿼린에 의해 블루 발광의 (B) 모델. 칼슘의 높은 수준에 응답하여 GFP - 쿼린하여 녹색 발광의 (C) 모델 2+. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 실험은 피펫 팁에 위치. (A) 플라이를 설정합니다. (B) 적절한 접착 기술의 그림 머리를 안정화 및 비행 몸과 피펫 팁 사이의 영역을 밀봉. (C) 머리 캡슐을 열 해부의 개략도. (D) 삽입 관류 튜브 블록을 들고 1 ml의 실. 총 챔버 크기 : 길이 : 7.4 cm, 폭 : 2.7 cm, 높이 : 0.55 cm. 내부 챔버 크기 : 길이 : 1.7 cm, 폭 : 1.4 cm, 높이 : 0.35 cm, 챔버 구멍의 반경 : 0.1 cm. 매크로 블럭에 GFP - 긍정적 인 신호를 보여 플라이 헤드 (E)보기 : 표피의 제거 후 OK107 구동 GFP - 쿼린에서 파생 된 형광 낮은 희미한 불빛. 광자 카메라와 관류 시스템 (F) 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
버섯의 몸에 25 μm의 니코틴에 그림 3. 대표 응답. (A)의 형광 이미지GA2의 버섯 몸에서 GFP - 쿼린 표현 / +, OK107 / + 제어 플라이 뇌 (스케일 바 = 50 μm의). (B) 버섯 몸에 피크 발광 생물 응답. 자극하기 전 (C). 응답의 (D)를 시작합니다. (E) 피크 응답. (F)는 CCB 응답을 계속했다. (G) 떨어지는 CCB 응답. (H) 응답의 끝 (BH : 눈금 막대 = 33 μm의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
샘플 기록의 그림 4. 대표 분석 (A) (GA2)의 버섯 몸의 형광 이미지 / +;. OK107 / + 제어는 투자 수익 (ROI)의 CCB와 중간 엽 이상 선택 (스케일 바 네 비행R = 50 μm의). (B) 25 μM 니코틴으로 생물 발광 반응의 10 초 퇴적 - 100 msec의 기록 광자 응답. (C) 100 밀리 초에 기록 된 100 밀리미터의 KCl에 발광 생물 응답의 10 초 축적. 각각 오른쪽 CCB를 포함하는 투자 수익 (ROI)의 2, 4 내의 니코틴 반응시 방출되는 광자와 중간 엽의 기록 수의 (D) 그래프. 투자 수익 (ROI)의 2와 4는 각각 오른쪽 CCB와 중간 엽을 포함 내에서의 KCl 반응시 방출되는 광자의 기록 수의 (E) 그래프. 오른쪽 Y 축이 투자 수익 (ROI) 내에서 광자에 해당하는 동안 D와 E의 왼쪽 Y 축,보기의 전체 필드 내에서 광자의 총 수에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
샘플 녹음 그림 5. 대표 매개 변수 분석 (GA2) / +에서 버섯 신체의 니코틴 활성화에 발광 생물 응답의 대표 엑셀 분석;. OK107 / + 제어 비행. CCB와 중간 엽에서 시간이 지남에 따라 (A) 광자 응답. CCB와 중간 엽에서의 답변 (B) 기간. (C) CCB와 중간 엽 내에 응답 중 최고 광자 값 (최대 진폭). (D) CCB 및 전체 응답의 중간 엽 내 총 광자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
THR PN을 자극 후 버섯의 몸에 그림 6. 두 개의 서로 다른 반응깨닫지 못하고 있거나 남의 ATP와 P2X 2. 버섯 몸에 PN을하고 GFP - 쿼린 (GH146 / +에서 P2X (2)를 표현하는 샘플 1 플라이, P2X 2 / MB247-LEXA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (광고) (A) 투자 수익 (ROI)의 (규모와 버섯 기관의 형광 이미지입니다. 바 = 50 μm의) 주로 중간 엽에서 관찰 된 500 μM의 ATP로 자극 P2X (2)에 의해 PN을, 활성화 다음 버섯 기관의 피크 응답. (B) 발광 생물 이미지입니다. (C) 피크의 KCl 응답의 발광 생물 이미지입니다. (D 응답을 통해 투자 수익 (ROI) 지역 내에서 광자 방출의) 시간 코스, 샘플 버섯 기관에서의 PN 및 GFP - 쿼린 (GH146 / +에서 P2X (2)를 표현하는 2 플라이;. P2X 2 / MB247-LEXA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (EH ). (E) 투자 수익 (ROI)의 (스케일 바 = 50 μm의)와 형광 이미지입니다. (F) 다음 버섯 몸에 유도 응답의 발광 생물 이미지P2X (2)에 의해 PN이의 ctivation는 로브와 CCB 모두에서, 1mM의 ATP 자극. (G) 피크의 KCl 응답의 발광 생물 이미지입니다. 응답을 통해 투자 수익 (ROI) 지역 내에서 광자의 (H) 시간 코스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Cabrero 등의 알에보고 여기에 제시된 최근에 개발 된 생물 발광 기반 GFP - 쿼린 접근 방식은 신장 별 모양의 세포와 같은 세포의 다른 종류뿐만 아니라 원하는 것처럼, 다른 신경 세포에 칼슘 -activity의 생체 내 기능을 녹음 할 수 있습니다. 2013 년 5.
수정, 문제점 해결, 추가 구성 요소, 그리고 중요한 단계
초파리 축산
GFP - 쿼린 유전자 (pG5A) (4)는 3 개의 독립적 인 형질 전환 라인 (6)을 만들 pUAST 벡터에 삽입 하였다. 모든 라인들은 생물 발광 시험을하고, 모든 생체 내 칼슘 -activity 6에 응답 할 수 있었다. 그러나 최근의 실험은 세 번째 염색체에 삽입 GA2 라인 GA1 라인 삽입 O보다 더 강력한 신호를 발생하는 것이 지적N 번째 염색체. 여기서, 대표적인 결과는 MB 고유의 행 OK107 교차 - GA2가 UAS를 사용하여 얻을 수 있었다. 또한, 최근에 나 파이퍼는 20XUAS 조절 요소 (20X-G5A-2)의 제어 아래에 배치 GFP - 쿼린 구조가 생성되고이 구조는 우리의 실험실에서 검증되었습니다. 간단히, 따라서 더 효율적이고 더 같은 타원체 몸과 뇌의 깊은 구조의 칼슘 -activity을 모니터하는 것이 유용 할 수 있어야 우리의 표준 GA2,보다 강한 매우 강한 신호를 제공합니다. 또한, 이것은 또한 신경 축삭 또는 단자 (시냅스 연락처)에 소량의 촬상에 유용 할 수있다.
이미징을위한 준비
플라이는 얼음이 위치 및 부착 동안 마취해야하지만, 얼음에 시간을 최소화하는 것이 중요하다. 파리 냉장 페트리 접시로 이동되기 전에 유리 바이알에 옮기고, 2 분 동안 얼음에 보관해야피펫 팁에 위치합니다. 우리는 마취 오랜 기간이 샘플의 가능성을 감소시키고 반응을 감쇠시킬 수 있다는 것을 발견했다. 최적, 우리는 5 ~ 10 분 이하로 얼음 마취의 시간을 유지.
테이핑 및 접착 중요한 단계입니다. 이는 해부 및 이미징 대신에 플라이 머리를 고정뿐만 아니라, 피펫 팁으로 및 / 또는 상기 기록 챔버로부터 링거액의 누출을 방지하기 위해 중요하다. 치과 접착제 (그리고 조금 적게 실리콘 접착제에) 접착되고 이후 즉시 두 구성 요소가 결합되어 건조하기 시작합니다. 따라서 약한 결합과 접착제의 응집을 방지하기 위해 신속하게 접착제를 적용하는 것이 중요합니다. 어떤 경우에는 우리는 링거액과 접촉, 비행 및 응답에 영향을 미칠 수있는 링거액으로 오염 물질을 공개 할 수 있습니다 때, 테이프 및 접착제의 대체 품종을 발견했습니다 특히 실험을 t 전용 위해 이렇게그는 다른 냄새를 사용하여, 후각 시스템의 연구. (우리가 사용하는 특정 품종에 대한 자료 참조) 소재를 대체하는 경우 따라서, 여기에주의하십시오.
코 엘렌 테라 여러 가지 다른 형태와 같은, 발광 속도, 칼슘 - 친 화성 (감도), 또는 (12)의 발광 강도로서 그 활성을 최적화하기 위하여 개발되었다. 벤질 엘렌 테라 짧은 반감기 빠르고 높은 발광 결과 (또는 H-엘렌 테라 명명) 예를 들어, 네이티브 엘렌 테라은 몇 시간으로서 장기의 촬상하여보다 적합한, 더 안정적이다. 코 엘렌 테라의 다른 형태에 대한 자세한 내용은 재료 목록에서 웹 주소를 참조하십시오.
영상
생물 발광 신호가 전자 승산기 CCD 카메라로 감시 할 수있는 끼워 맞춤 현미경 (EM-CCD, -80 ºC로 냉각). 이 설정은 ㄴ합니다꽉 어두운 상자 안에 보관 전자는 원하지 않는 (주변) 등의 오염을 방지 할 수 있습니다. 이 논문에서 설명하는 설정은 400 X 400 μm의 (512 X 512 픽셀)의 시야를 허용하는 20X 침수 대물 렌즈를 사용합니다. 신호 대 잡음 비율을 개선하기 위해, 데이터가 0.100 초 적분 시간 (10 Hz로)로 취득하고, 2 × 2 비닝이 사용되었다 (1 화소 = 1.2 X 1.2 μm의). 데이터를 수집하고 저장하기 위해, 각각의 검출 된 광자가 할당 된 X, Y 좌표 및 시점. 500 및 600 nm 파장의 사이, EM-CCD 카메라 (자재 목록 정확한 설명 참조) 96 %의 양자 효율을 갖는다.
생체 기능적 뇌 영상에 대한 가장 중요한 파라미터 중 하나는 시간 해상도이다. 지금까지, 형광 기반의 칼슘 -imaging 같은 GCaMP 같은 기술과 카멜레온의 대부분은 약 4 헤르츠 (Hz, 250 밀리 초 / 프레임)의 시간 해상도를 제공합니다. 최근, 생물 발광 기반 GFP - 쿼린으로 우리는 라이스 할 수 있었다최대 100 밀리 초 / EMCCD 카메라 프레임, 심지어 전자 승수 ICDD 카메라 (10) 120 프레임 / 초 (8.3 밀리 초 / 프레임)에 최대 전자 획득 시간. 이 시간적 해상도에서 전기 생리 기법 (약 1 밀리 초의 범위)이 접근한다. 높은 시간 해상도가 시냅스 전달하고 자극 유도 활동에 전념 연구를위한 유익하고 중요한 두 반면, 칼슘에게 아직 필수 느린 2+ -kinetics 확장 또한 예를 들어, 신경 세포 내에서 세포 내 칼슘 -stores에서 칼슘 방출을 발생 (검토 : Berridge 등, 2003 년 13.). 역으로, 그들은 일반적으로 센서로부터 더 나은 칼슘 - 친 화성을 검출 할 것을 요구하면서이 후자의 경우, 느린 시간 해상도는 여전히 허용됩니다. 이 요구 사항은 후각 RECEPT의 축삭 터미널에서 세포 내 칼슘 -stores의 방출을 감지하는 GFP - 쿼린 달성되었습니다ORS 신경 7,8. 대안 적으로, 목적하는 실험 조건에 따라 느리게 수집 시간이 사용될 수있다. 예를 들어, 긴 O / N 녹음, 우리 인해 수집 데이터 포인트의 다수 (Minocci 등. 2013)에 2 초 통합 시간을 사용 하였다. 요컨대, 생물 발광 한 실용적 기능은 시간적 해상도가 쉽게 원하는 실험 조건에 따라 조절 될 수 있다는 것이다.
대안 챔버 (플라이 설치) 실험의 목적을 용이하게하기 위해 개발되어왔다. 예를 들어, 천연 냄새 자극에 기초하여 연구를 위해, 안테나 따라서 A. FIALA (14)에 의해 개발 된 것과 같은 방식은 (우리 Murmu 등. 2010 유사한 접근법을 사용)에 가장 적합한, 자유 유지되어야한다. 간략하게,이 방법에서, 플라이는 작은 구멍을 포함하는 플라스틱 커버 슬립에 접착되어 목에 minutien 핀 (접착) 닿는이다. 씰이 만들어집니다파리의 정수리 주위. 그 후, 링거의 강하는 헤드 상에 증착되고, 두부 캡슐 해부된다. 이러한 방식으로, 안테나 무료 보관하고 냄새를 감지 할 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 장기 기록 용, 플라이 필요한 일 (10)의 O / N 또는 심지어 몇 가능한 한 구속의 자유 유지되어야하고, 어떤 경우에 (예를 들어 공급 : 5 % 포도당에 담가 모세관 종이 해결책). 이러한 상황에서 FIALA의 접근 방식은 또한 푸른 피펫 팁 (스노클링 방법)의 방법보다 더 적합하다.
모든 약물은 외부 애플리케이션 6 방식 다중 밸브 중력 관류 시스템을 사용하여 제어 될 수있다. 흐름은 앞서 2 ml / 분의 흐름에 대한 각 기록 세션 보정 체적 관류 조절기를 사용하여 제어 될 수있다. 배수 장치는 연속적인 흐름을 허용하는 연동 펌프를 통해 챔버로부터 기록 / ml의 2 분의 속도로 액체를 추출한다.
에서때문에 약물 및 / 또는 사용하는 약물의 양의 비싼 비용 일부 조건은, 하나는 화합물의 소량을 적용하고 싶습니다. 따라서, 직접 욕보다는 관류 시스템으로 적용 할 필요가있다. 이 경우 셔터는 빛 오염을 방지하기 위해이 과정을 닫아야합니다.
분석 방법
당 초당 초당 카운트 또는 수는 모두 분석을위한 우리의 그룹에 의해 사용 된 좌표. 초당 수는 가장 잘 초당 카운트 반면 전체 구조에 밝은 응답에 적합하고 (투자 수익 (ROI)의 크기에 대한 응답의 정상화를 나타내는) 좌표 당은 세포의 작은 인구에 가장 적합하고 정확한입니다. 양자는 쉽게 분석 소프트웨어에서 선택 될 수있다.
생물 발광 방식을 사용하는 중요한 장점 중 하나는 획득 및 저장된 데이터를 (X, Y, t 파라미터되는 방법각) 광자를 방출. 사실, (일반적으로 TIFF 형식) 획득 한 전체 이미지로 표준 모드를 사용하는 다른 영상 기술은이 시스템으로, 우리는 동안 빛에 의해 활성화 된 경우에만 픽셀 좌표를 저장 만 적절하고 의미있는 신호를 취득하면서 (획득 시간 또는 시간 해상도에 해당하는) 시간의 미리 고정 된 시간. 결과적으로, 데이터의 저장은 저장 전체 이미지에 비해 실제로 "빛"이며, 그 결과,보다 쉽게 데이터를 분석 할 수있다. 데이터 분석을 위해, 우리가 원하는대로 축적 시간의 설정을 허용하는 관련 소프트웨어 (광자 뷰어)를 사용한다. 설득력 데이터를 제시하는 듯이어서 원하는 신호의 화상의 디스플레이가 조절 될 수있다. 평행 결과들이 획득 시간보다 동일한 해상도시 정량화된다.
의의 및 생물 발광 영상의 생물학적 응용 프로그램
생물 발광 칼슘 이미징 상술 한 형광 칼슘 이미징 기법의 세 가지 주요한 장점을 제공 같이 : (1) 뇌의 깊은 영역이 이미지화 될 수 있고, (2) 화상은 O / N과 같은 몇 시간으로서, 심지어 약간 더 긴 지속 시간 동안 연속적으로 발생할 수있다 이일까지의 경우, (3) 최근에는 높은 시간 해상도, 120 프레임 / 초 (8.3 밀리 초)까지. 생물 발광 방법의 주요 제한은 결과적으로 우리가 활성화 된 구조 나 신경 세포의 정확한 깊이 (Z-계획)을 결정하는 것을 허용하지 않습니다 공 초점 조명과의 호환성 때문입니다.
생물 발광 이미징 깊은 뇌 영역의 화상의 첫번째 장점은, 이전없이 종래와 타원체 체 (EB), 뇌의 중간에있는 깊은 구조 내의 높은 칼륨 유도 칼슘 응답의 촬상에 의해 2007 년에 증명되었다 전기 생리 또는 기능적 보고서 (6) (GABA의 -receptors의 차단)의 적용 다음 EB의 자발적인 칼슘 -activity의 기록은 (이다 :. 기저귀 등, 문서) 제출.
두 번째 이점, 더 이상 연속 시간 기록, 우리의 실험실에서 여러 연구에 이용되고있다. 악취 자극은 이전 연구 11,15,16 뇌 뉴런의 활성을 검사하기 위해 사용되었다. 장기 이미징을 사용하지만, 우리 연구소는 냄새에 후각 수용체 신경 세포 내에서 반응 속도에서 이전에보고되지 않은 변화를 보여줄 수있다. Murmu 등에 의한 제 공부. (2010) 짧은 악취 자극 (1-3 초)과 유사한 동역학 및 진폭에 적당한 차이를 발휘하면서, 이상 악취 자극 (5 초)뿐만 아니라 훨씬 더 큰 진폭을 발생하는 것으로 나타났다 반응 속도 / 구조체의 변화세포 내 칼슘의 저장에 기인 한 응답 URE. 후속 연구했다 5 분 간격으로 1 초 냄새 펄스의 5 연속 애플리케이션 적응 프로세스를 제안하는 응답의 진보적 감쇠되었다 5 초로 자극의 길이를 증가시키는, 그들 칼슘 응답을 변경하지 않았지만 그. 또한이 적응 현상은 이전에 확인 된 칼슘 저장 8 GABA 성 규제에 의해 개시 될 것처럼 보였다. 중요한 것은이 데이터는이 실험 조건에서, GFP - 애큐 오린의 칼슘 - 센서 감지 및 세포 내 칼슘 2 + -stores에서 방출 된 칼슘을 따를 수 있음을 증명한다. 우리가 실험실에서 추가 고유 한 연구는 버섯 몸 (10)에 기초 (자연) 뇌 전체 신경 세포와 교세포 인구의 활동뿐만 아니라 활동을 기록하는 생물 발광 영상 O / N을 사용했다. 이 기록은 개미의 놀라운 자발적인 활동을 보여ennal mechanosensory 및 모터 센터 (AMMC)과 더듬이 엽. 또한, 아교 세포에 예기치 않은 셀 자치 활동은 밤 내내 발생. 버섯 본체 내에서 연구는 모두 반점 활동이 독특한 봉우리, 짧은 하나 하나를 발견, 그 발생 빈도 10 세 변경할 오래.
우리 실험실에서 가장 최근의 연구에서, 우리는 보조 메모리에 연루 시그널링 분자의 조작의 효과를 조사하기 위해 생물 발광 이미징을 사용하는 방법과 그들이 버섯 체 (9) 내에서의 칼슘 반응에 영향을 미친다. 무지 렁과 황색의 큰 순무의 일종 30 년 이상 전에 확인되었다 캠프의 수준을 조절하는 것으로 알려져있다하지만 실제로, 셀룰러 및 생리 학적 메커니즘에 특히 칼슘 -response에 자신의 생체 내 효과는 아직 크게 알려지지 않은 남아있다. GFP - 쿼린 방식으로, 우리는 동시에 꽃받침을 모두 기록 할 수 (수지상 structur왔다ES) 세포 및 기관뿐만 아니라 로브 레벨에서 축색 돌기, 따라서 우리는 수준이 매우 복잡한 구조의 다른 구획의 대응 운동을 할 수 있도록 상관 관계.
가장 최근의 응용 프로그램은 우리가 모방에게 관심의 구조와 시냅스 인위적으로 활성화하는 신경 세포 집단을 통해 자연의 응답을 개발하고있다. 이를 위해 우리는 시냅스 전 뉴런에서 P2X 2 수용체, ATP에 응답하는 리간드 - 문이 양이온 채널을 표현하고 시냅스 후 뉴런의 인구에 GFP - 쿼린을 표현한다. 다른 신경 세포의 집단으로이 두 요소의 분리는 두 개의 별도의 발현 시스템을 필요로한다. 이를 위해 LEXA는 GFP - 애큐 오린이 만들어졌습니다 포함하는 구성. 우리는 버섯 몸에 UAS-P2X 2 GAL4-GH146을 사용하여 PN을하고 GFP - 쿼린의 부분 집합에 P2X 2 표명 한이 시스템과의 예비 실험에서LEXA-13X-GFP - 애큐 오린과 함께 LEXA MB247 줄을 사용. 우리는 성공적으로 PN이의 P2X 2 수용체 (그림 6)에 1 mM의 ATP의 자극과 버섯 몸에 칼슘 응답을 기록했다.
결론적으로, 생물 발광의 GFP - 쿼린 접근 방식은 다른 칼슘 -indicators에 칼슘과 유사 2+ -activity을 유도 자극 기록에 유용한 것으로 입증되었습니다. 그러나 더 중요하게는, 이는 또한 뇌 내의 자연의 Ca 2+ -activity 검출을 허용한다. 이 접근법은 뇌 내의 생리 현상과 활동 패턴에 대한 이해의 깊이를 증가시킬 수 장기 실험 전체 뇌 영상에 대한 미래의 가능성을 연다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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