Summary
Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.
Abstract
In vivo görüntüleme Fonksiyonel fonksiyonu ve beyin hücreleri ve ilgi yapıların fizyolojisi incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. En son ışıldar haberci GFP Aequorini (GA) kullanılarak -imaging Ca 2 yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kofaktörü koelenterazin ilavesi ile - - foton toplayıcı ile izlenebilir parlak ışık yayan Bu yeni teknik kalsiyum bağlanması ve bir moleküldür üreten GFP ve aequorin genlerin füzyonu kullanır. GFP-aequorin geni taşıyan transjenik çizgiler fareler ve Drosophila hem de üretilmiştir. Drosophila olarak, GFP-aequorin geni beyin içinde hedeflenen ifade ve görüntüleme için izin GAL4 / UAS ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında yerleştirilmiştir. Bu yöntem, daha sonra tespit etme kabiliyetine sahip olduğu gösterilmiştir hem Ca içeri 2 + -transients ve Ca +2, iç depolardan -released. En önemlisi de sürekli kayıt, beynin içinde büyük derinliklerde görüntüleme daha büyük bir süre için izin verir, ve (8.3 milisaniye kadar) yüksek temporal çözünürlükte kayıt. Burada kayıt ve Ca mantar organları içinde 2+ -Aktiflik, sinek beyinde öğrenme ve hafıza merkezi bir yapı analiz etmek bioluminescent görüntüleme kullanılarak temel yöntem mevcut.
Introduction
Temel desenlendirme ve beyin ve ayrık yapı içinde faaliyet işlevi uzun nörobilim alanındaki yoğun bir çalışma alanı olmuştur. Belki de bu sorunu gidermek için kullanılan en eski başarılı yaklaşımların bazı elektrik aktivitesindeki değişikliğin doğrudan fizyolojik ölçümü vardı - ek yetenekleri getirdi (aktivite için proxy olarak) gerilim, pH veya kalsiyum konsantrasyonları değişikliklerin canlı görüntüleme izin ancak alternatif yöntemler nöronal aktivitenin 1 çalışma. Görüntüleme teknikleri, azaltılmış invaziv ve bütün beyin yapıları içinde etkinliğini izlemek için yeteneği gibi avantajları geniş bir yelpazeye taşırlar. Ayrıca meyve gibi uysal genetik hayvanlarda Drosophila gibi cameleon, GCaMPs ve diğerleri gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, gelişimini sinek 1 tek nöronlar, nöronal nüfus ve tüm beyni izlemek için araştırmacılar izinyapıları. Daha geleneksel floresan kalsiyum görüntüleme yöntemleri (kalmodulin kaynaştırılmış CFP ve YFP) (kalmodulin erimiş GFP) ya da FRET GCaMPs kullanırken iyi mekansal ve zamansal çözünürlük sağlayan kullanışlı teknikler olduklarını kanıtladılar, ışık uyarma altında yatan sürecinin deneysel bazı sınırlamalar doğurur uygulamaları. Nedeniyle sonuç görüntülü olabilir yapıların derinliğini sınırlar kaçınılmaz üretilen hafif uyarma, otofloresansı, fotoğraf ağartma ve fototoksisite doğası için, kayıtların süresi yanı sıra kayıt gerçek zamanlı süreklilik. Diğer bir deyişle, kayıtlar genellikle bu istenmeyen yan etkileri önlemek için aralıklı olarak gerçekleştirilmelidir.
Çünkü bu zorlukların, kalsiyum görüntüleme ek alternatif yöntemler geliştirilmiştir. En umut verici yöntemlerden biri kalsiyum bağlama sonra enzimatik reaksiyon ile üretilen ışık dayanır biyoluminesen görüntüleme vardır. Bioluminescent görüntüleme geleneksel kalsiyum görüntüleme aynı zorluklar yaşamaya değil dolayısıyla hafif uyarma gerektirmez ve etmez. Bio-ışıldar haberci Aequorin - Aequorea victoria izole λ (GFP da isolated- edildiği aynı Jellyfish üç EF ayak yapılarının ile kalsiyum bağlanır ve kofaktörü koelenterazin oksidasyonu ve mavi ışık serbest bırakılmasına yol açacak bir konformasyonal değişiklik geçirmektedir = 469 nm) 2,3. Aequorin çok az arka plan gürültü üreten ve hücre içi kalsiyum tamponlama sistemi 4 ile karışmaz çünkü geçici kalsiyum kontrolü için ideal hale getirir, kalsiyum (Kd = 10 uM) için çok düşük bir çekicilikleri vardır. Aequorin önce Xenopus yumurta 5 üretilen ışık nöral indüksiyon sürecini izlemek için kullanılır olmasına rağmen nöronal aktivitenin gerçek zamanlı görüntüleme için kullanmak için çok loş. Bu meydan okuma, Philippe Br & gidermek için bir çaba içinde251., Pasteur Enstitüsü'nde izin ve arkadaşları denizanası 4 içinde yerli devlet taklit, GFP füzyon ve genleri Aequorin bir genetik yapının yarattı. Bu füzyon gen ürünü GFP olmayan radyatif enerjiyi aktaran koelenterazin, oksidasyonu için önde gelen bir yapısal değişikliğe uğrar aequorin üç EF eli yapıları, üzerinden tekrar kalsiyumu bağlar. Yerine aequorin mavi ışık GFP yeşil ışık (λ = 509 nm) sürümünde bu enerji transfer sonuçları. GFP ve aequorin füzyon aynı zamanda tek başına 4 Aequorin daha 19 65 kat daha parlak füzyon proteini üretmek ışık yardımcı büyük protein stabilitesini bahşeder. Beynin içinde bir biyolüminesens yaklaşımı kullanarak sürekli kayıt süresi ve kaydedilebilir beyin içindeki yapıların sayısı bakımından hem de kalsiyum görüntüleme mevcut deneysel uygulama genişletir. Geniş önceki çalışmaları bağlamında bu hem küresel hem de daha büyük bir anlamıBeynin bölgeselleştirilmiş "etkinliği" çeşitliliği (kalsiyum transientler proxy üzerinden) izlenebilir. Daha da önemlisi aktivite kolaylıkla beyinde bazal fonksiyon tam bir anlayış peşinde kendisini ödünç bir gerçek zamanlı ve sürekli olarak, içinde, daha uzun süre izlenebilir.
Son birkaç yıl içinde, laboratuar ve diğerleri, ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında GFP-Aequorini (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6 ifade eden transgenik sinekler geliştirdik. Biz doğrudan nikotinik uygulama 9 ile asetilkolin reseptör stimülasyonu aşağıdaki mantar organları Ca 2+ -Aktiflik modüle gibi kokusu 7,8 gibi doğal uyaranlara yanı sıra çalışılan hücresel bileşenleri tarafından üretilen kayıt faaliyetine GFP-aequorin biyoparlaklık kullandık. Buna ek olarak, biz de uzun vadeli gibi önceden ele alınması mümkün olmamıştır deneysel sorular, bir dizi adrese GFP-Aequorini kullanmışSpontan kalsiyum geçici ve derin beyin yapıları 10 görselleştirme görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, biz memeli ATP reseptör P2X 2 11 projeksiyon nöronlarının bir katyon kanalı, (PNS) ifade GAL4 / UAS sistemi kullanılmaktadır ve (MB247-LeXA mantar organları GFP-Aequorini ifade etmek LeXA sistemini kullandık, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. Pfeiffer, Janelia Çiftliği, ABD) bir nezaket. Bu bize böyle bir koku uyarana karşı tepki olarak daha doğal koşullar, taklit, sırayla mantar organları (PNS bir aşağı hedef) aktive ATP, uygulanmasıyla Fiziksel Durum etkinleştirmek için izin verdi. Genel olarak bu P2X 2 birleştirerek tekniği ve GFP-aequorin deneysel olanakları genişletir. Geniş farklı uyaranlar ve tedirginlikler faaliyet bazal desenlendirme değiştirebilir nasıl yeni çalışmaları başlatarak, daha beyindeki aktivite kalıplarını anlamak için bir fırsat sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Numunelerin hazırlanması 1.
- Çözeltilerinin hazırlanması ve kurmak
- Standart Gıda ortamında 24 ° C'de tüm Drosophila melanogaster hatlarını korumak. Arka ve şişede düşük yoğunluklu onları tutmak standart boyut ve sinekler ağırlığını oluşturmak için.
- Bir şişede 10 erkek ile 10 kadın bakire ekleyin, onları dostum izin ve taze bir şişeye 2 günde aktarabilirsiniz. Sinekler Eclose başladığında Sonra 10 gün sonra, her gün sinekleri hasat. Sineklerin yaşı kesin kaydını tutun ve iyi durumda tutmak.
- 3. günde, kadınlarda gelen erkek ve dişiler ayrı flakon başına 20 sinekler tutmak. 4 ya da 5 gün eski at sinekleri kaydedin.
- Aşağıdaki konsantrasyonları ile Ringer çözeltisi hazırlayın: 130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES ve 36 mM sukroz ve hassas 7.3 çözeltinin pH'ının ayarlanması. 25 mikron perfüzyon çözümleri hazırlayın; Ringer çözeltisi içinde M nikotin ve 100 mM KCI.
- Bir eğim ile (ucunun ucundan yaklaşık 35 °) bir jilet şekli ucunu kullanarak ve bahşiş 1 ½ santimetre ötesinde fazla baz kaldırın: 1000 ul pipet hazırlayın.
- İnkübasyon süresince numune saklama için kutu (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) hazırlayın. Bunların hazırlanması tamamlandıktan olarak örnekleri yerleştirmek için küçük bir raf aparatı altında [örnek kuruma önlemek için] alt suyla doymuş iki sünger (12 cm x 8 cm x 3 cm) yerleştirin.
- GFP-aequorin sentezlenmesini tahrik etmek için bir GAL4 hattının UAS-GFP-aequorin en az 1 kopyasını ve bir kopyasını ihtiva eden ve böylece sinek örnekleri hazırlayın. OK107 Gal4 hattı (öncelikle mantar organları bir çizgi sürüş ifadesi) Bu hazırlık UAS-GFP-aequorin ile çarpı işareti vardır.
Not: kutusunun içinde su geçirmez olmalıdır ve dış inkübasyon sırasında koelenterazin bozulmasını önlemek için kutuyu girmesini ışık engellemelidir.
- Standart Gıda ortamında 24 ° C'de tüm Drosophila melanogaster hatlarını korumak. Arka ve şişede düşük yoğunluklu onları tutmak standart boyut ve sinekler ağırlığını oluşturmak için.
- HazırlıkNumunelerin preparasyonu
- Buz bir cam şişeye aktararak Drosophila uyutmak ve pipet konumlandırma için soğutulmuş Petri kabı taşındı önce 2 dakika süreyle buz üzerinde tutmak. Diseksiyon mikroskobu altında buz üzerinde 100 mi Petri kabındaki hafif nemli filtre kağıdı üzerinde pipet uçları hazırlayın.
- Yavaşça forseps yer pipet içine sinek.
- Hafifçe bastırın ve baş ucu kenarı geçmiş tamamen ve dorsal bölge kısmen uç şekillendirme (Şekil 2B) sırasında çıkarılan bölüm maruz şekilde sinek hizalamak bir fırça kullanma.
- Diş tutkal iki bileşenin, küçük (yaklaşık 3-4 | il) kısımları birleştirin. Pipetlemeyin ucu kenarına ve çevresinde geri aşağı baş ve boyun ön etrafında dikkatli tutkal sürün ve - baş tacı kaçınarak. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin.
- Kayıt odasının (Şekil 2D) ve gen delikten yapıştırılmış sinek ile yerleştirin pipettly yerine sabitlemek için düğmesine basın.
- Silikon yapıştırıcı (yaklaşık 3-4 ul) iki bileşeni birleştirin. Bölme ve pipet ucu buluştuğu Ringer solüsyonu sızıntısı önlemek için kenarı boyunca odasının düz tarafında tutkal sürün. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin.
- Teşrih
- Perfüzyon kanalı, kısa kenarı boyunca bandı yapıştırın ve odasının arkasına kadar uzanan.
- Floresan lamba mikroskop altında sırayla diseksiyonu blokta sinek odasına yerleştirin. Odasına Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi.
- Manikür kaldırmak için ince bir cerrahi bıçak kullanın. Antennal bölgeye başın arka paralel kesiler olun. Sonra sonra önceki kesiler bağlayan anten üzerinde dik bir kesi yapmak gözün kenarında kesti. Başın arka kısmında olduğu için son bir kesi paralel yapın. Manikür (Şekil 2C) kaldırmak için ince sivri forseps kullanın.
- Yavaşça bir kavramak ince keskin forseps kullanınBeyin ve [floresanlama] mantar vücut açıkça görülünceye kadar uzak solunum doku maruz temizleyebildiğini d.
- Dikkatle kavramak ve koelenterazin nüfuz sağlamak için beyini çevreleyen nöroepitelyal doku çimdik ultra keskin forseps kullanın.
Not: Alternatif olarak papain neuroepithelia 9 geçirgenliği için kullanılabilir. - Bir pipet kullanarak, karanlık kutu içinde diseksiyon ve yer örneğinden herhangi enkaz kaldırmak için Ringer solüsyonu ile iki kez yıkayın.
- Odasına 5 uM benzil-koelenterazin içeren Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi. 2 saatlik bir en az oda sıcaklığında koelenterazin inkübasyon kutusunu kapatmak ve izin verir.
2. Görüntüleme
- Kurmak
- Kayıt sistemini başlatın: 25 ° C mikroskop, bilgisayar, kamera ve drenaj sistemi ve set odaya çevre denetimleri açın.
- Açık Ölçme ve bilgisayardaki Otomasyon Explorer programı. Tıkla “ Aygıtlar ve Arayüzler NI Hareket Cihazlar ", ardından çift tıklayın" "ve nihayet sağ tıklayıp" PCI-7334 "ve" aygıt başlatılamadı ".
- Foton Imager açın. Yeni bir klasör ve adını ilk kayıt dosyası oluşturun. Sistem çalışabilmesi Kamera -80 ° C ulaşmalıdır.
- Set up perfüzyon sistemi - rezervuar için KCl, nikotin ve Ringer çözeltisi ekleyip 2 ml / dak yani her çözüm deşarjları ayarlayın. Deney başlamadan önce Ringer solüsyonu ile yıkayın.
- Örnek hazırlayın
- Yer görüntüleme 5X büyütmede mikroskop altında montaj blok çanak montajı ve delinme yoluyla kanala perfüzyon tüpü yerleştirin.
- Floresan moduna ayarlı mikroskop sonra merkezi ve odak noktası haline mantar organları (MB) getir. 20X ve yeniden merkezi ve odak ayarlayın.
- Ucu böylece drenaj havuz üzerinde Pozisyon drenaj cihazı, sadece Abov drenaj şant yüksekliğini ayarlamake havuzu ve yeterli drenajı sağlamak için 30 sn Ringer çözeltisi çalıştırın.
- Işıktan aparatı kapatmak için kalkan aşağı çekin. Foton kamera otomatik odaklama sistemi kullanılarak ince ayarlamalar yapmak ve MBs bir referans floresan görüntü almak.
- Kayıt
- İstenen kayıt hızı (50 milisaniye kadar 1 sn veya daha fazla) için foton hızını ayarlayın. Seçin foton modu ve açık deklanşör. Günlük girişlerini rekor genotip, cinsiyet, yaş ve örneklem sayısı. YG kutuları tıklayarak ve kontrol tutarken sürükleyerek pozisyon ROI çanak ve hücre gövdeleri (CCB) üzerinden kutuları ve medial loblar ayarlayın.
- (Arzu edildiği kadar) yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca kayıt taban.
- 1 dakika süre ile nikotin uygulanır. Günlüğünde start / stop edin. 5 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır.
- Kurtarma için 5 dakika bekleyin ve KCl günlük girişini ve zamanlayıcı hazırlar.
- 1 dakika için KCl uygulayın. Günlüğünde start / stop edin. 1 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır.
- Şalterfloresan moda, son floresan görüntü almak ve Ringer çözeltisi kapatın.
- Basın "Dur". İletişim kutusu sistemi kapatmak isteyecektir. "Hayır" kayda devam etmek seçin.
- Açık kalkan, hareket drenaj sistemi, 5X geçiş lens objektif, perfüzyon tüpü çıkarın. , Sahneden örnek / kayıt çanak çıkarın durulama ve su ile iki kez merceği silerek 20X lensi temizlemek.
- Bir sonraki kayıt başlatmak için program penceresinin üst kısmında beyaz play butonuna basın.
3. Analiz ve Video Oluşturma
- Foton değerleri ayıklamak
- Foton analizi programını açın (örneğin, Foton Görüntüleyici) ve açık ilk örnek tablo dosya.
- Ekran kontrol sekmesini seçin. Kontrol tutarken bölgeye tıklayarak ROI seçin. GFP ışıklı CCB ve medial lobları kapsayacak şekilde ilgi bölgelerin büyüklüğü, yönünü ve şeklini ayarlayın.
- Bir ek eklemeve tıklayarak "yatırım getirisi Define" linkine tıklayarak ve yeni yatırım getirisi oluşturmak için ekrandaki sürükleyerek al ROI.
- Foton videoyu oynatmak için "Film" sekmesini seçin. Istediğiniz gibi "sn genişliği" ve "sn adımları" ayarlayın. YG yerleştirme gerektikçe yeniden ayarlayın.
- GFP floresan, nikotin tepki ve KCl tepki temsili ekran görüntüleri seçin. Daha sonra analiz ve karşılaştırma için bir sunum slayt içine Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü.
- "Sn genişliği" ve saniyeler içinde kayıt hızı "sn adım" hem de ayarlayın. Uyarıcı başlamadan önce ve hemen tepki bittikten sonra dirsek bölgeye üst paneldeki gri işaretçileri hareket ettirerek analiz uzunluğunu seçin.
- "> OYUN" basın "<< REW" basın "oynarken görüşlerini Askıya" i seçin. "Puan tablosu Count" ve istenen ve çizgi renkleri ROI rengine uyacak şekilde ayarlayın birimleri sekmesini seçin.
- Analiz bittiğindeBasın "İhracat Oranı Verileri Kont". Kombine kayıtlar CCB ve her taraftan ilgi medial lob bölgenin seçin ekran görüntüleri. Cevap görüntüleri ile slayt halinde Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü. Bu kaydırma, daha sonra son tahlilde kullanılır.
- Örnek Analizi: detaylı ekstre foton verilerin analizinde bir yöntemdir
- "Puan Exports Count" klasöründeki elektronik tablo dosyalarını açın.
- Hücreleri saat ve dakika zaman görüntülemek için ilk sütun etiketli zaman biçimlendirin.
- Numune için ilgili slayt Referans. Zaman ve iki temsilci ROI için sütunları hariç tüm değerleri kaldırın.
- Nikotin stimülasyon başlangıç zamanını belirleme - ana günlük girdisi dosyasında mevcuttur başlatmak veya vurgulamak değeri öncesinde ek verileri kaldırmak klasör-.
- CCB ve medial lob ve işareti / vurgulamak hem de yüksek / tepe değerini bulun.
- Hem tepki başlangıç ve bitiş zamanını belirlemekGeçen süre noktasını kullanarak bir tahmin oluşturarak CCB ve medial lob slayt yanıtı grafikle ve bu noktalara yakınlık değerleri değişiklikten gerçek değer seçmek değinilecektir. CCB ve medial lob hem de bu noktalar arasındaki bölgeyi vurgulayın. Alternatif olarak, 9 makro kullanın.
- Yeni tablo üzerinde bir deney grubundan tüm örnekleri birleştirin.
- Sıra değerini belirleyerek tepe üzerinde hizalayın her CCB tepe değerine içindir. Bu örnek verileri recopied gereken yaklaşık satır değerini belirlemek için en yüksek satır değeri düşük değerler çıkarma. Tüm tepe değerleri hizalanmış olduğundan emin olun.
- Bilanço kez kopyalayın ve medial lob sütunları veya tek CCB veya medial lob değerleri sayfaları oluşturma CCB sütunları ya silin.
- Tüm CCB yanıtları bittikten sonra verileri kaldırın. Dört satır Toplam fotonlar, Tepki Süresi (süre), Tepe Genlik ve Tepki Gecikme etiketli oluşturun. Kopyala ve orijinal altında yine bu yapıştırın.
- Yanıt sırasında toplam fotonları belirlemek için TOPLA işlevini kullanın. Yanıtın uzunluğunu belirlemek için COUNT işlevini kullanın. Kopyala ve tepe genlik değerini belirlemek için en yüksek değer hücresini bağlamak. COUNT işlevini kullanın - cevap başlangıcına nikotin perfüzyon başından itibaren seçin - Tepki Gecikme belirlemek için.
- Saniye hızını kaydederek (bütün tepe genliği hariç) çarpın bağlantı işlevini kullanarak ve kopyalama değerleri.
- Yani (örn .: Şekil 5B, C, D) istenirse Bar / kutu grafikleri gibi toplam Fotonlar, Tepe Genlik ve Tepki Süresi olarak hesaplanan parametreler için oluşturulabilir.
- Ham veri foton cevaptan sonra sütununda, ortalama fonksiyonunu kullanarak her zaman noktası için ham veri noktaları ortalama. Ortalama (SEM) standart hatasını belirlemek kolon istenen takip bir zaman noktasında ortalama foton değerleri için ise.
- Ortalama bir tepki profile oluşturmak için ortalama sütunu kullanınCCB örneklem grubu için e [Grafik]. Bu x-ekseni değerleri olarak saatini belirterek sütun ve y-ekseni olarak ortalama foton değerleri sütunu seçin ve son olarak saçılım grafiği oluşturma aracını seçin yapmak için.
- Medial lob verilerle bu analiz işlemi tekrarlayın.
- Video için Görüntüleri oluşturma
- Açık foton görüntüleyici.
- Seç ekran kontrol sekmesi. Seçmek kaldırmak ve / veya en aza indirmek için kontrol tutarken ROI tıklayın.
- "Sn genişliği" her çerçevenin içeriğini belirlemek için arzu edildiği gibi (birikim süresi) değiştirin.
- Her çerçevenin üst üste tanımlamak için "sn adım" değiştirin.
- Basın "<< REW" ardından "oynarken ihracat görüşlerini" "OYUN>" seçeneğini seçin. Video için görüntüleri .png dosyaları bir dizi olarak "görünümü ihracatı" klasörüne ihraç edilecek.
- Video c için bir yöntem: Sanal Dub kullanarak video yapmakDetaylı reaksiyonundan
- Görüntüleri içeren görünüm ihracat klasöründeki "Resultats" adlı yeni bir klasör oluşturun.
- Görüntülerin klasörünün içine komut (renommer.VBS) getirin.
- Renommer.VBS çift tıklayın çalıştırmak için.
- Görüntüler otomatik olarak sayısal olarak yeniden adlandırıldı ve "Resultats" klasörüne kopyalanacaktır.
- Açık VirtualDub.exe.
- Açık bir video dosyasını seçin - (sonraki görüntüler otomatik olarak yükleyecektir) ilk resmi seçin.
- Seç videosu - istediğiniz gibi belirleyin kare hızı ayarlayın.
- Video seçin - Seçilen sıkıştırma yarıçapı Cinepak Codec seçin.
- Dosyasında video otomatik olarak oluşturulur AVI olarak kaydet seçeneğini seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aequorin için GFP füzyon bize mikroskobu (Şekil 3A, 4A, 6A, 6E) üzerinde floresan modunda GFP uyarma yoluyla önce biyolüminesans görüntüleme ilgi bölgemize görüntülemenizi sağlar. Mantar organları uyarmak için en basit yollarından birisi, iyonotropik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla. Asetilkolin Bu, alıcının endogen liganddır, ancak biz, nikotin mantar organlarında daha çoğaltılabilir bir yanıt ürettiği bulunmuştur. Onlar özellikle nikotinik asetilkolin reseptörlerini ifade ve böylece nikotin kullanarak biz başka bir yerde beyinde ifade muskarinik asetilkolin reseptörlerinin aktivasyonu önleyebilirsiniz çünkü bu bölümünde yer almaktadır. Ayrıca, nikotin asetilkolin daha stabildir, ve böylece daha iyi ve daha güvenilir bir teşvik kontrol edilmesini sağlar. Tipik bir yanıt (bakınız Şekil 4 çanak, hücre kütleleri (CCB) ve medial lob (ML), hem hızlı aktivasyonu ile başlatılırEtiketli görüntü için A). Genel olarak CCB yanıtı daha uzun sürer ve tepki ardışık panellerinde gösterildiği gibi loblar daha büyük bir biyolojik olarak ışık veren bir tepki gösterir (Şekil 3C-H). Şekil 4B, 100 ms bir zamansal çözünürlükte kaydedilmiştir foton 10 sn birikimi (10 göstermektedir 25 uM nikotin 1 dakika perfüzyon yanıt zirve sırasında Hz). Bizim örnek canlılığı teyit sağlar 100 mM KCI, 1 dakika perfüzyon bir ikinci uyarma başlatılır 10 dakika (Şekil 4C, D) içindeki bir yıkama ve geri kazanma periyodunu takiben. Kantitatif yanıtlar foton izleyicide analiz sırasında yatırım getirisi seçerek analiz edilebilir. Foton izleyicide analizi Koşu bu değerlerin hem zaman (Şekil 4D ve E) üzerinden seçilen ROI içinde fotonların sayısını gösteren grafikler yanı sıra ihraç elektronik tablolar üretir. Şekil 4D bir examp olduğunule ROI 2 [yeşil] yayılan fotonlar komplo foton görüntüleyici (sağ CCB) ve YG 4 [mavi] (sağ medial lob) tarafından üretilen grafikler. Şekil 4E'de gösterilen KCI tepkisi için benzer veriler. Verilen veriler yanıt (Şekil 5A) eğrisini yeniden yanı sıra süresi, tepe genliği ve tam cevap (Şekil 5B-D) gibi çeşitli parametreleri hakkında ek veri elde etmek için de kullanılabilir. Son zamanlarda biz daha doğal tepkilerinden bir yöntem geliştirdiler Gal4 UAS ve LexA sistemlerini kullanarak. Kısaca, ATP-bağımlı P2X 2 katyon kanalı (PNS) projeksiyon nöronlarının olarak ifade edilir ve GFP-aequorin (GA) mantar gövdeleri olarak ifade edilir - PNS bir hedef; Bu bizi seçici Fiziksel Durum sırayla, mantar organları tepki (Şekil 6) üretebilir ATP rağmen uygulama, heyecanlandırmak için izin verir.
Yukarı aktivasyon dizisi ile Bioluminescent Muhabirleri (GFP-aequorin) GFP. (A) Şematik ve aequorin füzyon geninin Şekil 1. özellikleri. Ca + 2, yüksek düzeylerine yanıt olarak Aequorin mavi ışık yayılmasının (B) Modeli. Ca yüksek düzeyde yanıt GFP-aequorin yeşil ışık emisyon (C) Model 2+. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Deneysel pipet ucu konumlandırılmış. (A) Fly kurdu. (B) yeterli yapıştırma tekniğinin bir örneği kafasını stabilize ve sinek beden ve pipet ucu arasındaki bölgeyi sızdırmazlık. (C) Baş kapsülü açmak için diseksiyon şematik. (D) takılı perfüzyon tüp ile blok tutan 1 ml odası. Toplam kamara ölçüleri: uzunluk: 7.4 cm, genişliği: 2.7 cm, yükseklik: 0,55 cm. İç bölme boyutları: uzunluk: 1.7 cm, genişliği: 1.4 cm, yükseklik: 0.35 cm, ve oda deliğin yarıçapı: 0.1 cm. MBs GFP pozitif sinyali gösteren sinek başının (E) Görünüm: manikür çıkarıldıktan sonra OK107 odaklı GFP-aequorin türetilen floresan ile düşük loş ışıkta. Foton kamera ve perfüzyon sistemi ile (F) Mikroskop. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mantar organları 25 mcM nikotin Şekil 3. Temsilcisi yanıt. (A) Floresan görüntüGA2 mantar organları GFP-aequorin ifade / +; OK107 / + kontrol sinek beyin (ölçek çubuğu = 50 um). (B) mantar organları Tepe bioluminescent yanıt. Uyarılmaya önce (C). Yanıtın (D) Başlangıç. (E) Tepe yanıtı. (F) CCB yanıtını devam etti. (G) Falling CCB yanıtı. (H) yanıt Sonu (BH: ölçek çubuğu = 33 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Numune kayıt Şekil 4. Temsilcisi analizi (A) GA2 mantar gövdesinin Floresan görüntü / +;. OK107 / + kontrol ROI CCB ve medial lob üzerinde seçilen (ölçek ba dört ile uçmakr = 50 um). (B) 25 uM nikotin için bioluminescent yanıt 10 sn birikimi - 100 milisaniye kaydedilen foton tepki. (C) 100 milisaniye kaydedilmiş 100 mM KCl ile bioluminescent yanıt 10 sn birikimi. Sırasıyla sağ CCB kapsayan ROI 2 ve 4 içinde nikotin yanıtı sırasında fotonların ve medial lob kaydedilen sayısının (D) Grafik. ROI 2 ve 4 sırasıyla sağ CCB ve medial lobu kapsayan içinde KCl yanıtı sırasında fotonların kaydedilen sayısının (E) Grafik. Sağ Y ekseni ROI içinde fotonlar tekabül ederken, d ve e, sol Y ekseni, görüş tüm alanı içinde fotonların toplam sayısına karşılık gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Numune kayıt Şekil 5. Temsilcisi parametreler analiz GA2 / + mantar vücudun nikotinik aktivasyonuna bioluminescent yanıt Temsilcisi excel analizi;. OK107 / + kontrol sinek. CCB ve medial loblarda zamanla (A) Foton cevabı. CCB ve medial loblarda yanıtların (B) Süre. (C) CCB ve medial lob içinde yanıt sırasında en yüksek foton değeri (maksimum genlik). (D) CCB ve tüm yanıtın medial lob içinde toplam fotonlar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Thr PNS uyarılmasından sonra mantar organlarında Şekil 6. İki farklı tepkiough ATP ve P2X 2. Mantar organlarında PNS ve GFP-aequorin (GH146 / + içinde P2X 2 ifade eden Örnek 1 sinek, P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (reklam) (A) ROI (ölçek ile mantar organlarının Floresan görüntü. bar = 50 um) öncelikle medial loblarda görülen 500 uM ATP ile uyarılmış P2X 2 ile PNS, aktivasyonu takip mantar organlarında zirve tepkisinin. (B) Bioluminescent görüntü. (C) zirve KCI tepkisinin Bioluminescent görüntüsü. (D yanıt boyunca ROI bölgeleri içinde foton emisyon) Saat kursu, örnek mantar organlarında PNS ve GFP-aequorin (GH146 / + içinde P2X 2 ifade eden 2 sinek;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh ). (E) ROI (ölçek bar = 50 um) ile floresan görüntü. (F) Aşağıdaki mantar organlarında uyarılan tepkinin Bioluminescent görüntüP2X 2 tarafından PNS ctivation lob ve CCB hem de, 1 mM ATP ile uyarılır. (G) zirve KCI tepkisinin Bioluminescent görüntü. Yanıt boyunca ROI bölgeleri içinde foton emisyon, (H) Saat kursu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cabrero ve ark belirtildiği gibi burada sunulan yeni geliştirilmiş biyolojik olarak ışık veren bazlı GFP aequorin bir yaklaşım, böbrek stellat hücreleri gibi diğer hücre tür, hem de istenirse gibi farklı nöronlarında Ca 2 + -Aktiflik in vivo fonksiyonel bir kayıt sağlar. 2013 5.
Değişiklikler, sorun çekim, ek bileşenler ve kritik adımlar
Drosophila Yetiştiriciliği
GFP-aequorin transgen (pG5A) 4 üç bağımsız transformant çizgileri 6 oluşturmak için pUAST vektörüne sokulmuştur. Tüm hatlar onların biyolüminesans için test edildi ve tüm in vivo Ca 2 + -etkinlik 6 yanıt başardık. Ancak daha yeni deneyler, üçüncü kromozom üzerinde takılı GA2 hat GA1 hattı takılı o daha sağlam sinyali oluşturur dikkat çekmişlerdirn ikinci kromozom. Burada temsili sonuçlar MB özel hat OK107 ile geçti-GA2 UAS kullanılarak elde edilmiştir. Ayrıca, son zamanlarda B. Pfeiffer 20XUAS düzenleyici element (20X-G5A-2) kontrolü altında yerleştirilmiş olan bir GFP aequorin yapı oluşturulur ve bu yapı, laboratuarımızda doğrulanmıştır. Kısaca, bu nedenle daha verimli ve daha fazla bu tür elips-vücut olarak beynin derin yapılar, Ca 2+ -Aktiflik izlemek için yararlı olmalıdır standart GA2, daha güçlü, çok güçlü bir sinyal verir. Ayrıca, aynı zamanda nöronların ve akson terminalleri (sinaptik iletişim) küçük miktarlarda görüntülenmesi için yararlı olabilir.
Görüntüleme için hazırlıklar
Uçucu buz konumlandırma ve yapıştırma esnasında anestezi olması gerekir, ancak, bu, buz üzerinde zamanı en aza indirmek için önemlidir. Sinekler soğutulmuş Petri kabı taşınmadan önce, bir cam şişeye aktarıldı ve 2 dakika süreyle buz üzerinde tutulmalıdırpipet konumlandırma için. Biz anestezi uzun süre numune canlılığını azaltır ve yanıtı azaltabilir fark etmişsinizdir. Optimal, biz 5-10 dakika altında buz anestezi zaman tutmak.
Bantlama ve yapıştırma kritik adımlar vardır. Bu diseksiyon ve görüntüleme için bir yer sağlamak için uçucu kafa yanı sıra pipet ucu içine ve / veya kayıt odasının üzerinden Ringer çözeltisi akıntısını önlemek için çok önemlidir. Diş tutkal (ve daha az bir oranda silikon tutkal kadar) yapışkan hale ve daha sonra kısa sürede iki bileşen bir araya olarak kurumaya başlayacaktır. Bu nedenle zayıf bağ ve tutkal kümelenmeyi önlemek süratle tutkal uygulamak için kritik öneme sahiptir. Bazı durumlarda Ringer solüsyonu ile temas halinde, sinek ve cevabı etkileyebilir Ringer çözeltisi içine kirleticiler salabileceğinden, bant ve yapıştırıcı bu alternatif çeşitleri fark etmişsinizdir, özellikle deneyler t adanmış için çokO farklı kokuları kullanarak, koku sisteminin çalışma. (Kullandığımız belirli çeşitleri için malzemeler bakınız) malzemeler ikame Sonuç olarak, eğer burada dikkatli olun.
Koelenterazin birkaç farklı formları, ışık yayılmasının hızı, Ca 2 + -affinity (duyarlılık) veya ışık emisyonu 12 yoğunluğu olarak aktivitesi optimize etmek için geliştirilmiştir. Benzil-coelenterazine daha kısa yarı ömre sahip daha hızlı ve daha yüksek bir ışık yayımı ile sonuçlanır (aynı zamanda h-coelenterazine adlandırılır) Örneğin, doğal coelenterazine, birkaç saat kadar uzun vadeli görüntüleme böylece daha uygun, daha kararlıdır. Koelenterazin farklı biçimleri hakkında ek bilgi için, Malzeme Listesi'nde web adresini bakın.
Görüntüleme
Bio-ışıldama, sinyalleri bir elektron çoğaltıcı CCD kamera ile izlenebilir bir mikroskop üzerine monte (EM-CCD, -80 ° C ye soğutuldu). Bu kurulum b gerekirSıkı bir karanlık kutu içinde muhafaza e istenmeyen (ortam) ışık kirlenmesini önlemek için. Bu yazıda anlatılan kurulum 400 x 400 mm (512 x 512 piksel) görüş alanı izin 20X daldırma-objektif lens kullanır. Sinyal gürültü oranını artırmak için, veriler 0.100 sn entegrasyon süresi (10 Hz) ile elde edildi ve 2 x 2 binning kullanılmıştır (1 piksel = 1.2 x 1.2 mm). Veri elde ve mağaza için, her tespit foton atandı x, y koordinatları ve bir zaman noktası. 500 ve 600 nm dalga boyu arasındaki EM-CCD kamera (Malzeme Listesinde kesin bir açıklama bakınız)% 96 kuantum verimine sahiptir.
In vivo işlevsel beyin görüntüleme için en önemli parametrelerden biri zamansal çözünürlük. Şimdiye kadar, floresan tabanlı Ca 2 + -imaging gibi GCaMP olarak teknik ve cameleon çoğunluğu yaklaşık 4 Hz (250 milisaniye / çerçeve) bir zamansal çözünürlüğü sağlar. Son zamanlarda, biyolüminesans tabanlı GFP-aequorin biz Rais mümkün olmuştur100 ms / EMCCD kamera ile çerçeve ve hatta elektron çoğaltıcı ICDD kamera 10 ile 120 kare / sn (8.3 msn / çerçeve) 'ye kadar e kazanım zamanı. Bu zamansal çözünürlükte elektrofizyolojik teknikler (yaklaşık 1 milisaniye aralığında) bu yaklaşımlar. Yüksek zamansal çözünürlük sinaptik iletim ve uyarıcı kaynaklı faaliyet adanmış çalışmalar için bilgilendirici ve çok önemli hem de iken, CA henüz gerekli yavaş 2+ -kinetics genişletilmiş da örneğin, nöronlar içinde hücre içi Ca 2 + -Mağazalar Ca 2+ salınımını oluşuyor (inceleme için: Berridge ve arkadaşları, 2003 13).. Ters, genellikle sensörden daha iyi bir Ca2 + -affinity tespit edilecek olan ihtiyaç duyarken, bu ikinci tip için, daha düşük bir zamansal çözünürlüğü, yine de kabul edilebilir. Bu gereklilik koku recept akson terminalindeki hücre içi Ca 2 + -Mağazalar serbest bırakılmasını tespit etmek için GFP-Aequorin ile elde edilmiştirors nöronlar 7,8. Seçenek olarak ise, istenen deney koşullarına bağlı olarak, daha düşük bir zaman alıcı kullanılabilir. Örneğin, uzun bir O / N kayıtları, aşırı yüksek toplanan veri noktaları, çok sayıda (Minocci et al., 2013) bir 2 sn entegrasyon kere kullanılmıştır. Kısaca, biyolüminesans ile pratik bir özelliği, zamansal çözünürlüğe arzu edilen deneysel koşullara göre ayarlanabilir olmasıdır.
Alternatif odaları (sinek kurulum) deney amaçlarını kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Örneğin, doğal koku uyaran dayalı çalışmalarda, anten, bu nedenle A. Fiala 14 tarafından geliştirilen gibi bir yaklaşım (biz Murmu ve ark., 2010 için de benzer bir yaklaşım kullanılır) en uygunudur, ücretsiz tutulmalıdır. Kısaca, bu yaklaşımda, sinek küçük bir delik içeren plastik bir kapak kayma yapıştırılmış olan boyun, bir minutien pimi üzerinde (yapıştırılmış) gergin olduğunu. Bir conta oluşturulursinek başın üstünden etrafında. Bundan sonra, zil bir damla kafasına yatırılır ve baş kapsülü disseke edilir. Bu şekilde, antenler özgür tutuldu ve kokuları algılamak için kullanılabilir vardır. Benzer şekilde, uzun süreli kayıt sinek ihtiyacı gün 10 arasında O / N ya da çift olarak mümkün olduğu kısıtlama serbest tutulması için, ve bazı durumlarda (örneğin, besleme:% 5 glukoz batırılmış bir kılcal kağıt çözeltisi). Bu koşullarda FIALA yaklaşımı da mavi pipetlemeyin ucu (dalış yöntemi) yaklaşımı daha uygundur.
Tüm ilaç uygulamaları harici bir 6 yollu çoklu valfler gravite perfüzyon sistemi kullanılarak kontrol edilebilir. Akış önce 2 ml / dk'lık bir akışı için, her kayıt seansından kalibre hacimsel perfüzyon maddelerinin kullanımı ile kontrol edilebilir. Drenaj cihazı sürekli bir akışına izin peristaltik bir pompa aracılığıyla kayıt odasına / dak 2 ml 'lik bir oranda bir sıvı çıkarır.
Içindenedeniyle ilaç ve / veya kullanmak için ilaç miktarının pahalı maliyet bazı koşullar, biri bileşiklerin sadece küçük miktarlarda uygulamak istiyorum. Bu nedenle, doğrudan banyosu içinde yerine perfüzyon sistemine aracılığıyla uygulamak için gereklidir. Bu durumda deklanşör ışık kirlenmesini önlemek için bu işlem sırasında kapalı olması gerekir.
Analiz yöntemleri
Başına saniyede saniyede sayar ya da sayıları hem analiz için grubumuz tarafından kullanılmış olan koordinat. Saniyede sayar belki de en iyi saniyede sayım ise bütün yapılarda parlak yanıtlar için uygundur ve (ROI boyutuna yanıtların bir normalleşme temsil eden) koordinat başına hücre küçük popülasyonlar için en uygun ve doğru olduğunu. Her ikisi de kolayca analiz yazılımı seçilebilir.
Biyolüminesans yaklaşımını kullanmanın ana avantajlarından biri edinilen ve saklanan verileri (x, y, t parametreler vardır yoludurher biri) foton yaydığı. Gerçekten de, (genellikle tiff formatında) kazanılmış bir tam görüntü olarak standart modu kullanılan diğer görüntüleme teknikleri, bu sistem ile, biz sırasında ışık ile aktive edilmiştir sadece piksel koordinatları saklayarak sadece ilgili ve önemli bir sinyal elde ederken (satın alma zamanı veya zamansal çözünürlüğe tekabül eder) zaman önceden sabit süresi. Sonuç olarak, veri depolama depolama tam bir görüntü karşılaştırıldığında gerçekten "ışık" olduğunu ve dolayısıyla, daha kolay verileri analiz yapar. Veri analizi için, istediğiniz gibi birikim zaman ayarını sağlayan bir ilgili yazılım (foton görüntüleyici), kullanın. Ikna edici verileri sunmak için bir hedef arzu Sonra sinyal bir görüntü gösterim ayarlanabilir. Paralel sonuçları elde etme süresi daha aynı çözünürlükte anda ölçülür.
Önemi ve bioluminescent görüntüleme biyolojik uygulamaları
Bio-ışıldar kalsiyum görüntüleme yukarıda belirtilen fluoresan kalsiyum görüntüleme teknikleri üç temel avantaj sunar şöyle: (1) beyinde daha derin bir bölgesi görüntülü olabilir, (2) görüntüleme O / N birkaç saat ve hatta bazı daha uzun süreler için sürekli olarak yapılabilir İki gün öncesine kadar vaka ve (3) daha yakın, daha yüksek bir zamansal çözünürlüğe sahip, 120 kare / sn (8.3 msn) kadar. Bioluminescent yaklaşımın ana sınırlama dolayısıyla bize aktive yapıların ya da nöronların kesin derinliğini (z-planı) belirlemek için izin vermez konfokal aydınlatma, onun uyumsuzluk nedeniyle.
Bio-ışıldar görüntüleme, derin beyin bölgelerinin görüntüleme ilk avantajı, daha önce önceden ile elipsoid gövdenin (eb), beyin ortasında yer alan derin bir yapı içinde bir potasyum indirgenmiş kalsiyum tepkisinin görüntüleme 2007'de gösterilmiştir elektrofizyolojik veya fonksiyonel raporlar 6 (GABA A reseptörlerinin bir engelleyici) uygulanmasını takiben eb spontan Ca 2 + -Aktiflik kayıt (olan :. Çocuk Bezi ve arkadaşları, makale) sundu.
İkinci yararı, uzun ve kesintisiz kayıt süresi, laboratuarımızda birkaç çalışmalarda istismar edilmiştir. Koku stimülasyon önceki çalışmalarda 11,15,16 beyin nöron aktivitesi incelemek için kullanılmıştır. Uzun vadede görüntüleme kullanarak, ancak bizim laboratuvar kokuları olfaktör reseptör nöronların içindeki kinetik önce bildirilmemiş değişiklikleri göstermek mümkün olmuştur. Murmu ve arkadaşları tarafından, ilk çalışma. (2010) kısa bir koku uyaranlara (1-3 saniye) içindeki kinetiği ve genlik ılımlı bir farklılık göstermesine rağmen, daha uzun bir koku uyarıcı (5 saniye), bir yanı sıra daha büyük bir amplitüde neden olduğunu göstermiştir kinetik / yapı içinde değiştirmekhücre içi kalsiyum mağazaları bağlandı yanıtın ure. Bir sonraki çalışma göstermiştir 5 dakika aralıklarla 1 sn koku bakliyat 5 ardışık uygulamalar bir adaptasyon süreci düşündüren, yanıtın ilerleyici zayıflama neden 5 sn uyaran uzunluğunu artırarak, kalsiyum yanıtı değişmedi iken. Üstelik bu adaptasyon fenomeni önceden belirlenen kalsiyum depolarının 8 GABA'erjik yönetmelik tarafından başlatılan ortaya çıktı. Önemlisi, bu veriler de bu deneysel durumda, GFP-Aequorin en Ca 2 + -Sensör algılamak ve hücre içi Ca + 2 -Mağazalar salınan kalsiyum takip edebilirsiniz kanıtlıyor. Bizim laboratuvardan ek benzersiz bir çalışma mantar organları 10 bazal (spontan) beyindeki nöronal ve glial bütün toplumlarda faaliyet yanı sıra aktivite kayıt bioluminescent görüntüleme O / N kullanılır. Bu kayıtlar ant şaşırtıcı spontan aktivite ortayaennal mechanosensory ve motor merkezi (AMMC) ve antennal lob. Ayrıca, glia beklenmedik hücresi bağımsız aktivitesi gece boyunca meydana gelen. Mantar bünyesinde çalışma hem noktasal aktivitesi ve iki farklı zirveleri, hem kısa hem de tespit kimin sıklığı 10 yaş ile değiştirildi uzun.
Laboratuarımızda en son çalışmada, biz bellekte rol ikincil sinyal moleküllerinin manipülasyon etkilerini incelemek için biyolüminesens görüntüleme kullanılır ve nasıl mantar organları 9 içinde kalsiyum yanıtını etkiler. Dunce ve rutabaga daha 30 yıl önce tespit edildi ve cAMP seviyesini düzenlemek için bilinmesine rağmen Nitekim, hücresel ve fizyolojik mekanizmaları ve özellikle Ca 2 + -yanıt üzerine in vivo etkileri hala büyük ölçüde bilinmemektedir. GFP-aequorin yaklaşımı ile eş zamanlı kalikse hem kayıt yapabiliyor (dendritik structur olmuştures) ve hücre gövdeleri, hem de lobu seviyesinde aksonal çıkıntılar ve böylece bizim seviyesi ve bu son derece karmaşık bir yapının farklı bölümlerinde tepkinin kinetiğini ilişkili izin verir.
En son uygulama biz taklit eder ilgi yapısına presinaptik yapay aktive nöron popülasyonları ile doğal bir tepki geliştiriyor. Bunu yapmak için, presinaptik nöron P2X 2 reseptörü, ATP'ye yanıt veren bir ligand-kapılı iyon kanallarını, ifade postsinaptik nöronal nüfus GFP-Aequorini ifade eder. Farklı nöron popülasyonu içine bu iki eleman ayrılması iki ayrı sentezleme sistemlerini gerektirmektedir. Bu amaçla bir LexA GFP-aequorin oluşturuldu içeren yaparız. Biz mantar gövdesinde UAS p2X 2 ile Gal4-GH146 kullanılarak PNS ve GFP-aequorin bir alt kümesi P2X 2 ifade bu sistem ile ön-deneylerdeLexA-13X-GFP-aequorin birlikte LexA MB247 hattı kullanılmıştır. Biz başarıyla PNS içinde P2X 2 reseptörü (Şekil 6) 1 mM ATP uyarımlar ile mantar vücutta kalsiyum yanıtları kaydettik.
Sonuç olarak, biyolüminesans GFP-aequorin yaklaşım diğer Ca 2 + -indicators Ca benzer 2+ -Aktiflik, uyarılmış uyarıcı kayıt yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ama daha da önemlisi, aynı zamanda beynin içinde kendiliğinden Ca algılama 2+ -Aktiflik izin verir. Bu yaklaşım beyin içinde fizyolojik olayların ve faaliyet kalıplarının anlayışımızın derinliğini artırabilir uzun vadeli deneyleri ve tüm beyin görüntüleme için gelecek olanaklar açılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
