Designing, Packaging, och leverans av hög titer crispr Retro och Lentiviruses via Stereotaxic Injection

Summary

Den crispr / Cas9-systemet ger möjlighet att göra riktad genom att redigera tillgängliga och överkomliga för det vetenskapliga samfundet. Detta protokoll är avsett att visa hur man skapar virus som kommer knockout en gen av intresse med hjälp av crispr / Cas9-systemet, och sedan injicera dem stereotaktiskt i den vuxna musen hjärnan.

Introduction

För att studera grundval av normal fysiologi och sjukdomspatologi, finns det ett behov att exakt manipulera genuttryck i modellorganismer. För däggdjursmodellorganismer, är detta till stor del inriktad på skapandet och utvecklingen av transgena möss, där en genetisk element av intresse flankeras av platser som känns igen av ett rekombinas. Detta kan resultera i en lägesspecifik manipulation av dessa flankerade gener. Även om detta har varit en framgångsrik strategi, är det dags och resurskrävande; till exempel skapa en trippel transgent djur som skulle uttrycka en floxed gen, Cre rekombinas och en Cre reportergen kräver flera parningar och validering. I motsats härtill stereotaxic injektion av replikering defekta virala partiklar som kodar för ett fluorescerande protein och rekombinaset till en floxed gen djur inte kräver komplex genotypning eller avelsstrategier ^1. Vidare, om ett fluorescerande protein och Cre uttryckande virus är sam-injiceras med ett andra virus Encoding en annan fluorescerande protein, då detta ger en inom-vävnadskontroll för målinriktad genetisk manipulation. Även om denna strategi kräver fortfarande användningen av knock-in djur, viralt medierade RNA baserade strategier kringgå behovet av transgena djur. Till exempel, kan stereotaxisk injektion av replikationsdefekta virus som kodar för ett fluorescerande protein och en kort hårnål RNA (shRNA) använd endogen maskiner cellens RNAi för att resultera i en potent reduktion av transkriptet av en gen av intresse. Men shRNA strategier producera subtila gen knock-downs ofta resulterar i måttliga cellulära fenotyper ^2. Medan en knock-down kan vara mer fysiologiskt relevant för heterozygot gen dysfunktion, dess minskade robusthet jämfört med en knock-out är inte idealiskt för fenotypisk upptäckten av nya gener.

En tredje teknik som nyligen har dykt upp, den crispr (Clustered regelbundet mellanrum Kort palindrom Repeat) / Cas9 (crispr associeradeprotein 9) system förlitar sig på uttrycket av både en liten exogen RNA och ett DNA-skärande enzym. Den crispr / Cas9 systemet anpassades från den prokaryota immunsystemet som utvecklades en metod för att identifiera främmande, invaderande DNA från virus och inrikta den för nedbrytning via Cas9 enzymet ^3,4. Denna kraftfulla genom redigering teknik kan användas för att skapa riktade deletioner, insättningar och mutationer; och följande protokoll kommer att beskriva hur man gör strykningar i en gen av intresse för att knockout sitt uttryck in vivo. Den Cas9 enzymet måste uttryckas med en guide-RNA homolog med regionen av intresse och sammanhängande med en byggnadsställning RNA. Knockout av en gen med hjälp av denna teknik kräver inriktning Cas9 till en specifik region i genomet med användning av syntetiska styr RNA (sgRNA), och förmå dubbelsträngade avbrott (DSB) vid ett område av intresse. Dessa DSB sedan repareras av den endogena cell reparation maskiner via icke-homolog slut sammanfogning (NHEJ) som leannons InDels som kan ge missense eller nonsensmutationer och kan därför skapa en förlust av funktionell proteinuttryck ^5. Eftersom detta system producerar genomiska förändringar, endast kräver den övergående uttryck av Cas9 och sgRNA. Emellertid är det önskvärt att en stabil fluorescerande indikator för att identifiera celler och deras avkomma manipulerade på detta sätt.

Lenti- och retrovirus har fördelen att stabilt integrera DNA av intresse i värdceller som bibehåller långsiktig expression och går i arv till dotterceller under mitos. Detta protokoll beskriver konstruktion och produktion av två typer av replikationsdefekta, hög titer retrovirus: humant immunbristvirus härledda lentivirala partiklar (lentivirus) och de grundar sig på murin Maloney leukemivirus (retrovirus). Även om båda av dessa virus är kapabla att stödja stabil uttrycka av stora transgener kan retroviruspartiklar bara integreras i genomet during celldelning med nedbrytningen av kärnhöljet, och kan därför användas som ett verktyg för att märka och födelsedatum celler ^6. Medan lentivirus har ett rykte om att vara relativt låg titer ^7, denna metod, inklusive användning av koffein ⁸ under viral samling, producerar rutinmässigt titrar av 10 ⁹ och 10 ¹⁰ partiklar / ml. En annan fördel med lenti- och retrovirus är toleransen för mycket stora insatser. Följande samling av protokoll beskriver förfarandet för att utforma ett lenti eller retrovirus som kodar för en fluorescerande reporter, sgRNAs och Cas9 att utnyttja crispr / Cas9 systemet för att modifiera DNA samt uttrycker ett fluorescerande protein.

Mus stereotaktisk neurokirurgi är en värdefull metod för att injicera virus in vivo för att studera morfologi, funktion och anslutning av infekterade nervceller. Viral infektion i neuroner kan användas för att manipulera expressionsnivåer över en förlängd period av time, såsom genom hela utvecklingen, och uttryck kan styras exakt genom användning av olika läkemedels inducerbara system och specifika Cre driven expression. Denna speciella protokoll förklarar hur man injicerar en virus som uttrycker en sgRNA och Cas9 att knockout en gen av intresse i hjärnan hos en vuxen mus. Möss återhämta sig mycket snabbt från detta förfarande och expression av den virala transgenen kan ses inom 48 timmar efter injektion. Dock verkar fluoroforen uttryck att öka under loppet av veckor resulterar i nära maximala nivåer av 3 veckor efter infektion. Möss som genomgår viral stereotaxisk injektion kan användas för uppförande, elektrofysiologi, eller morfologiska studier. Totalt sett är syftet med dessa förfaranden för att visa hur man knockout en gen i den vuxna musen hjärnan med hjälp av stereotaktisk kirurgi och ett virus som uttrycker en specifik sgRNA och Cas9.

Protocol

Etik uttalande: Alla protokoll godkändes av Dartmouth Institutional biosäkerhet och Institutional Animal Care och användning kommittén prövningsnämnder.

1. Protokoll för att utforma en Guide Strand (sgRNA) för crispr / Cas9 Retrovirus

OBS: Det finns många ideella webbplatser som kan användas för att generera sgRNAs att rikta en gen av intresse (https://benchling.com/ och http://crispr.mit.edu/). Målet med detta protokoll är att designa och beställa enkelsträngade oligonukleotider från en kommersiell leverantör som paras med varandra. Detta glödgade oligo kommer att ligeras in i PXL överföringsvek. Se kompletterande video 1 för ett exempel på utforma sgRNAs använder Benchling.

1. Använd en webbplats för att utforma sgRNAs.
   OBS: Till exempel, genom att skriva en kodande / exonic sekvens från nära början av genen av intresse in på webbplatsen kommer att generera en 20 nukleotid sgRNA. Använd 20 nukleotid sgRNA sekvens för att utforma den meningen och antisense-oligos som kommer att beställas för att skapa sgRNA.
2. Efter att generera sgRNA, kopiera denna sekvens i en ordbehandlare. Lägg till en G (guanin) till början av 20 nukleotid sgRNA sekvens i dokumentet om det inte redan börja med en (dvs G-20 nukleotid sgRNA sekvens). Detta är nödvändigt för att säkerställa god transkription av U6 promotorn.
3. Dokumentera det omvända komplementet av detta nu 20-21 nukleotidsekvens. För den meningen oligo, lägg till "CACC" till 5'-änden av sekvensen i dokumentet (dvs CACC-G-20 nukleotid sgRNA sekvens). Detta överhäng kommer att användas för att ligera den sekvens i PXL vektorn.
4. För antisens-oligo, till AAAC till 5'-änden. Använd denna överhäng att ligera sekvensen i PXL vektorn.
5. Skaffa sense och antisense oligos. Efter att ha mottagit oligos, göra 100 iM lager med hjälp av DNAse fritt vatten. Blanda 10 pl vardera av de 100 iM sense- och antisense oligos med 4 μyl 10X NEB buffert 2, och 16 pl vatten.
   OBS: De behöver inte sida rening eller 5'phosphorylation (som Bbsl överhäng är icke-kompatibla kohesiva ändar).
   1. Sätta 200 ml vatten till en koka i en 500 ml bägare och sedan flyta röret med denna blandning i en skum "floater" hållare. Låta vattnet långsamt svalna från 95 ° C under 2 h vid rumstemperatur.
   2. Späd nu glödgade-oligo mix 1: 1000 i sterilt vatten och använda direkt i följande ligation eller förvara resterande reaktionen vid -20 ° C.
6. Digest PXL, ett PX330 vektor-derivat, med Bbsl restriktionsenzymet vid 37 ° C under 2 h. Använd en 40 pl reaktion innehållande 2 pg av PXL, 4 pl 10x NEB buffert 2, 1 pl Bbs1 och resten vatten. Utsätta det rötas-pxl rutin gel rening med användning av ett kommersiellt kit. Se till att avkastningen är ~ 8,5 kB produkt.
7. Med hjälp av en kommersiell ligeringssats, ligera 1 pl av 1: 1000hybridiserade-oligos med 50 ng diger och gelrenades-PXL. Omvandla ligeringsprodukten i kompetenta rekombination bristfällig E. coli (NEB 5-alfa, subkloning effektivitet). Sikta de transformanter med avseende på närvaron av den korrekta guide av plasmid-DNA-sekvensering.
8. Smälta U6, guide-sträng, och RNA ställningselementen (sgRNA) ur PXL med användning BstB1 och Pac1 restriktionsenzymer och ligera in i den fluorescerande protein-T2A-Cas9 virala ryggraden digererades med samma restriktionsenzymer. Omvandla ligeringsprodukten (NEB 5-alfa maximal effektivitet). De fluorescerande protein-T2A-Cas9 viral backbone plasmider är litet antal kopior plasmider och därmed låga kopieringsprotokoll måste användas.
   ANMÄRKNING: En andra sgRNA kan på liknande sätt införas genom Pacl-digerering av en annan PXL styr sträng plasmid och ligerades in i Pac1 digererad och kalv-intestinalt fosfatas behandlad virus ryggrad som redan innehåller den första styr strängen. Fosfatasbehandling av den virala överförings plasmiden kommer att hjälpaminska antalet transformanter från självligering av plasmider som inte innehåller det andra styr.
9. Sekvens kontrollera den slutliga plasmiden och maxi prep hjälp av Nucleobond Xtra maxi prep kit och förpacka den i ett virus med hjälp av följande "Protokoll för Retro / Lentiviral Produktion - CaPO4 Method".

2. Förbered 293FT / 293GP celler för transfektion (Retro / Lentiviral Produktion - CaPO4 Method)

1. (Dag 1) Snabbt tina en injektionsflaska med celler per 10 cm cellodlingsplatta i en 37 ° C vattenbad. För Lentiviral förpackningar, använder 293FT celler. För retroviral förpackningar, använd 293GP (gag / pol-celler).
2. Pipettera alla av de upptinade-celler från kryo röret i ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 2 ml av förvärmda CO ₂ ekvilibrerad-komplett Iscoves Modified Dulbeccos Medium.
3. Centrifugera cellerna under 5 min vid 500 xg för att pelletera. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml Completecove Modified Dulbeccos Medium. Plate cellerna på en 10 cm cellodlingsskål. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C i en 5% koldioxidinkubator.
4. (Dag 2) 24 h efter plätering, byta media på plattan genom att aspirera de befintliga media och tillsats av 10 ml av förvärmda Iscoves modifierade Dulbeccos medium till plattan.
   1. (Dag 3-4) 24-48 h efter mediaändring och när cellerna blir konfluenta, dela upp cellerna till en sammanflytning av 2,5-3,0 x 10 ⁶ celler / platta (10 cm platta).
   2. Att dela upp cellerna, aspirera media och tvätta plattan med 5 ml PBS. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin till plattan och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lyft av plattan. Tillsätt 0,5 ml av Iscoves modifierade Dulbeccos medium för att neutralisera 0,25% trypsin reaktion och pipettera cellerna in i ett 1,5 ml rör.
   3. Snurra cellerna vid 500 xg under 5 min. Resuspendera cellerna i 1 ml Iscoves modifierade Dulbeccos medium. Späd 1081; l av celler i 90 | il PBS. Räkna celler med användning av antingen en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Re-platta 2,5-3,0 x 10 ⁶ celler / platta med komplett Iscoves modifierade Dulbeccos medium.
      OBS: Celler kommer att vara ~ 50% konfluenta 24-34 timmar efter plätering. Transfektera cellerna när de är ~ 50% konfluenta.

3. (Dag 5) CaPO4 transfektion och viral partikel Collection

1. Ändra media 2 h före transfektion genom att aspirera de befintliga media och tillsats av 10 ml av pre-warmed Iscoves Modified Dulbeccos Medium. Se till att det är exakt 10 ml av media i 10 cm platta.
2. Förbered transfektion reagens för 2 rätter med 2, 5 ml rundbottnad polystyrenrör. Märk det första röret "DNA" och det andra röret "2X HBS". Justera koncentrationen av DNA till 1 pg / pl i Tris-EDTA vid pH 7,4.
   1. För lentivirus, långsamt tillsätt 20 pl överföringsvek (Viral konstruktion av intresse), 13 pl CMVdelta8.9, 9 il VSV-g, 860 pl molekylärbiologi grad _H2O, och 100 pl 2,5 M _CaCl2 till det första röret ( "DNA") under kontinuerlig gäng på röret för att blanda.
   2. För retrovirus, utelämna CMVdelta8.9 plasmiden. Tillsätt 20 ^ il överföringsvektor, 15 | j, l VSV-g, 860 | j, l Molecular Biology Grade _H2O, och 100 | j, l 2,5 M _CaCl2 till röret märkt "DNA".
   3. Tillsätt 1 ml 2x HEPES-buffrad saltlösning (pH 7,0; detta pH är helt avgörande) till röret märkt "2X HBS".
   4. Tillsätt långsamt de 1 ml innehållet i "DNA" röret till "2X HBS" rör, en droppe i taget. Kontinuerligt trycka på "2X HBS" rör med index eller långfinger samtidigt lägga innehållet i "DNA" rör. Observera uppenbara Capo ₄ vesiklar efter varje droppe. Inkubera röret i mörker under 30 min vid rumstemperatur.
3. Tillsätt 1 ml av transfektion i långsamma droppar till varje 10 cm cellplattan, sedan inkubera över natten vid 37 ° C.
4. (Dag 6) Ersätt media med 8 ml av Iscoves modifierade Dulbeccos medium + 0,5% FBS och 40 mg koffein / 100 ml medium. Om överföringsvektor innehåller en fluorescerande markör, då fluoroforen uttryck tyder på en lyckad transfektion.
5. (Dag 7) Samla media som innehåller viruspartiklar med hjälp av en 10 ml serologisk pipett och fördela i en 50 ml koniska rör. Lagra 50 ml koniskt rör vid 4 ° C. Tillsätt 8 ml av 0,5% FBS-medium till varje platta.
   1. (Dag 8) Återigen, samla in media som innehåller viruspartiklarna och kombinera med den föregående dagens skörd i 50 ml koniska rör.

4. Koncentration och rening av virus

1. Gör en 5x polyetylenglykol 6000 lösning genom att tillsätta 40% polyetylenglykol 6000 och 1,5 M NaCl till DDH ₂ O. Autoklavera lösningen påvätskecykel under 45 min vid 121 ° C. Sakta blanda lösningen vid kylning.
   OBS: Lösningen kommer att börja grumlig och sedan att framgå när den svalnar.
2. Centrifugera 50 ml koniska rör som innehåller både samlingar av viral supernatant vid 2000 xg under 10 min för att pelletera olösligt material. Rena viral media genom filtrering genom ett 0,45 um låg proteinbindning sprutfilter (PES eller PVDF).
3. Lägg till 5x polyetylenglykol 6000 lösning media (Den slutliga koncentrationen ska vara 8% polyetylenglykol 6000 och 0,3 M NaCl). Blanda genom att vända röret flera gånger (inte vortex). Inkubera det virala innehållande polyetylenglykol-lösning vid 4 ° C under 12 eller fler timmar, återblandning då och då.
4. (Dag 9) Centrifugera det virala innehållande polyetylenglykol-lösning vid 2500 xg under 45 min. Avlägsna och kassera supernatanten och snurra igen i 2 minuter. Återigen, ta bort och kasta supernatanten.
5. Suspendera pelleten genom att tillsätta 320 plsteril fosfatbuffrad saltlösning (320 pl är ^{1/100: e} av den ursprungliga volymen av virusinnehållande media som samlats in) och inkubera över natten vid 4 ° C. Eventuellt, suspendera pelleten vid rumstemperatur på en rocker under 30 min.
6. Efter återsuspendering av pelleten, alikvot viruset (5-10 ^ il per 0,5 ml rör) och frys alikvoter vid -80 ° C (frys upptining eller lagring vid 4 ° C kommer att dramatiskt minska titern).
7. Titrera virus med hjälp av standardprotokoll, dvs utföra en spädningsserie på en 6-brunnar av HEK293T celler och manuellt räkna fluorescerande kolonier 48 timmar senare.

5. Testa Effektivitet av crispr Virus

OBS: Sekvens kloner med hjälp av följande steg för att testa för produktion av dubbelsträngbrott repareras av NHEJ hjälp av musen Neuro2A celler. Detta har den fördelen framför lantmätare analyser i det att den kan användas för att bestämma den procentuella andelen av celler som har modifierats och artenav de InDels följd av NHEJ.

1. Coat en 3,5 cm cellodlingsskål med en gelatinös proteinblandning såsom matrigel utspätt 1:50 i Iscoves modifierade Dulbeccos medium och inkubera i 30 min vid 37 ° C. Aspirera geléform proteinblandningen och plattan Neuro2A celler.
2. Efter de Neuro2A cellerna når 50% konfluens, tillsätt crispr Lentivirus eller Retrovirus vid en multiplicitet av infektion av 10 (dvs 10 viruspartiklar per cell).
   OBS: Neuro2A celler inte som amiable för infektion som är HEK293-celler, vilket således, en enda infektion kommer inte att resultera i 100% av cellerna är infekterade med lentivirus. Vidare, endast retrovirus infekterar delande celler och därför kommer inte heller att resultera i 100% infektion. För att uppnå en nära 100% frekvens av infektioner, kan tillsats av virus upprepas på flera dagar, dela upp cellerna efter behov. Alternativt kan fluorescerande positiva celler isoleras med användning av fluorescensaktiverad cellsortering. the mest effektiva sättet att uppnå en 100% infektionsfrekvensen med en lentivirus är att utföra en enda infektion följt av FACS isolering. För ett retrovirus, utföra 4-omgångar av infektion 24 timmar isär och följa med FACS isolering för att garantera 100% infektion.
3. Efter infektera cellerna i en vecka, expandera cellerna till nära sammanflödet på en 10 cm platta, aspirera media och tvätta plattan med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lyft av plattan. Tillsätt 0,5 ml av Iscoves modifierade Dulbeccos medium för att neutralisera 0,25% trypsin reaktion och pipettera cellerna in i ett 1,5 ml rör och pelletera cellerna vid 500 xg under 5 min.
4. För att isolera DNA, tillsätt 100 | il av 50 mM kaliumhydroxid, återsuspendera cellerna och inkubera vid 95 ° C under 5 min. Neutralisera lösningen med användning av 10 pl 1 M Tris, pH = 8,0.
5. PCR amplifiera regionen som flankerar det genomiska regionen är målet för den crispr sgRNAmed hjälp av ~ 300 ng av DNA som isolerats i steg 5,5 med hjälp av en high fidelity PCR Master Mix ^4.
6. Kör PCR-reaktionen på en 2,5% agarosgel och gelén rena den lämplig storlek fragmentet med användning av en gel-reningskit, såsom en gel DNA återhämtning kit. Ligera in i en PCR-kloningsvektor som pGEM-t-lätt och förvandlas till kompetenta celler ^9.
7. 24 h senare, tillsätt 2 ml av LB-buljong i en 15 ml rundbottnad rör samt lämpligt antibiotikum (ampicillin, neomycin, etc.). Inokulera röret med en individuell koloni med användning av en steril pipettspets eller slinga för att välja en enda koloni från LB-platta. Expandera och växa kolonin genom att skaka röret vid 250 RPM och 37 ° C under 24 h. Upprepa så många kolonier som önskas.
   1. Med användning av en mini-prep kit, isolera DNA från E. coli och sekvens med primers utformade för att amplifiera det område av genen som är målet för den sgRNA för att analysera Cas9 målregionen av musgenomet.

6. Stereotaxic injektionsprotokollet för den vuxna musen

1. Förbered för kirurgi
   OBS: Det är viktigt att upprätthålla sterila förhållanden under överlevnad operationer. Detta åstadkoms i detta protokoll genom värme sterilisera kirurgi verktyg, med hjälp av Betadine att sterilisera injektionsstället, och lägga antibiotisk salva till snittet platsen efter det är stängt. Det är också viktigt att använda sterila handskar samt en noggrant steriliserad, dedikerad kirurgi område.
   1. Värme Sterilisera kirurgi före användning genom antingen autoklavering eller med varmt pärla autoklav. Förbereda återvinningskammaren och kirurgi område genom att slå på värmedynor för att upprätthålla kroppstemperaturen under operation och återhämtning. Montera borren används för att skapa hål i skallen för injektion.
   2. Last 4 il virus i injektionsnål genom att dra tillbaka viruset direkt från den sterila PCR-rör. Kortfattat bort virala delmängd från is. Behåll viruseti sprutan vid rumstemperatur under inte mer än 1 timme före injektion.

7. Stereotaxic Injektion

1. Kontrollera att ventilationen till operationen svit är öppen för att säkerställa korrekt luftflöde. Förbered musen för kirurgi genom anesthetizing med 4% isofluran i en induktionskammare. Efter anestesi, raka huvudet för att förbereda injektionsstället.
   1. Placera musen i stereotaxic instrument genom att använda pincett för att flytta tunga ner och åt sidan. Sätt bettet bar i munnen tills tänderna falla i facket, sedan säkra örat barer. Se till att kroppen av musen är på värmedyna och nosen är belägen i noskonen. Direkt 4% isofluran i noskonen. Bekräfta anestesi genom att nypa foten med pincett och se till att det inte finns någon startle reflex.
   2. Applicera artificiella tårar för att smörja ögonen. Finish förbereder injektionsstället genom att badda den rakat huvud med omväxlande omgångar av POVidone-jod och lidokain.
2. Med hjälp av en skalpell, skär litet snitt längs mitten av hårbotten. Torka skallen med en bomullstopp och väteperoxid vid behov för att visualisera bregma.
   1. Med hjälp av en dissekera omfattning, lokalisera bregma på skallen och placera borrspetsen på bregma. Noll (eller spela in) digitala stereotaktisk koordinater på x, y och z plan.
   2. För att säkerställa att huvudet är nivån på rostralt kaudala y-axeln, placera borrkronan på lambda och jämna huvudet så att z-koordinaten är ungefär lika på både bregma och lambda.
   3. För att se till att huvudet är nivån på x-axeln, placera borrkronan till y = 1/2 lambda. Säkerställa att z-koordinaten är lika på 1 mm på varje sida (x = +/- 1 mm) för den sagittala suturen. Justera skallen om det finns en skillnad i z-koordinat 1 mm till vänster och höger om lambda.
3. Placera borren över önskade koordinaterna. För gyrus dentatus, använder koordinatsy = -1,9 från bregma och x = +/- 1,1. Före sådd, sänka isofluran till 2%, sedan långsamt och försiktigt, borra genom skallen.
   1. Efter borrning alla hål, anbringa ifyllda sprutan stereotaxic instrument. centrum visuellt sprutan över hålet och noll z-koordinaten på skallen.
   2. Långsamt sänka sprutan till djupaste z-djup. För dentate gyrus, z djup är -2,5, -2,4, och -2,3. Påbörja injektion vid en hastighet av 0,25 | il / min med användning av en stereotaxisk injektor.
      1. Efter injektionen är fullständig vid lägsta Z-djup, vänta en minut, sedan höja till nästa samordna och börja injektion igen. Fortsätt detta mönster tills alla z-injektion koordinater injiceras. Vänta två minuter innan du tar bort sprutan efter den sista injektionen.
         OBS: Inga negativa effekter har noterats på vävnaden genom att injicera upp till 2 pl virus per halvklotet i mushjärna.
   3. Upprepa injektionen för andra borrhål.
4. Efter injektion, ta bort musen från stereotaxic instrument och sutur hårbotten med 6-0 silke suturer. Applicera Lidocaine och en antibakteriell kräm på såret.
   1. Injicera 0,8-1,0 ml saltlösning + Ketoprofen (3-5 mg / kg) via IP-väg för att hantera smärta. Placera sedan musen till uppvärmd återvinningskammaren. Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Inte tillbaka djuret till sällskap med andra djur förrän den har återhämtat sig helt.
5. Under dagarna efter operationen, väger musen dagligen och ger mjuk mat och godsaker. Kontrollera såret och notera allmäntillstånd / uppförande.
6. Efter stereotaktisk injektion, kan mössen avlivas för skiva prep elektro ^en eller perfusion och deras hjärnor avlägsnades, skivade, och färgas genom immunhistokemi för analys ^10.

Representative Results

Efter "protokollet för att utforma en Guide Strand (sgRNA) för crispr / Cas9 Retrovirus", oligos riktar en viss sekvens sätts in i PXL kloningsvektom nedströms hU6 promotorn och nedströms av en styr RNA byggnadsställning med hjälp av Bbsl kloningsställena (Figur 1, steg 1). Denna sgRNA är sedan ut från PXL och sattes in i pRubi ryggraden med användning av de BstBI och PacI ställen (Figur 1, steg 2). Slutligen, en annan sgRNA klonad i PXL kan placeras nedströms den första guide i pRubi-Guide1 (figur 1, steg 3), med inriktning annan del av genen och öka chanserna för en knockout via NHEJ. Verifiering av de korrekta konstruktionerna bör bestämmas genom sekvensanalys. När denna konstruktion har gjorts, kan den förpackas i ett virus efter "Protokoll för Retro / Lentiviral Produktions- CaPO4 Method". Framgångsrik förpackning bekräftas genom infektion av virus i HEK293-celler i syfte att titrera virus. Om det inte finns någon fluorofor uttryck då det var sannolikt ett fel under förpackning av viruset.

Figur 2 är ett representativt resultat av 2 retrovirus, ett uttrycker GFP och den andra som uttrycker mCherry, co-injiceras i dentate gyrus av neonatal mus (7 dagar gamla) och avbildas 21 dagar efter injektion. Märkning av nervceller med mCherry eller GFP tillåter morfologisk bedömning av olika genetiska manipulationer i samma vävnad, där ett virus kan uttrycka en crispr / Cas9 medierad KO och det andra ett kontrollvirus, endast uttryckte en fluorofor. Stereotaktisk injektion ger en exakt anatomisk selektivitet, vilket framgår av den diskreta infektion av de avsedda koordinater, dentate gyrus. Vid analys av hjärnsektioner med avseende på infektion, är det viktigt att hålla omgivande vävnaden tills det bestäms att den korrekta anatomiska regionen infekterades. Om det inte finns några tecken på infektion, då är det möjligt att injektionen skedde i en grannregion end kan identifieras i omgivande delar. Det kan också vara till hjälp för att lokalisera nålen spåret att hitta den exakta insprutnings regionen. VSVG pseudotypade virus sällan sprids ut i utkanten av dentate gyrus när det injiceras in vivo, och tenderar att spridas längs rostralt / caudal axeln infektera celler längs hela dentate gyrus, som analyserades med 3D-rekonstruktion (Figur 3).

Figur 1:. Kloningsstrategin för retroviral pRubi-Guide1-Guide2-crispr plasmid Denna strategi är identisk för FU-baserade lentivirala plasmider. sgRNA oligos glödgas och infogades i PXL med användning av de BsbI kloningsställena. Efter sekvensering för att säkerställa att sgRNA framgångsrikt införd i PXL, smälta plasmiden med BstBI och Pacl. Insatsen som släpps ut (svarta lådan) klonas sedan in i den virala tillbaka ben (svart prickade linjer) pRubi-Guide1 crispr. En andra sgRNA kan också sättas in i PXL och diger med hjälp Pacl enzymet. Detta klonas därefter in i pRubi-Guide1 crispr vektor (röda streckade linjer) med användning av Pacl-site. Den resulterande plasmiden innehåller då båda styr strängarna liksom de nödvändiga virala element, promotorer och fluoroforer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Retroviral injektion av mus-dentate gyrus Retroviruses som uttrycker mCherry (röd) eller GFP (grön) injicerades i dentate gyrus av en p7 mus. 21 dagar senare mössen perfusion och hjärnorna snittades och färgades för GFP och mCherry. (A) En 5X brett fält fluorescerande bild visar prBESLUT av gyrus dentatus injektionen och specificiteten märkning dentate gyrus granulat nervceller. Morfologi hippocampus kan ses via Dapi (blå) färgning. Skalstrecket mäter 200 | j, m. (B) En 10X brett fält fluorescerande bild visar att dessa höga titer lentivirus infektera ett stort antal celler vars morfologi kan nås via fluorofor uttryck. Skalstrecket mäter 100 | j, m. (C) Virus som uttrycker GFP eller mCherry var co-injiceras i dentate gyrus. Med hjälp av ett system av retrovirus, kan man använda ett virus för att göra en genetisk manipulation präglas av GFP och annan manipulation präglas av mCherry, och sedan bedöma enskilda eller additiva förändringar på grund av varje virus. Skala bar mäter 10 mikrometer.

Figur 3:. Anatomiska spridning av Lentiviral injektion Stereotaxic saminjektion av en GFP-shPten viruset och en mCherry kontrollvirus in i hjärnan hos en vuxen PTEN ^{loxP / +} mus resulterade i en viral spridning längs hela rostral / caudal axeln av gyrus dentatus av hippocampus. Detta visas i en 3D-rekonstruktion av omfattningen av injektion som stängde konturerna av viral spridning spårades över 21 seriesnitt (Z = 50 um / avsnitt) med återuppbyggnadsprogram. Kontur kurvor sedan i linje för att generera 3D-bilder för volym kvantifiering. Totalt viral spridning visas i grönt (volym = 54.730.800 pm ³⁾ och dentate-lokaliserade spridningen visas i lila (volym = 27.275.200 pm ^3). Viruset sprids längs nålen spåret och corpus callosum vid skärningen av nålen banan i tillägg till att fylla den rostrala / kaudala axel hos dentate gyrus. Skalstrecket mäter 200 | j, m.

les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
Kompletterande Video 1. Design av sgRNAs att klona in retroviral och Lentiviral ryggrad.
I denna syntetiska styr RNA (sgRNA) konstruktion exempel är den genomiska sekvensen av mus CHD8 ned från NCBI. Startkodonet och exon struktur sedan visualiseras i Vector NTI. Detta tillåter oss att kopiera iska regionen runt den första kodande exonen och ange denna sekvens i Benchling. Benchling tillåter oss att visualisera alla potentiella sgRNAs i regionen. Vidare, efter anger genomregion vi har ingång kommer Benchling visa oss på mål och off-target poäng för varje styr RNA. Användaren kan sedan välja styr RNA med de högsta on-och off-target poäng. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Det finns några viktiga steg som är viktiga för en framgångsrik viral förpackningar. Cell hälsa är avgörande före och under transfektion, som sjuka celler kommer att kraftigt minska mängden virus som produceras. Om transfektion och förpackningen är framgångsrika, då 100% av cellerna ska uttrycka fluoroforen och cellerna bör utgöra en funktionell syncytium. I steg 3.2.4, knacka på röret är nödvändig för hög-titer transfektion effektivt, och pH för den HEPES-buffrad saltlösning måste vara exakt. Maxi-preps som producerar plasmiderna som är nödvändiga för viral förpackningar måste vara extremt ren. Till denna punkt, är det till hjälp att etanol utfälla den slutliga DNA-eluering och återsuspendera i Tris-EDTA-buffert. Det är också mycket viktigt att minska mängden serum till 2% eller mindre i media som innehåller koffein som tillsatts till Dag 6 (steg 3,4) innan viral samlingen. Om serumet inte minskas, då det slutliga renade viruset kommer att innehålla en oönskad mängd serum protein. Användningen av polyetylenglykol 6000 när utfällning av virala partiklar utesluter nödvändigheten av ultracentrifugering. Det är också viktigt att notera att de Cas9 crispr innehållande virus har typiskt en titer cirka 10 gånger mindre än virus enbart innehållande en fluorofor.

För stereotaxic kirurgi, användning av inhalerat anestesi tillåter snabb och exakt kontroll eller djurets medvetande jämfört med injicerbara narkosmedel och tillåter anestesi över ett större åldersintervall. Det är mycket viktigt att hålla de kirurgiska instrumenten rena och sterila, och reproducerbar målinriktning kräver exakt positionering av huvudet. Se till att det inte finns någon pitching eller rullning av huvudet i stereotaxic instrument och att skallen känns stadigt på plats. Kan det vara användbart att låta skallen för att torka för att finna suturerna för att bestämma de stereotaxic koordinater. Dessutom bör hastigheten och volymen för varje stereotaxisk koordinat bestämmas empiriskt.

Denna teknik är begränsande i att spridningen av en lenti- eller retrovirus är begränsad, särskilt jämfört med adenoassocierade virus (AAV) .Därför, dessa virus är värdefulla när infektera en diskret hjärnregion, men inte för övergripande infektion associerad med AAV används för beteendeanalys hos djur. Användningen av koffein i detta protokoll ökar kraftigt titer av dessa virus, men de är fortfarande inte lika höga som de titrar som uppnåtts i AAV förpackning. Dessutom är stabil integration endast en fördel med fluorofor uttryck, som crispr / Cas9 bildar stabila genomiska redigeringar även när transfekterades transient och det är möjligt att den pågående uttryck av Cas9 och sgRNA kan så småningom producera off rikteffekter. Den övergående uttryck crispr / Cas9 systemet med AAV är tillräcklig för att ge genomiska förändringar som fortplantas genom celldelningar, dock fluoroforen uttrycket inte upprätthållas.

Skapande av lenTi- och retrovirus utnyttjar crispr / Cas9 systemet kommer att bibringa förmågan att rikta någon ny gen i en stor mångfald av organismer. Effektiviteten av gen redigering förefaller vara beroende på sekvensen av styr RNA targeting den Cas9 klyvning. Det har empiriskt bestämts att mellan 10% och 80% av klonerna innehåller InDels efter sekvense infekterade Neuro2A celler. Det är för närvarande okänt om Indel frekvenser beräknade i Neuro2A celler reflekterar dem i nervceller. Guide RNA design mjukvara som Benchling inkluderar nu en "on-mål" poäng som kan kunna förutsäga effektiviteten av en given målsekvens. I vilken grad sådana "on-mål" poäng är tillförlitliga behöver bestämmas empiriskt i nervceller och andra celltyper som crispr-Cas9 systemet blir mer allmänt genomförts.

Lentivirus-baserad transgen djurproduktion har varit löst framgångsrik med rapporter om att lentivirus levererade transgener blir silenced ^11. Crispr medierad gen redigering av DNA kan föras genom könscellinjen för att generera hela djurmodeller. Sålunda kan stabil genomisk redigering kunna uppnås trots tysta virus levererade fluoroforer och Cas9 transgener. Detta kan ge en effektiv plattform för riktade genomiska förändringar. Den virala leverans av crispr / Cas9-systemet, utan kräver transgena organismer, är ett komplement till dessa tekniker. Till exempel injicera sådana viruspartiklar till en förening transgent djur som inducerbart uttrycker Cre och Cre beroende optoelektroniska eller cellgifter-genetiska transgener bör underlätta komplexa studier i förhållandet mellan genetiska manipulationer och neuronal aktivitet. Ett annat exempel är att leverera dessa Cas9 / sgRNA viruspartiklar i en villkorad knockout i ett försök att screena för genen-gen interaktioner. Slutligen är en annan spännande väg av denna forskning screening av fenotyper och terapeutiska föreningar i patient härledda celler, som kananvändas för att validera och upptäcka genetiska nätverk som störs i olika sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
List of Cell Culture Reagents
293FT cell line	Life Technologies	R700-07	For Lentivirus
293GP cell line	Clontech	631458	For Retrovirus
Iscove's Modification of DMEM (IMDM)	Corning	10-016-CV	Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and  1% P/S
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)	Corning	25-025-CI
L-Glutamine solution, 100x (L-Gln)	Corning	25-005-CI
Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S)	Corning	30-002-CI
Polystyrene 10 cm plate	USA Scientific	CC7682-3394
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-053-CI
List of Transfection Reagents
5 ml polystyrene tubes	Fisher Scientific	352054
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)	Fisher Scientific	C69-500	Make a 2.5 M solution in ddH2O
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3
HEPES	Fisher Scientific	BP2939-100
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	S369-500
2x HEPES Buffered Saline (HBS)			500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-5G
0.22 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLGV033RS
0.45 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLHP033RS
60 cc L/L Syringe	Med-Vet International	MV60CCLL
50 ml Conical Tube	Corning	352098
polyethylene glycol   6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC41678-5000
Donor Horse Serum	Cellgro	35-030-CV
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
10 ml serological pipette	Fisher Scientific	357551
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate	Invitrogen	A21311
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
artificial tear ointment	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
normal saline	Med-Vet International	DYND500MLSH
cotton tipped applicators	Med-Vet International	CTA6
Triple antibiotic ointment	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 silk sutures	Med-Vet International	MV-711