Summary
Este trabajo describe un protocolo de diferenciación in vitro para producir, melanocitos maduros pigmentadas a partir de células madre pluripotentes humanas a través de una cresta neural y melanoblasto etapa intermedia usando un protocolo sin alimentador de 25 días.
Introduction
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) proporcionan una plataforma para imitar diferenciación normal de una manera escalable para el modelado de la enfermedad, la detección de drogas y terapias de reemplazo celular 1-6. De particular interés, hPSCs abren nuevas vías para el estudio difícil de aislar o tipos de células raras / transitorios en los cuales las muestras de pacientes son escasos. Las células madre pluripotentes Además, inducidas (células iPS) permiten a los investigadores para estudiar el desarrollo y modelado de la enfermedad de una manera específica del paciente para desentrañar los mecanismos únicos 1,2,7-11. El protocolo previamente publicado para la diferenciación de melanocitos de hPSCs requiere hasta 6 semanas de diferenciaciones e implica el cultivo de células con medio condicionado de células L-Wnt3a 12. El protocolo presentado primero por Mica et al. Y descrito aquí produce células pigmentadas en tres semanas y elimina la ambigüedad e inconsistencias asociadas con medio condicionado.
ar melanocitose derivado de la cresta neural, una población migratorio de las células únicas de los vertebrados. La cresta neural se define durante la gastrulación y representa una población de células en el borde de la placa neural, en la frontera entre el neural y ectodermo no neural. Durante tubo neural, el tejido nervioso se desarrolla a partir de una placa neural para formar pliegues neurales, que convergen en la línea media dorsal, dando como resultado el 13,14 tubo neural.
Las células de la cresta neural emergen de la placa de techo del tubo neural, frente a la notocorda, y se someten a una transición epitelial a mesenquimal antes de migrar de distancia para dar lugar a una población diversa de células diferenciadas. El destino de las células de la cresta se definen en parte por la localización anatómica de la placa de techo a lo largo del eje del cuerpo del embrión. derivados de células de la cresta neural incluyen linajes característicos tanto de mesodermo (células de músculo liso, osteoblastos, adipocitos, condrocitos) y las células del ectodermo (melanocitos, Schwann cells, neuronas) 14. las células madre de la cresta neural upregulate el factor de transcripción SOX10 y se pueden aislar por fluorescencia de células activadas por la clasificación con anticuerpos frente a p75 y HNK1.
Las células de la cresta neural predestinadas a convertirse en melanocitos pasan por una etapa melanoblasto y regular al alza KIT y MITF (factor de transcripción asociado con microftalmia) 6,21 MITF es un regulador maestro de desarrollo de melanocitos y es un factor de transcripción responsable de controlar gran parte del desarrollo de melanocitos 22- 24. melanoblastos humanos migran a la capa basal de la epidermis donde residen ya sea en el bulto de pelo o rodeado por los queratinocitos en la epidermis (unidades formadoras de pigmentación) para servir como precursores de los melanocitos maduros, pigmentadas. La diferenciación y la maduración de melanoblastos en melanocitos pigmentados se produce concomitante con la colonización del bulbo piloso y la expresión de la vía de la producción de melanina (TYRP1, TYR, OCA2 yPMEL) 25,26.
El aislamiento de melanocitos humanos y melanoblastos de pacientes es caro, difícil y limitando en cantidad. Este protocolo permite a los investigadores para diferenciar hPSCs (inducido o embrionaria) en los melanocitos o precursores de melanocitos en un método bien definido, rápido, reproducible, escalable y de bajo costo y sin la clasificación de células. El protocolo fue utilizado anteriormente para identificar defectos específicos de la enfermedad, cuando la diferenciación de células iPS de pacientes con trastornos de la pigmentación.
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Protocol
NOTA: El protocolo de melanocitos esbozado aquí se demostró por primera vez por Mica et al.
1. Preparación del medio de cultivo, recubierto Platos y Mantenimiento de hPSCs
- Preparación medio
Nota: tienda de todo medio a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Filtrar todo el medio para la esterilización.- Preparar DMEM / 10% de FBS. Mezclar 885 ml de DMEM, FBS 100 ml, 10 ml de penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-Glutamina. Filtro para la esterilización.
- Preparar células madre mediano. Mezclar 800 ml de DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-Glutamina, 10 ml de solución de aminoácidos esencial mínimo MEM, 1 ml de ß-mercaptoetanol, y 5 ml Pen / Strep. Después de filtrar añadir 10 ng / ml de FGF-2.
- Preparar medio KSR-diferenciación: Mezclar 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml mínimo solución MEM aminoácidos esenciales y 1 ml β-mercaptoetanol. Filtro para la esterilización.
- Preparar medio N2-diferenciación. Disolver 12 g de DMEM / F12 i en polvon 980 ml dH2O Añadir 1,55 g de glucosa, 2 g de bicarbonato de sodio y 100 mg apo transferrina humana. Mezclar 2 ml dH2O con la insulina humana de 25 mg y 40 l de NaOH 1 N; Una vez disuelto, añadir la mezcla al medio. Añadir 100 l de dihidrocloruro de putrescina, selenito de 60 l, 100 l de progesterona. Llevar el volumen final a 1 l con dH 2 O antes de filtrar.
- Para preparar el medio de melanocitos completa. Combinar 50% de medio Neurobasal, 30% de DMEM bajo de glucosa, y 20% MCDB201. Para este complemento: 0,8% ITS +, 250 nM de L-glutamina, 100 mM de ácido ascórbico (L-AA), 50 ng / ml toxina del cólera, 50 ng / ml SCF, 0,05 M de dexametasona, 100 nM EDN3, 4 ng / FGF2 ml . Filtro estéril a continuación, añadir los reactivos restantes: 2% del suplemento B27, 25 ng / ml BMP4, CHIR99021 3 M, 500 M de cAMP.
- El recubrimiento de placas de cultivo
- Llevar a cabo el recubrimiento utilizando proteína gelatinosa, como Matrigel. Tras la apertura, alicuotar y congelar Matrigel en 1 ml de partes para evitar la congelación descongelación c repetitivoycles. Descongelar y volver a suspender una alícuota de 1 ml congelado con 19 ml de DMEM / F12. Plate 5 ml en una placa de 10 cm. Incubar los platos durante 1 hora a RT. Aspirar la proteína gelatinosa inmediatamente antes en placas de las células y se lavan con DMEM / F12.
- Llevar a cabo mediante recubrimiento de poli-L ornitina bromhidrato / ratón laminina-I / fibronectina (PO / Lam / FN). Escudo plato con PBS que contiene 15 mg / ml de poli-L ornitina bromhidrato. Incubar O / N a 37 ° C en una incubadora humidificada. Aspirar la solución y lavar las placas tres veces con PBS antes del revestimiento con PBS que contenía 1 mg / ml de ratón laminina-I y 2 mg / ml de fibronectina. Incubar los platos O / N a 37 ° C en una incubadora humidificada.
- Antes de placas células, aspirar la solución y dejar que las placas se sequen completamente y sin la tapa en la campana de cultivo de tejido. Dejar que las placas se sequen durante aproximadamente 10-15 minutos.
Nota: Los platos son secas y listas para la siembra de células cuando las estructuras de cristal aparecen en la superficie de los ojos. el platES pueden mantenerse con PBS que contenía LAM / FN en la incubadora durante dos semanas, siempre que el líquido no se evapora. Las placas se pueden mantener seca a temperatura ambiente durante unos pocos hr.
- Antes de placas células, aspirar la solución y dejar que las placas se sequen completamente y sin la tapa en la campana de cultivo de tejido. Dejar que las placas se sequen durante aproximadamente 10-15 minutos.
- Mantenimiento de hPSCs
Nota: hPSCs se mantienen en el 0,1% de gelatina y fibroblastos embrionarios de ratón mitóticamente inactivadas (MEF) en células madre mediano. Las células se debe dividir cada 6-8 días.- Escudo un plato de 10 cm con 0,1% de gelatina en PBS a temperatura ambiente durante 5 min.
- Descongelar MEFs congelados rápidamente en un baño de agua a 37 ° C.
- Aspirar la gelatina y la placa de las células. MEFs placa a una densidad de ~ 50.000 células / cm 2 en DMEM / 10% de FBS. Incubar a 37 ° MEFs CO / N antes de añadir hPSCs.
- Aspirar el% de FBS DMEM / 10 de la placa preparada MEF, lavar la placa con PBS y añadir 10 ml de células madre-medio con hPSCs. Passage los hPSCs en una proporción de 1: 5/10 dependiendo de la densidad antes de pases.
Nota: Si los hPSCs se descongelan o se pasaron como células individuales, supcomplemento con 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 (Rocki) hasta que el primero paso. - Alimentar a las células frescas diariamente con 10 ml de células madre a mediano.
- Antes de iniciar una diferenciación eliminar cualquier colonias pluripotentes que parecen contener células diferenciadas, bordes irregulares, o centros transparentes 28. Mecánicamente desalojar y aspirar las colonias irregulares con una pipeta bajo una campana de flujo laminar con un microscopio de disección.
2. Chapado de hPSCs en el diferencial
Nota: Se describen las condiciones de diferenciación para platos de 10 cm.
- Preparar 10 cm platos Matrigel antes de iniciar la diferenciación como se describe en el paso 1.3.1.
- Cuando chapado hPSCs para una diferenciación comienzan con un plato de hPSCs a una densidad listo para el paso (~ 80% de confluencia) aspirar el hESC-medio, lavar con PBS y añadir 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a las células.
- Agitar enérgicamente el plato horizontally durante 2 minutos mientras se visualiza bajo el microscopio hasta los MEFs levante fuera como células individuales. Las colonias HPSC deben permanecer unidos como colonias.
- Aspirar el tripsina después de los MEFs han levantado, pero antes de que las colonias hPSCs desprenden.
- Añadir 10 ml de células madre-medio que contiene 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 de la placa y separar las células pipeteando arriba y hacia abajo sobre las colonias.
- Aspirar la solución de Matrigel de la placa de 10 cm preparada en el paso 2.1 y lavar con DMEM / F12 para eliminar los grumos. La placa de las hPSCs en una proporción de 1: 2 en la placa de Matrigel. Añadir hCME-medio que contiene 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro hasta 10 ml. Se incuba a 37 ° CO / N.
Nota: Este recubrimiento debe dar lugar a aproximadamente 100.000 células / cm 2.
3. Inducción de la diferenciación neuronal
Nota: La diferenciación se debe iniciar (día 0), cuando los hPSCs son 80% de confluencia. Las células pueden ser alimentados diariamente con células madre de medianoque contiene 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 hasta el inicio de la diferenciación.
- En el día 0 y día 1, se alimentan las células con 10 ml de medio KSR-diferenciación que contiene 100 nM LDN193189 y 10 M SB431542.
- En el día 2, se alimentan las células con 10 ml de medio KSR-diferenciación que contiene 100 nM LDN193189, 10 M SB431542 y 3 CHIR99021 M.
- En el día 3, se alimentan las células con 10 ml de medio KSR-diferenciación que contiene 10 mM SB431542 y 3 CHIR99021 M.
- En los días 4 y 5 de alimentación de las células con 15 ml de medio de diferenciación KSR-75% y 25% de medio N2-diferenciación que contiene 3 CHIR99021 M.
Nota: No se alarme al ver una gran cantidad de muerte celular en términos de células flotantes. Esto es normal y de esperarse. - En los días 6 y 7 de alimentación de las células con 15 ml de medio de diferenciación KSR-50% y 50% de medio N2-diferenciación tanto que contiene 3 M CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, y 100 nM EDN3.
- En día 8y 9 de alimentación de las células con 20 ml de medio de diferenciación KSR-25% y 75% de medio N2-diferenciación tanto que contiene 3 M CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, y 100 nM EDN3.
- En los días 9 y 10 de preparar platos PO / Lam / FN como se indica en 1.2.2 para la re-recubrimiento de las células en el día 11.
- En el día 10 las células de alimentación con 20 ml de medio N2-diferenciación que contiene 3 M CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, y 100 nM EDN3.
4. resiembra en las gotas para la especificación NC
- En el día 11 Lam aspirado / FN de las placas preparadas LAM / PO / FN y seque completamente.
- Retire medio de las 11 celdas de día, lavar con PBS y añadir solución de desprendimiento de las células 4 ml como Accutase por placa de 10 cm. Incubar durante 25 minutos a 37 ° C.
- Añadir 5 ml de medio completo de melanocitos al plato y volver a suspender las células pipeteando manualmente arriba y abajo con una pipeta de 10 ml hasta que todas las células se han levantado de la placa. Transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
- girar lalas células durante 5 min a 200 xg y resuspender las células en 2 x 10 6 células por ml en medio completo de melanocitos. Contar las células por medio de la exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro o una técnica equivalente.
- gotitas placa 10 l cerca uno del otro (sin ellos tocar) sobre la vajilla cm PO / Lam / FN 10 secas. Si la placa ha sido suficientemente seca, las gotas deben haber definido bien los bordes y no correr.
Nota: Esto crea un entorno local de alta densidad para las células, que es importante cuando se resiembra de las células, mientras que el mantenimiento de la habitación dentro del plato para la expansión. - Dejar que las gotas permanezcan a temperatura ambiente durante 10-20 minutos para permitir que las células se adhieran, luego poco a poco (no molestar a las células unidas) añadir 10 ml de medio completo de melanocitos. Mueva plato a la incubadora.
5. La ampliación de melanocitos Progenitores
- Seguir alimentando con medio de melanocitos completo cada 2 a 3 días.
Nota: La pigmentación debería empezar a ser visible wentro de grupos de células por el final de la primera semana y llegar a ser muy claro por la segunda semana. Ver el plato sobre un fondo blanco, como una hoja de papel de discernir estos primeros grupos pequeños, oscuros. Las células se vuelven progresivamente más pigmentadas con el tiempo, hasta que la placa entera es uniformemente pigmentada (Ver Figura 2B). - células de paso una vez a la semana en una proporción de aproximadamente 1: 6 (chapado en forma de gotas ya no es necesario en esta etapa). Utilice Accutase para disociar las células y lavar dos veces con medio Neurobasal normal antes de volver a cultivos en un medio completo de melanocitos. Mantener las células en placas de LAM / PO / FN.
Nota: Hemos encontrado que el medio completo de melanocitos es el más adecuado para mantener y expandir células madre y los melanocitos derivados de IPSC. Sin embargo, las células pueden ser brevemente cultivadas en medio M254 disponible en el mercado, pero los medios de comunicación simplificada aumenta el riesgo de las células que mueren y que quitan la placa.
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Representative Results
Este protocolo proporciona un método para derivar, melanocitos maduros completamente pigmentadas de hPSCs en una manera libre de alimentador, costo eficiente y reproducible in vitro. En contraste con los Fang protocolo previamente establecido et al. Para melanocitos derivados de HPSC, el protocolo descrito no requiere medio acondicionado y reduce el requisito de tiempo. El protocolo de Fang et al. Utilizada medio condicionado de una línea celular murina Wnt3a productoras y se llevó hasta 6 semanas para visualizar la pigmentación 6,12. Para el sesgo de las células madre de la cresta neural hacia un destino de melanocitos (melanoblastos), eliminamos los inhibidores de BMP y TGF (LDN y SB, respectivamente) después de un pulso temprana y posteriormente introducimos BMP4 exógenos y EDN3 señalización en el sexto día, mientras que el mantenimiento de la activación de Wnt (CHR) 6. Los melanoblastos resultantes se pueden caracterizar por la expresión de KIT y MITF, así como el mantenimiento de SOX10 expresión 6. Expresión de SOX10 se puede visualizar en las zonas en la placa de cultivo que forman las crestas de día 11 de cultivo (Figura 1B - C).
Después de la inducción melanoblasto, las células se pasan a LAM placas PO / / FN y se alimentaron con medio completo de melanocitos. Este es un medio extremadamente rico que tiene el beneficio adicional de ser selectivo para la población de melanocitos, eliminando la necesidad de cualquier célula fluorescentes activadas por la clasificación 6. Durante la maduración de los melanocitos, la célula regula por incremento los genes de la síntesis de melanina Tyr y TYRP1 manteniendo al mismo tiempo muchos de los genes melanoblasto, incluyendo TYRP2. De células madre Day25 deriva melanocitos mancha apropiada para las proteínas de la producción de melanina y TYRP1 TYRP2 (Figura 2). Este protocolo es robusto y se ha utilizado con la línea de células madre h9 y la mayoría de las líneas de IPSC. Más recientemente, este protocolo se utilizó para reproducir fielmente el ul trastructural características de las enfermedades de pigmentación utilizando líneas de IPSC específicos del paciente 6.
Figura 1. Los pasos críticos en el protocolo de diferenciación de melanocitos células madre derivadas. (A) El esquema de protocolo de diferenciación. KSR: medio KSR-diferenciación, N2: medio N2-diferenciación, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: proteína morfogenética ósea 4, EDN3: endotelina-3, Rocki: Y-27632 dihidrocloruro B - C. Muestra la fluorescencia de GFP imagen (C) de la diferenciación de campo claro (B) y el día 11 antes de la resiembra usando un pSOX10 transgénico: línea de GFP células madre. Las aristas oscuras visibles en las imágenes de campo claro se enriquecen de células SOX10 + que darán lugar a melanoblastos y, finalmente, los melanocitos. cargar / 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. melanocitos y las etapas intermedias. (A) El día 25 las células pigmentadas (derecha) pueden ser fácilmente visualizados y distinguidos a partir del día 11 celdas (izquierda) cuando se sedimentaron. (B) Para el día 20 del protocolo de la cultura contendrá tanto no pigmentados, melanocitos y maduración, melanocitos pigmentados totalmente maduros. (C - D) Los melanocitos pueden ser visualizadas bajo campo claro y tanto la maduración y melanocitos pigmentados totalmente mancha para el TYRP2 marcador melanoblasto / melanocitos. (E - F) Sólo los melanocitos mancha pigmentada para la etapa tardía TYRP1 marcador de melanocitos.obtener = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para la diferenciación de los melanocitos éxito de hPSCs las siguientes sugerencias deben ser tomados en consideración. Primero y ante todo, es esencial para trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. Además, es importante comenzar con pluripotentes, hPSCs totalmente indiferenciadas; si la población de partida contiene células diferenciadas el rendimiento invariablemente dejar que los contaminantes no pueden ser dirigidas hacia los melanocitos e incluso pueden perturbar aún más las células adecuadamente diferenciadores.
Para asegurar que las células mantienen su pluripotencia cuidar a adherirse a las normas bien establecidas para el mantenimiento de células madre; alimentar y el paso regular y preparar a los cultivos para eliminar las células diferenciadas antes de pases. Cuando pases en proteína gelatinosa para la diferenciación es importante que el plato está recubierto adecuadamente para evitar que las células de despegar durante la diferenciación.
La diferencia melanoblastodife- debe iniciarse alrededor de densidad celular 80%; demasiado altas densidades dará lugar a un aumento de la muerte celular, mientras que demasiado bajas densidades afectarán negativamente a la diferenciación. Cuando pases, las células se deben lavar dos veces para eliminar cualquier solución de desprendimiento de las células antes de la siembra. Para maximizar la supervivencia en día 11, es importante paso las células en alta densidad, gotas bien espaciadas que están sin tocar durante 20 min, de modo que las células se agrupan y se adhieren.
Este protocolo es eficaz en la generación de un gran número de melanocitos, y será de gran valor en el estudio de muestras de pacientes humanos de cantidad limitada. Además, como la población de melanocitos PSC-derivado es selectivo y ampliable la población de melanocitos puede ser multiplicado a muy gran número de células, incluso si los rendimientos de diferenciación números bajos o porcentajes de los melanocitos. Iniciando el protocolo con iPSCs abre la posibilidad para el estudio de enfermedades del desarrollo y las muestras de pacientes específicos. una limitation de este protocolo es el hecho de los melanocitos se derivan como monocultivo y sin todos los otros tipos de células presentes que forman su nicho normales in vivo. Además, el protocolo requiere experiencia en cultivo y diferenciación técnicas HPSC. Sin embargo, con la evolución reciente de los productores de campo hPSCs IPSC ha vuelto cada vez más manejable y métodos para el cultivo de hPSCs han convertido en una rutina. Hasta la fecha, el protocolo se ha utilizado en nuestro laboratorio para producir melanocitos de la línea de HES H9, así como de 14 líneas iPS generadas a partir de 5 donantes diferentes.
Mica y col. Utilizado con éxito este protocolo para la derivación de células madre de melanocitos humanos y iPSCs 6. El documento demostró que iPSCs derivadas de pacientes con defectos de pigmentación podrían diferenciarse en melanocitos y el protocolo producen fielmente melanosomas del tamaño y cantidad fenotípica asociada con la enfermedad.
la work se ilustra una de las muchas aplicaciones posibles para el protocolo con el uso de los melanocitos derivados de IPSC para el estudio de mecanismos de la enfermedad y se introduce la posibilidad de aumentar la producción para la detección de drogas 6,29. Es importante destacar que el documento demuestra la robustez y reproducibilidad del protocolo para producir melanocitos de un gran conjunto de líneas hiPSC genéticamente distintas.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses en conflicto para revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación para los investigadores del melanoma de la Fundación Joanna M. Nicolay y por los Institutos Nacionales de Salud en virtud F31 Ruth L. Kirschstein Premio al Servicio Nacional de Investigación. Este trabajo fue apoyado además por subvenciones del NYSTEM y la iniciativa de células madre Tri-institucional (Fundación Starr).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
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