Designing, emballasje, og levering av høy titer CRISPR Retro og lentiviruses via stereo Injection

Summary

Den CRISPR / Cas9 systemet gir potensial til å gjøre målrettet genom redigering tilgjengelig og rimelig til det vitenskapelige samfunn. Denne protokollen er ment å demonstrere hvordan å lage virus som vil knockout et gen av interesse å bruke CRISPR / Cas9 system, og deretter injisere dem stereotaksikalt i den voksne mus hjernen.

Introduction

For å studere grunnlag av normal fysiologi og sykdom patologi, er det et behov for å manipulere nøyaktig genekspresjon i modellorganismer. For pattedyrmodellorganismer, er dette i stor grad sentrert på etablering og utvikling av transgene mus, hvor en genetisk element av interesse er flankert av nettsider anerkjent av en rekombinase. Dette kan resultere i et område bestemt manipulering av disse flankert gener. Selv om dette har vært en vellykket strategi, er det på tide og ressurskrevende; for eksempel å lage en trippel transgene dyr som ville uttrykke en floxed genet, Cre recombinase, og en Cre reporter gen krever flere parringer og validering. I motsetning til dette stereotaksisk injeksjon av replikasjon defekte virale partikler som koder for et fluorescent protein og rekombinasen inn i en floxed gen dyr ikke krever komplisert genotyping eller avl strategier ^1. Videre, hvis en fluorescerende protein og Cre uttrykker viruset er co-injisert med en andre virus encoding en annen fluorescerende protein, da dette gir en innen-vev kontroll for målrettet genetisk manipulasjon. Selv om denne strategien fortsatt krever bruk av knock-i dyr, viralt medierte RNA baserte strategier omgå behovet for transgene dyr. For eksempel kan stereotaksisk injeksjon av replikasjonsdefekt virus som koder for en fluorescerende protein og en kort hårnål RNA (shRNA) bruke cellens endogene RNAi maskineri for å resultere i en kraftig reduksjon av transkripsjon av et gen av interesse. Men shRNA strategier produsere subtile genet knock-downs ofte resulterer i beskjedne cellulære fenotyper ^2. Mens en knock-down kan være mer fysiologisk relevant for heterozygot gen dysfunksjon, sin redusert robusthet i forhold til en knock-out er ikke ideelt for fenotypiske oppdagelse av nye gener.

En tredje teknikk som nylig har dukket opp, den CRISPR (Gruppert regelmessig interspaced Kort palindromic Repeat) / Cas9 (CRISPR-forbundetprotein 9) system, er avhengig av ekspresjon av både en liten eksogene RNA og DNA skjære enzym. Den CRISPR / Cas9 systemet ble tilpasset fra prokaryote immunsystem som utviklet en metode for å identifisere fremmede, invaderende DNA fra virus og målretting det for nedbrytning via Cas9 enzymet ^3,4. Denne kraftige genom redigering teknikken kan brukes for å lage målrettede slettinger innsett og mutasjoner; og følgende protokoll vil skissere hvordan å lage slettinger i et gen av interesse for å knockout sitt uttrykk in vivo. Den Cas9 enzym skal oppgis med en guide RNA homolog til regionen av interesse og sammenhengende med et stillas RNA. Knockout av et gen ved hjelp av denne teknikken krever målretting Cas9 til en bestemt region i genomet bruke syntetiske guide RNA (sgRNA), og indusere doble strandet pauser (DSB sin) på et område av interesse. Disse DSB sin blir deretter reparert av den endogene celle-reparasjon maskiner via ikke-homologe end-sammenføyning (NHEJ) som leannonse til indels som kan gi missense eller nonsense mutasjoner, og kan derfor skape et tap av funksjonell protein uttrykk ^fem. Fordi dette system frembringer genomiske forandringer, det bare krever den forbigående ekspresjon av de Cas9 og sgRNA. Det er imidlertid ønskelig for en stabil fluorescerende indikator for å identifisere celler og deres avkom manipuleres på denne måten.

Lenti- og retrovirus har fordelen av stabilt å integrere DNA av interesse inn i vertceller som opprettholder langvarig ekspresjon og er gått ned til dattercellene i løpet av mitose. Denne protokollen beskriver konstruksjon og produksjon av to typer replikasjonsdefektivt, høy titer retrovirus: humant immunsviktvirus avledet lentivirale partikler (lentivirus) og de som er basert på murine Maloney leukemi virus (retrovirus). Selv om begge disse virusene er i stand til å støtte stabilt uttrykker store transgener, kan retroviruspartikler kun integreres i genomet during celledeling med nedbrytning av kjernefysiske konvolutten, og kan derfor brukes som et verktøy til å merke og fødselsdato celler ^6. Mens lentiviruses har et rykte for å være forholdsvis lav titer ^7, denne metoden, herunder bruk av koffein ⁸ i løpet av viral samling, produserer rutinemessig titer av 10 ⁹ og 10 ¹⁰ partikler / ml. En annen fordel med lenti- og retrovirus er den toleranse for meget store innsatser. Følgende samling av protokoller skisserer fremgangsmåten for å utforme en lenti eller retrovirus som koder et fluorescerende reporter, sgRNAs, og Cas9 å utnytte CRISPR / Cas9 system for å modifisere DNA, så vel som uttrykker et fluorescerende protein.

Mouse stereotaxic nevrokirurgi er en verdifull metode for å injisere virus in vivo for å studere morfologi, funksjon og tilkobling av infiserte nerveceller. Virusinfeksjon i neuronene kan anvendes for å manipulere uttrykk nivåer over en lengre periode av time, som for eksempel gjennom utvikling, og ekspresjon kan kontrolleres nøyaktig ved anvendelse av forskjellige legemiddel induserbare systemer og spesifikke Cre drevet ekspresjon. Dette bestemte protokollen forklarer hvordan du injiserer et virus som uttrykker en sgRNA og Cas9 til knockout et gen av interesse i hjernen til en voksen mus. Mus komme seg meget raskt fra denne fremgangsmåten og ekspresjon av den virale transgenet kan ses i løpet av 48 timer etter injeksjon. Imidlertid synes fluorofor uttrykk til å øke i løpet av uker resulterer i tilnærmet maksimal nivåer ved 3 uker etter infeksjon. Mus som gjennomgår viral stereotaksisk injeksjon kan brukes til oppførsel, elektrofysiologi, eller morfologiske studier. Totalt sett er hensikten med disse prosedyrene for å demonstrere hvordan man knockout et gen i den voksne mus hjernen ved hjelp av stereotaktisk kirurgi og et virus som uttrykker en bestemt sgRNA og Cas9.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle protokoller ble godkjent av Dartmouth Institutional biosikkerhet and Institutional Animal Care og bruk komité boards.

1. Protokoll for å designe en guide Strand (sgRNA) for CRISPR / Cas9 Retrovirus

MERK: Det er mange non-profit nettsteder som kan brukes til å generere sgRNAs å målrette et gen av interesse (https://benchling.com/ og http://crispr.mit.edu/). Målet med denne protokollen er å designe og bestille enkelt strandet oligos fra en kommersiell leverandør som er bundet til hverandre. Dette glødet oligo vil bli ligert inn i PXL overføringsvektor. Se supplerende video en for eksempel på å designe sgRNAs bruker Benchling.

1. Bruk et nettsted dedikert til å designe sgRNAs.
   MERK: For eksempel legge inn en koding / exonic sekvens fra nær begynnelsen av det aktuelle genet inn på nettsiden vil generere en 20 nukleotid sgRNA. Bruk 20 nucleotide sgRNA sekvens for å utforme den forstand og anti-sense oligos som vil bli pålagt å opprette sgRNA.
2. Etter å generere sgRNA, kopier denne sekvens i et tekstbehandlingsprogram. Legg til en G (guanin) til begynnelsen av den 20 nukleotid sekvens sgRNA i dokumentet dersom den ikke allerede begynne med en (dvs. G-20 nukleotid sgRNA sekvens). Dette er nødvendig for å sikre god transkripsjon av U6 promoteren.
3. Dokumentere det motsatte komplement av dette nå 20-21 nukleotidsekvens. For den forstand oligo, tilsett "CACC" til 5 'enden av sekvensen i dokumentet (dvs. CACC-G-20-nukleotid-sekvens sgRNA). Dette overheng vil bli brukt for å ligere sekvensen inn i PXL vektoren.
4. For antisense oligo, legge AAAC til 5 'enden. Bruk dette overheng for å ligere sekvensen inn i PXL vektoren.
5. Skaff fornuft og antisense oligonukleotider. Etter å ha mottatt oligonukleotider, gjør 100 mikrometer aksjer hjelp DNAse fritt vann. Bland 10 ul hver av de 100 uM sense og antisense oligonukleotider med 4 μl 10x NEB Buffer 2, og 16 pl vann.
   MERK: De trenger ikke side rensing eller 5'phosphorylation (som BbsI overheng er ikke-kompatible kohesive ender).
   1. Bringe 200 ml vann til koking i et 500 ml begerglass, deretter flyte røret som inneholder denne blandingen i et skum "flyter" holder. La vannet langsomt kule fra 95 ° C i 2 timer ved romtemperatur.
   2. Fortynn nå glødet-oligo blanding 1: 1000 i sterilt vann og brukes umiddelbart i den følgende ligering eller lagre den gjenværende reaksjonsblandingen ved -20 ° C.
6. Digest PXL, en PX330 vektor-derivat, med den BbsI restriksjonsenzym ved 37 ° C i 2 timer. Bruk en 40 mL reaksjon inneholder 2 mikrogram av PXL, 4 mL 10x NEB Buffer 2, 1 ul Bbs1 og balanse vann. Utsett fordøyd-PXL til rutine gel rensing ved hjelp av et kommersielt kit. Sørg for at utbyttet er ~ 8,5 kB produkt.
7. Ved hjelp av en kommersiell ligeringssett, ligate 1 ul av 1: 1000glødet-oligonukleotider med 50 ng av fordøyd og gel renset-PXL. Forvandle ligation produktet inn kompetente rekombinasjon mangel E. coli (NEB 5-alfa, delkloning effektivitet). Screene transformantene for tilstedeværelsen av det riktige plasmid skinnen ved DNA-sekvensering.
8. Fordøye U6, guide strand, og RNA stillaselementer (sgRNA) ut av PXL hjelp BstB1 og Pac1 restriksjonsenzymer og ligate inn i fluorescerende protein-T2A-Cas9 viral ryggrad fordøyd med de samme restriksjonsenzymer. Transform ligation produktet (NEB 5-alfa maksimal effektivitet). De fluoriserende protein-T2A-Cas9 viral ryggrad plasmider er lave kopi plasmider og dermed lave kopiprotokoller må brukes.
   MERK: En annen sgRNA kan være like introdusert av Paci fordøyelsen av annen PXL guide strand plasmid og ligert inn i Pac1 fordøyd og kalv-tarm fosfatase behandlet viral ryggrad allerede inneholder den første guiden strand. Fosfatase behandling av viral overføring plasmidet vil hjelperedusere antall transformanter fra den selv-ligering av plasmider som ikke inneholder den andre guide.
9. Sequence bekrefte den endelige plasmid og maxi prep bruker Nucleobond Xtra maxi prep kit og pakke det inn i et virus ved hjelp av følgende "Protokoll for Retro / Lentiviral Produksjon - CaPO4 Method".

2. Forbered 293ft / 293GP Cells for Transfeksjon (Retro / Lentiviral Produksjon - CaPO4 Method)

1. (Dag 1) hurtig tiner en ampulle med celler pr 10 cm cellekulturplate i et 37 ° C vannbad. For lentiviral emballasje, bruker 293ft celler. For retrovirale emballasje, bruke 293GP (gag / pol) celler.
2. Pipette alle de tinte-celler fra cryo rør inn i en 15 ml konisk rør og tilsett 2 ml forvarmet CO ₂ likevekt-komplett Iscove modifiserte Dulbeccos Medium.
3. Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 500 xg til pellet. Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 10 ml komplett Erbukt modifiserte Dulbeccos Medium. Plate cellene på en 10 cm cellekultur parabolen. Cellene inkuberes over natten ved 37 ° C i en 5% karbondioksyd-inkubator.
4. (Dag 2) 24 timer etter plating, endre media på plate ved å aspirere eksisterende media og legge 10 ml forvarmet Iscove modifiserte Dulbeccos medium til plate.
   1. (Dag 3-4) 24-48 timer etter endring av medium, og når cellene blir sammenflytende, splitte cellene til en sammenflytning av 2,5-3,0 x 10 ⁶ celler / plate (10 cm plate).
   2. Å splitte cellene, aspirere mediet og platen vaskes med 5 ml PBS. Tilsett 1 ml av 0,25% trypsin til platen og inkuber ved 37 ° C inntil cellene løftes av platen. Tilsett 0,5 ml av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium for å nøytralisere 0,25% trypsin reaksjon og pipettere cellene inn i et 1,5 ml rør.
   3. Spinn-celler ved 500 xg i 5 minutter. Resuspender cellene i 1 ml av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium. Fortynn 1081; l av celler i 90 ul PBS. Telle celler ved hjelp av enten en hemocytometer eller automatisert celleteller. Re-plate 2,5-3,0 x 10 ⁶ celler / plate med komplett Iscove modifiserte Dulbeccos Medium.
      MERK: Celler blir ~ 50% konfluent 24-34 timer etter plating. Transfektere cellene når de er ~ 50% sammenflytende.

3. (Dag 5) CaPO4 Transfeksjon og Viral Particle Collection

1. Endre media 2 timer før transfeksjon ved å aspirere eksisterende media og legge 10 ml forvarmet Iscove modifiserte Dulbeccos Medium. Sørg for at det er nøyaktig 10 ml av media i 10 cm plate.
2. Forbered transfeksjon reagenser for 2 retter med 2, 5 ml rund bunn polystyren rør. Merk den første tube "DNA", og den andre tube "2X HBS". Juster konsentrasjonen av DNA til 1 ug / mL i Tris-EDTA ved pH 7,4.
   1. For lentiviruses, sakte legge 20 mL av overføringsvektor (The Viral konstruere av interesse), 13 mL av CMVdelta8.9, 9 mL av VSV-g, 860 mL av molekylær biologi klasse H ₂ O, og 100 mL av 2,5 M CaCl ₂ til den første tube ( "DNA") under kontinuerlig tappe på røret for å blande.
   2. For retrovirus, utelater CMVdelta8.9 plasmid. Tilsett 20 mL Transfer Vector, 15 mL VSV-g, 860 mL Molecular Biology Grade H ₂ O, og 100 ul 2,5 M CaCl ₂ til røret merket "DNA".
   3. Tilsett 1 ml av 2x HEPES-bufret saltløsning (pH 7,0, og denne pH er helt avgjørende) til røret merket "2X HBS".
   4. Langsomt tilsett 1 ml Innholdet av "DNA" rør til "2X HBS" tube, en dråpe om gangen. Kontinuerlig trykk på "2X HBS" rør med indeksen eller langfinger mens du legger innholdet i "DNA" tube. Observer åpen Capo ₄ blemmer etter hver dråpe. Inkuber røret i mørke i 30 minutter ved romtemperatur.
3. Tilsett 1 ml av transfeksjon i langsomme dråper til hver 10 cm celleplaten, og deretter inkubert over natten ved 37 ° C.
4. (Dag 6) Bytt media med 8 ml Iscove modifiserte Dulbeccos Medium + 0,5% FBS og 40 mg koffein / 100 ml media. Hvis overføringen vektoren inneholder et fluoriserende fargestoff, så fluorophore uttrykk indikerer en vellykket transfeksjon.
5. (Dag 7) samle media inneholdende de virale partikler ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette og avgi inn i et 50 ml konisk rør. Oppbevar 50 ml konisk rør ved 4 ° C. Tilsett 8 ml 0,5% FBS media til hver plate.
   1. (Dag 8) Igjen, samle media inneholder viruspartikler og kombinere med gårsdagens innhøsting i 50 ml konisk tube.

4. Konsentrasjon og rensing av virus

1. Foreta en 5x polyetylenglykol 6000-løsning ved tilsetning av 40% polyetylenglykol 6000 og 1,5 M NaCl for å DDH ₂ O. Autoklaver løsningen påvæsken syklusen i 45 minutter ved 121 ° C. Sakte bland løsningen når kjøling.
   MERK: Løsningen vil starte overskyet og deretter bli klart som den kjøler.
2. Sentrifuger 50 ml konisk rør inneholdende begge samlingene av viral supernatant ved 2000 xg i 10 minutter for å pelletere uoppløselig materiale. Rens viral media ved filtrering gjennom en 0,45 mikrometer lav proteinbinding sprøytefilter (PES eller PVDF).
3. Legg 5x polyetylenglykol 6000-løsning for å media (Sluttkonsentrasjonen bør være 8% polyetylenglykol 6000 og 0,3 M NaCl). Bland ved å snu røret flere ganger (ikke vortex). Inkuber virale inneholdende polyetylenglykol-løsning ved 4 ° C i 12 timer eller mer, reblanding av og til.
4. (Dag 9) Sentrifuger virusinneholdende polyetylenglykol-løsning ved 2500 xg i 45 min. Fjern og kast supernatanten og spinne igjen i 2 minutter. Igjen, fjern og kast supernatanten.
5. Resuspender pelleten ved å tilsette 320 ulsteril fosfatbufret saltløsning (320 pl er 1/100 ^th av det opprinnelige volum av virusinneholdende media som samles) og inkuber over natten ved 4 ° C. Eventuelt resuspender pelleten i romtemperatur på en vippe i 30 minutter.
6. Etter re-suspendering av pelleten, alikvoter viruset (5-10 ul per 0,5 ml rør) og fryse alikvoter ved -80 ° C (fryse tining eller lagring ved 4 ° C vil dramatisk redusere titer).
7. Titer virus ved hjelp av standardprotokoller, dvs. utføre en fortynningsrekke på en seks-brønns plate av HEK293T celler og manuelt telle fluorescerende kolonier 48 timer senere.

5. Testing Effekt av CRISPR Virus

MERK: Sekvens kloner ved hjelp av følgende trinn for å teste for produksjon av dobbel-strand pauser repareres av NHEJ hjelp av musen Neuro2A celler. Dette har den fordel i forhold til oppmåling analyser ved at den kan brukes til å bestemme prosentandelen av celler som har blitt modifisert og artenav indels følge av NHEJ.

1. Belegge en 3,5 cm celle kulturskål med en geléproteinblanding som matrigel fortynnet 1:50 i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C. Aspirer geléaktige proteinblandingen og plate de Neuro2A celler.
2. Etter at cellene når Neuro2A 50% konfluens, tilsett CRISPR Lentivirus eller Retrovirus ved en multiplisitet for infeksjon på 10 (dvs. 10 viruspartikler per celle).
   MERK: Neuro2A celler er ikke så elskverdig for infeksjon som er HEK293 celler, og dermed, en enkelt infeksjon vil ikke resultere i 100% av cellene blir infisert med lentivirus. Videre, det retrovirus eneste smitter delende celler, og derfor vil heller ikke resultere i 100% infeksjon. For å oppnå en nær 100% forekomst av infeksjon, kan tilsetningen av viruset bli gjentatt på flere dager, splitte cellene etter behov. Alternativt kan fluorescerende positive celler isoleres ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering. the mest effektive måten å oppnå en 100% infeksjon rate med en lentiviruses er å utføre en enkel infeksjon etterfulgt av FACS isolasjon. For et retrovirus, utføre 4-runder på infeksjon 24 timers mellomrom og følge med FACS isolasjon for å sikre 100% infeksjon.
3. Etter å infisere cellene i en uke, utvider cellene til nær konfluens på en 10 cm plate, aspireres media, og platen vaskes med 5 ml fosfatbufret saltvann. Tilsett 1 ml av 0,25% trypsin og inkuber ved 37 ° C inntil cellene løftes av platen. Tilsett 0,5 ml av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium for å nøytralisere 0,25% trypsin reaksjon og pipettere cellene inn i et 1,5 ml rør og pelletere cellene ved 500 xg i 5 minutter.
4. For å isolere DNA, tilsett 100 pl av 50 mM kaliumhydroksid, resuspendere cellene, og inkuber ved 95 ° C i 5 minutter. Nøytralisere løsningen ved å bruke 10 ul av 1 M Tris, pH = 8,0.
5. PCR forsterke regionen flankerer genomiske regionen målrettet av CRISPR sgRNAved hjelp av ~ 300 ng av DNA isolert i trinn 5.5 ved hjelp av en high fidelity PCR masterblanding ^4.
6. Kjør PCR-reaksjonen på en 2,5% agarose-gel og gelen rense den passende størrelse fragmentet ved anvendelse av en gel rensesett slik som en gel DNA utvinning kit. Ligere inn i en PCR kloningsvektor som pGem-t-lett og forvandle seg til kompetente celler ^9.
7. 24 timer senere, tilsett 2 ml LB buljong inn i en 15 ml rund rør samt riktig antibiotika (ampicillin, neomycin, etc.). Inokuler røret med en individuell koloni ved hjelp av en steril pipette eller løkke for å velge en enkelt koloni fra LB-plate. Utvide og vokse kolonien ved å riste røret ved 250 rpm og 37 ° C i 24 timer. Gjenta for så mange kolonier som ønsket.
   1. Ved hjelp av en mini-prep kit, isolere DNA fra E. coli og sekvens med primere utformet for å forsterke området av genet som skal oppnås med sgRNA for å analysere Cas9 målrettet regionen av musegenomet.

6. stereo Injection Protokoll for Adult Mouse

1. Forbered Surgery
   MERK: Det er viktig å opprettholde sterile forhold under overlevelses operasjoner. Dette gjøres i denne protokollen ved varme sterilisering av kirurgi, ved hjelp av betadine å sterilisere injeksjonsstedet, og legge antibiotisk salve til innsnitt området etter at den er lukket. Det er også viktig å bruke sterile hansker samt en grundig sterilisert, dedikert kirurgi område.
   1. Heat sterilisere kirurgi før bruk ved enten autoklave eller ved hjelp av varmt perle sterilisator. Forbered utvinning kammer og kirurgi område ved å slå på varmeputer for å opprettholde kroppstemperaturen under operasjonen og utvinning. Montere bore brukes til å lage hull i skallen for injeksjon.
   2. Last 4 mL av virus inn i injeksjonsnål ved uttrekking av viruset direkte fra den sterile PCR-rør. I korthet fjerne viral delmengde av is. Opprettholde viruseti sprøyten ved romtemperatur i mer enn en time før injeksjon.

7. stereo Injection

1. Bekreft at ventilasjonen til kirurgi suite er åpen for å sikre tilstrekkelig luftstrøm. Forbered musen for kirurgi ved bedøvelse med 4% isofluran i en induksjonskammeret. Etter anestesi, barbere hodet for å forberede injeksjonsstedet.
   1. Plasser musen i stereoinstrument ved hjelp av pinsett til å bevege tungen ned og til siden. Sett bite bar i munnen før tennene faller inn i sporet, deretter sikre øret barer. Sørg for at kroppen av musen er på varmeputen og nesen ligger i nesepartiet. Direkte 4% isofluran inn i den koniske nese. Bekreft anestesi ved å klemme foten med pinsett og sikre at det ikke er noen skremme refleks.
   2. Påfør kunstige tårer å smøre øynene. Fullfør forbereder injeksjonsstedet ved swabbing barbert hode med vekslende runder av POVidone-jod og lidokain.
2. Ved hjelp av en skalpell, kutt lite snitt langs midten av hodebunnen. Tørk skallen med en peroxide pinne og hydrogen om nødvendig for å hjelpe visualisere bregma.
   1. Ved hjelp av en dissekere omfang, finne bregma på skallen og plassere borespissen på bregma. Zero (eller posten) de digitale stereotaktiske koordinater på x, y og z fly.
   2. For å sikre at hodet er nivået på den rostrale til caudal y-aksen ved å plassere borkronen på lambda og vatre hodet slik at z-koordinaten er omtrent lik ved begge bregma og lambda.
   3. For å sikre at hodet er nivået på x-aksen, plasserer boret til y = 1/2 lambda. Kontroller at z-koordinaten er lik 1 mm på hver side (x = +/- 1 mm) av sagittal sutur. Juster skallen hvis det er en forskjell i z-koordinaten ved 1 mm til venstre og høyre av lambda.
3. Plasser bore over de ønskede koordinater. For dentate gyrus, bruk koordinatsystemetsy = -1,9 fra bregma og x = +/- 1.1. Før boring, senke isofluran til 2%, deretter sakte og forsiktig, bore gjennom skallen.
   1. Etter boring alle hullene, påføre fylt sprøyte på stereotaxic instrument. Visuelt sentrere sprøyte i løpet av hullet og null z-koordinat på skallen.
   2. Sakte senke sprøyten til dypeste z-dybde. For dentate gyrus, z dypet er -2,5, -2,4 og -2,3. Begynne injeksjon ved en hastighet på 0,25 mL / min ved anvendelse av en stereotaksisk injektor.
      1. Etter injeksjonen er fullført på laveste Z-dybde, vent 1 min, deretter øke til neste koordinere og begynne injeksjon igjen. Fortsett dette mønsteret til alle z-injeksjon koordinatene er injisert. Vent 2 min før du tar sprøyten etter siste injeksjon.
         MERK: Ingen bivirkninger har blitt registrert på vev ved å injisere inntil 2 mL av virus per halvkule i musen hjernen.
   3. Gjenta injeksjon for andre borehull.
4. Etter injeksjonen fjerne musen fra stereotaxic instrument og sy hodebunnen med 6-0 silke sting. Påfør Lidokain og en anti-bakteriell krem ​​til såret.
   1. Injisere 0,8-1,0 ml saltvann + Ketoprofen (3-5 mg / kg) via IP rute til å håndtere smerte. Deretter plasserer muse i oppvarmet utvinning kammer. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returnere dyr til selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert.
5. I dagene etter operasjonen, veie musen daglig og gir myk mat og godbiter. Sjekk såret og merk den generelle tilstanden / oppførsel.
6. Etter stereotaxic injeksjon, kan musene avlives for skive prep elektro ^en eller dynket og deres hjerner fjernes, skiver, og farget via immunhistokjemi for analyse ^10.

Representative Results

Etter "Protokoll for å designe en guide Strand (sgRNA) for CRISPR / Cas9 Retrovirus", oligonukleotider rettet mot en bestemt sekvens er satt inn i PXL kloningsvektor nedstrøms hU6 arrangøren og nedstrøms for en guide RNA stillaset ved hjelp av BbsI kloningsseter (figur 1, trinn 1). Dette sgRNA blir så fjernet fra PXL og innsatt i pRubi ryggraden ved hjelp av BstBI og paci steder (figur 1, trinn 2). Til slutt, en annen sgRNA klonet inn PXL kan plasseres nedstrøms av den første guiden i pRubi-Guide1 (figur 1, trinn 3), rettet mot et annet område av genet og øke sjansene for en knockout via NHEJ. Verifikasjon av de riktige konstruksjoner bør bestemmes ved sekvensanalyse. Når denne konstruksjon blir gjort, kan det pakkes inn i et virus som følge av "Protokoll for Retro / Lentiviral Produksjons- CaPO4 Method". Vellykket emballasje er bekreftet ved infeksjon av virus inn i HEK293-celler for å titrere vIrus. Hvis det ikke er fluoroforen uttrykk så var det sannsynlig at en feil under pakking av viruset.

Figur 2 viser et representativt resultat av 2 retrovirus, en uttrykker GFP og den andre som uttrykker mCherry, ko-injisert inn i dentate gyrus av neonatale mus (7 dager gammel) og avbildes 21 dager etter injeksjon. Merking av neuroner med mCherry eller GFP tillater morfologisk vurdering av ulike genetiske manipuleringer i det samme vev, hvor en virus kan uttrykke et CRISPR / Cas9 mediert KO og den andre en styre virus, uttrykker kun en fluorofor. Stereotaxic injeksjon gir presis anatomisk selektivitet som demonstrert av den diskrete infeksjon av de tiltenkte koordinater, dentate gyrus. Ved å analysere hjernen seksjoner for smitte, er det viktig å holde omliggende vev før det er bestemt at riktig anatomisk region ble smittet. Hvis det ikke er tegn til infeksjon, så er det mulig at injeksjonen skjedde i en naboregionen end kan identifiseres i omkringliggende deler. Det kan også være nyttig for å finne nålen spor for å finne den nøyaktige injeksjon regionen. VSVg pseudotyped virus sjelden spredt ut over marginene av dentate gyrus når injiseres in vivo, og har en tendens til å spre seg langs rostral / caudal aksen infiserer celler langs hele dentate gyrus, som analyseres av 3D rekonstruksjon (figur 3).

Figur 1:. Kloning strategi for retroviral pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR plasmid Denne strategien er identisk for FU-baserte lentiviral plasmider. sgRNA oligos er herdet og settes inn i PXL hjelp av BsbI kloningsseter. Etter sekvensering for å sikre at sgRNA er vellykket innført i PXL, fordøye plasmid med BstBI og PACI. Innsatsen som slippes ut (svart boks) blir så klonet inn i viral tilbake ben (svart stiplet linje) pRubi-Guide1 CRISPR. En annen sgRNA kan også settes inn i PXL og fordøyd ut ved hjelp av Paci enzymet. Dette blir så klonet inn i pRubi-Guide1 CRISPR vektor (røde stiplede linjer) ved hjelp av PACI området. Den resulterende plasmid inneholder da både guide tråder samt de nødvendige virale elementer, arrangører og fluoroforer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2: Retroviral injeksjon av mus dentate gyrus Retroviruses som uttrykker mCherry (rød) eller GFP (grønt) ble injisert i dentate gyrus av en p7 mus. 21 dager senere ble musene perfused og hjernene seksjonert og farget for GFP og mCherry. (A) En 5x vidvinkel fluorescerende bildet viser precision av dentate gyrus injeksjon og spesifisiteten av merking dentate gyrus granule neuroner. Morfologien av hippocampus kan sees via DAPI (blå) fargingen. Scale bar måler 200 mikrometer. (B) En 10X bredt felt fluoriserende bilde viser at disse høye titer lentiviruses infisere et stort antall celler hvis morfologi kan nås via fluoroforen uttrykk. Scale bar måler 100 mikrometer. (C) virus som uttrykker GFP eller mCherry ble co-injisert i dentate gyrus. Ved hjelp av et system av retrovirus, kan man bruke en virus for å lage en genetisk manipulering merket med GFP og annen manipulering preget av mCherry, og deretter vurdere enkelte eller tilsetnings endringer på grunn av hvert virus. Scale bar måler 10 mikrometer.

Figur 3:. Anatomisk spredning av lentiviral injeksjon stereo coinjection av en GFP-shPten virus og en mCherry kontrollvirus i hjernen til en voksen PTEN ^{loxP / +} mus resulterte i en viral spredning langs hele rostrale / kaudal aksen av dentate gyrus av hippocampus. Dette er vist i et 3D-rekonstruksjon av utstrekningen av injeksjons i hvilken lukkede konturene av viral spredning ble sporet over 21 seriesnitt (Z = 50 mikrometer / seksjon) ved hjelp av rekonstruksjon programvare. Contour tracings ble deretter justert for å generere 3D-bilder for volum kvantifisering. Total viral spredning vises i grønt (volum = 54730800 mikrometer ³⁾ og dentate-lokaliserte spredning er vist i lilla (volum = 27275200 mikrometer ^3). Viruset sprer seg langs nålen spor og corpus callosum i krysset av nålen spor i tillegg til å fylle den rostrale / caudal aksen til dentate gyrus. Scale bar måler 200 mikrometer.

les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
Supplemental Video 1. Design av sgRNAs å klone inn retroviral og lentiviral ryggrad.
I denne syntetiske guide RNA (sgRNA) utforming eksempel er genomisk sekvens av musen CHD8 ned fra NCBI. Startkodonet og ekson struktur blir deretter visualisert i Vektor NTI. Dette gir oss muligheten til å kopiere den genomiske regionen rundt den første koding ekson og skriv denne sekvensen inn Benchling. Benchling tillater oss å visualisere alle potensielle sgRNAs i regionen. Videre etter indikerer genomisk region vi har innspill, vil Benchling vise oss resultatet på målet og off-target for hver guide RNA. Brukeren kan da velge guiden RNA med de høyeste on-og off-target score. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

Det er noen viktige skritt som er viktig for vellykket viral emballasje. Celle helse er kritisk før og under transfeksjon, som usunn celler vil i stor grad redusere mengden av viruset produsert. Dersom transfeksjon og emballasjen er vellykket, deretter 100% av cellene skal uttrykke fluoroforen og cellene bør danne en funksjonell syncytium. I trinn 3.2.4, trykke røret er nødvendig for høy-titer transfeksjon effektivt, og pH-verdien i HEPES-bufret saltvann må være nøyaktig. Maxi-forbereder som produserer plasmidene nødvendige for viral emballasje må være ekstremt rent. Til dette punkt er det nyttig å etanol utfelle det endelige DNA-eluering og gjensuspendere i Tris-EDTA buffer. Det er også svært viktig for å redusere mengden av serum til 2% eller mindre i media som koffein blir lagt til på dag 6 (trinn 3.4) før virussamling. Hvis serumet ikke reduseres, da den endelige rensede viruset vil inneholde en uønsket mengde av serum protein. Anvendelsen av polyetylenglykol 6000 ved utfelling av viruspartikler utelukker nødvendigheten av ultrasentrifugering. Det er også viktig å merke seg at Cas9 CRISPR inneholdende virus har typisk en titer rundt 10 ganger mindre enn virus utelukkende inneholdende en fluorofor.

For stereotaksisk kirurgi, bruk av inhalert anestesi tillater hurtig og nøyaktig kontroll eller dyrets bevissthet i forhold til injiserbare bedøvelsesmidler og lar anestesi over et større aldersgruppe. Det er svært viktig å holde den kirurgiske instrumenter rene og sterile, og reproduserbar målretting krever nøyaktig posisjonering av hodet. Pass på at det ikke er pitching eller rulling av hodet i stereoinstrument og at hodeskallen føles godt på plass. Det kan være nyttig å la skallen for å tørke for å finne suturene for å bestemme de stereotaksiske koordinater. I tillegg bør hastigheten og volumet for hver stereotaksisk koordinat bestemmes empirisk.

Denne teknikken er begrensende ved at spredningen av et lenti- eller retrovirus er begrenset, spesielt når sammenlignet med adeno-assosiert virus (AAVs) .Derfor, disse virusene er verdifulle når det infiserer en diskret hjerneregion, men ikke for generelle infeksjoner assosiert med AAVs anvendes for adferdsanalysen i dyr. Bruken av koffein i denne protokollen i stor grad øker titer av disse virusene, men de er fortsatt ikke så høy som de titere oppnådd i AAV emballasje. Dessuten er stabil integrering bare en fordel ved fluorofor uttrykk, som CRISPR / Cas9 danner stabile genomiske endringer, selv når transient transfektert, og det er mulig at pågående ekspresjon av Cas9 og sgRNA kan til slutt frem av mål-effekter. Den forbigående uttrykket CRISPR / Cas9 system med AAVs er tilstrekkelig til å produsere genomisk endringer som forplanter seg gjennom celledelinger, men fluorophore uttrykk vil ikke bli opprettholdt.

Opprettelse av lenTI og retrovirus som anvender CRISPR / Cas9 system vil gi muligheten til å målrette en hvilken som helst ny gen i en rekke forskjellige organismer. Effektiviteten av genet redigering ser ut til å være avhengig av sekvensen av guiden RNA rettet mot Cas9 cleavage. Det er blitt fastslått empirisk at mellom 10% og 80% av klonene inneholder indels etter sekvense infisert Neuro2A celler. Det er for øyeblikket ukjent om Indel frekvenser beregnet i Neuro2A cellene er reflekterende av de i nerveceller. Guide RNA design software som Benchling inkluderer nå en "on-target" poengsum som kan være i stand til å forutsi effektiviteten av et gitt mål sekvens. I hvilken grad slike "on-target" score er pålitelige behov for å bli empirisk bestemt i nevroner og andre celletyper som CRISPR-Cas9 system blir mer allment implementert.

Lentivirus-basert transgene dyr produksjon har vært variabelt vellykket med rapporter om at lentivirus levert transgener bli silenced ^11. CRISPR mediert gen redigering av DNA kan bli ført gjennom kjønnsceller for å generere hele dyremodeller. Dermed kan stabil genomisk redigering være oppnåelig tross taushet av virus levert fluorophores og Cas9 transgener. Dette kan gi en effektiv plattform for målrettet genomiske forandringer. Det virale levering av CRISPR / Cas9 system, samtidig som det ikke krever transgene organismer, er komplementære til disse teknikker. For eksempel, injisere slike viruspartikler til en forbindelse transgene dyr som å indusere uttrykker Cre og Cre avhengig opto- eller chemo-genetiske transgener bør legge til rette for komplekse studier i forholdet mellom genetiske manipulasjoner og neuronal aktivitet. Et annet eksempel er å levere disse Cas9 / sgRNA virale partikler inn i en betinget knockout i et forsøk på å screene for gen-gen-interaksjoner. Til slutt, en annen spennende rute med denne forskningen er screening av fenotyper og terapeutiske forbindelser i pasient avledet celler, noe som kanbrukes til å validere og oppdage genetiske nettverk som er forstyrret i ulike sykdommer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
List of Cell Culture Reagents
293FT cell line	Life Technologies	R700-07	For Lentivirus
293GP cell line	Clontech	631458	For Retrovirus
Iscove's Modification of DMEM (IMDM)	Corning	10-016-CV	Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and  1% P/S
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)	Corning	25-025-CI
L-Glutamine solution, 100x (L-Gln)	Corning	25-005-CI
Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S)	Corning	30-002-CI
Polystyrene 10 cm plate	USA Scientific	CC7682-3394
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-053-CI
List of Transfection Reagents
5 ml polystyrene tubes	Fisher Scientific	352054
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)	Fisher Scientific	C69-500	Make a 2.5 M solution in ddH2O
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3
HEPES	Fisher Scientific	BP2939-100
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	S369-500
2x HEPES Buffered Saline (HBS)			500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-5G
0.22 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLGV033RS
0.45 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLHP033RS
60 cc L/L Syringe	Med-Vet International	MV60CCLL
50 ml Conical Tube	Corning	352098
polyethylene glycol   6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC41678-5000
Donor Horse Serum	Cellgro	35-030-CV
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
10 ml serological pipette	Fisher Scientific	357551
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate	Invitrogen	A21311
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
artificial tear ointment	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
normal saline	Med-Vet International	DYND500MLSH
cotton tipped applicators	Med-Vet International	CTA6
Triple antibiotic ointment	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 silk sutures	Med-Vet International	MV-711