Summary
Detta arbete beskriver ett in vitro differentiering protokoll för att producera pigmente, mogna melanocyter från humana pluripotenta stamceller via en neural crest och melanoblast mellansteg med hjälp av en matarfria, 25 dagars protokoll.
Introduction
Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) tillhandahålla en plattform för att efterlikna normal differentiering i en skalbar mode för sjukdom modellering, drug screening och cellersättningsterapi 1-6. Av särskilt intresse, hPSCs öppnar vägar för att studera svåra att isolera eller sällsynta / gående celltyper där patientprover är knappa. Vidare inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) göra det möjligt för forskare att studera utveckling och sjukdom modellering i en patient specifikt sätt att riva unika mekanismer 1,2,7-11. Det tidigare publicerade protokoll för differentiering av melanocyter från hPSCs kräver upp till 6 veckor av differentieringar och involverar odling av celler med konditionerat medium från L-Wnt3a cellerna 12. Protokollet först presenterades av Mica et al. Och beskrivs här producerar pigmenterade celler i tre veckor och tar bort den tvetydighet och inkonsekvenser i samband med konditionerat medium.
melanocyter are härrör från neural crest, en vandrande population av celler som är unika för ryggradsdjur. Neurallisten definieras under gastrulation och representerar en population av celler vid kanten av det neurala plattan, som gränsar mellan neurala och icke-neurala ektoderm. Under neurulation, utvecklas nervvävnad från ett neuralt platta för att bilda neurala veck, som konvergerar vid ryggens mittlinje resulterar i neuralröret 13,14.
Neurallisten celler ta sig ur takplåten av neuralröret, mittemot notochord, och genomgår en epitelial till mesenkymala övergång innan den vandrar bort för att ge upphov till en mångskiftande population av differentierade celler. Öden de crest celler definieras delvis av den anatomiska lokaliseringen av takplåten längs kroppsaxeln hos embryot. Neurallisten cellderivat inkluderar härstamningar som är karakteristiska för både mesoderm (glatta muskelceller, osteoblaster, adipocyter, kondrocyter) och ektoderm celler (melanocyter, Schwann calnar, neuroner) 14. Neurallisten stamceller uppreglera transkriptionsfaktom SOX10 och kan isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering med antikroppar mot p75 och HNK1.
Neurallisten celler ödesbestämd att bli melanocyter passera genom en melanoblast scen och uppreglera KIT och MITF (mikroftalmi-associerad transkriptionsfaktor) 6,21 MITF är en mästare regulator av melanocyt utveckling och är en transkriptionsfaktor som ansvarar för att kontrollera en stor del av melanocyt utveckling 22- 24. Mänskliga melanoblasts migrera till basalskiktet av epidermis där de bor antingen i håret bula eller omgiven av keratinocyter i epidermis (som bildar pigmente enheter) för att tjäna som föregångare till den mogna, pigmenterade melanocyter. Differentieringen och mognad av melanoblasts i pigmenterade melanocyter sker samtidigt med koloniseringen av hårsäcken och uttryck av melanin produktionskedja (TYRP1, TYR, OCA2 ochPMEL) 25,26.
Isolera humana melanocyter och melanoblasts från patienter är dyrt, svårt och begränsande i kvantitet. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att skilja hPSCs (inducerad eller embryonala) i melanocyter eller melanocytstimulerande prekursorer i en väl definierad, snabb, reproducerbar, skalbar och billig metod utan cellsortering. Protokollet användes tidigare för att identifiera sjukdomsspecifika brister när differentiera iPSCs från patienter med pigmentstörningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: melanocyt protokoll som beskrivs här visades först av Mica et al.
1. Beredning av odlingsmedium, Belagd Porslin och underhåll av hPSCs
- Medium Framställning
Obs: Lagra alla medium vid 4 ° C i mörker i upp till två veckor. Filtrera all medium för sterilisering.- Förbereda DMEM / 10% FBS. Blanda 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep och 5 ml L-glutamin. Filter för sterilisering.
- Förbered hESC-medium. Blanda 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 10 ml MEM minimalt essentiellt aminosyror lösning, 1 ml p-merkaptoetanol, och 5 ml Pen / Strep. Efter filtrering lägga 10 ng / ml FGF-2.
- Förbereda KSR-differentieringsmedium: Blanda 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimalt essentiellt aminosyror lösning och 1 ml β-merkaptoetanol. Filter för sterilisering.
- Förbereda N2-differentieringsmedium. Lös 12 g DMEM / F12 pulver in 980 ml dH 2 O. Lägg 1,55 g glukos, 2 g natriumbikarbonat och 100 mg apo humant transferrin. Blanda 2 ml dH 2 O med 25 mg humaninsulin och 40 pl 1 N NaOH; då den är upplöst, tillsätt blandningen till mediet. Tillsätt 100 pl putrescin dihydroklorid, 60 pl selenit, 100 pl progesteron. Bringa den slutliga volymen till 1 liter med dH 2 O före filtrering.
- Förbered Full melanocyt medium. Kombinera 50% Neurobasal medium, 30% Låg glukos DMEM och 20% MCDB201. Till denna add: 0,8% ITS +, 250 nM L-glutamin, 100 ^ M askorbinsyra (L-AA), 50 ng / ml koleratoxin, 50 ng / ml SCF, 0,05 | iM Dexametason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Sterilt filter sedan lägga återstående reagenser: 2% B27 Supplement, 25 ng / ml BMP4, 3 iM CHIR99021, 500 | iM cAMP.
- Beläggning av odlingsskålar
- Genomför beläggning med hjälp av geléform protein såsom Matrigel. Vid öppning, portion och frys Matrigel i 1 ml delar för att undvika upprepad frysning tina cycles. Tina och återsuspendera en 1 ml fryst alikvot med 19 ml DMEM / F12. Plattan 5 ml på en 10 cm skål. Inkubera skålarna under 1 h vid RT. Aspirera geléform proteinet omedelbart före plätering cellerna och tvätta med DMEM / F12.
- Utför beläggning med hjälp av Poly-L ornithin hydrobromid / mus Laminin-I / fibronektin (PO / Lam / FN). Coat skålen med PBS innehållande 15 | ig / ml Poly-L ornithin hydrobromid. Inkubera O / N vid 37 ° C i en fuktad inkubator. Aspirera lösningen och tvätta plattorna med PBS tre gånger före beläggning med PBS innehållande 1 ^ g / ml mus-laminin-I och 2 | j, g / ml fibronektin. Inkubera skålarna O / N vid 37 ° C i en fuktad inkubator.
- Före utstrykning av celler, aspirera lösningen och låta plattorna torka ordentligt utan lock i vävnadsodling huven. Tillåta plattorna torka i ca 10-15 min.
Obs: Rätterna är torra och redo för cell plätering när kristallstrukturer visas på ytan av ögat. plates kan hållas med PBS innehållande LAM / FN i inkubatorn i två veckor, så länge som vätskan inte förångas. Plattorna kan hållas torkas vid RT i ett fåtal timmar.
- Före utstrykning av celler, aspirera lösningen och låta plattorna torka ordentligt utan lock i vävnadsodling huven. Tillåta plattorna torka i ca 10-15 min.
- Underhåll av hPSCs
Obs: hPSCs hålls på 0,1% gelatin och mitotiskt inaktiverade mus embryonala fibroblaster (MEF) i hESC-medium. Cellerna bör delas varje 6-8 dagar.- Coat en 10 cm skål med 0,1% gelatin i PBS vid RT i 5 min.
- Tina frusna MEFs snabbt i en 37 ° C vattenbad.
- Aspirera gelatin och plattan cellerna. Platt MEFs vid en densitet av ~ 50000 celler / cm 2 i DMEM / 10% FBS. Inkubera MEF vid 37 ° CO / N före tillsats hPSCs.
- Aspirera DMEM / 10% FBS från den förberedda MEF plattan, tvätta plattan med PBS och tillsätt 10 ml hESC-medium med hPSCs. Passage de hPSCs i förhållandet 1: 5/10 beroende på densitet före passage.
Obs: Om hPSCs håller tinas eller passe som enskilda celler, supkomplement med 10 | iM Y-27632 dihydroklorid (Rocki) tills den första passagen. - Mata celler dagligen med färska 10 ml hESC-medium.
- Före start en differentiering ta bort alla pluripotenta kolonier som verkar innehålla differentierade celler, oregelbundna gränser, eller transparenta centra 28. Mekaniskt lossa och aspirera oregelbundna kolonier med en pipett under ett laminärt flöde huva med ett dissektionsmikroskop.
2. plätering av hPSCs för differentiering
Notera: Differentieringsbetingelser beskrivs i 10 cm skålar.
- Förbered 10 cm Matrigel rätter innan differentieringen som beskrivs i steg 1.3.1.
- När plätering hPSCs för en differentiering börjar med en platta med hPSCs vid en densitet redo för passage (~ 80% konfluent) aspirera hESC-mediet, tvätta med PBS och tillsätt 3 ml 0,05% trypsin-EDTA till cellerna.
- Skaka skålen horizontally under 2 min medan visualisera under mikroskop tills MEF lyft som enskilda celler. De hPSC kolonierna ska sitta kvar som kolonier.
- Aspirera trypsin efter MEF har lyft men innan hPSCs kolonierna lossnar.
- Tillsätt 10 ml hESC-medium innehållande 10 | iM Y-27632 dihydroklorid till plattan och lossa cellerna genom pipettering upp och ned över kolonierna.
- Aspirera Matrigel lösning från 10 cm skålen som framställts i steg 2,1 och tvätta med DMEM / F12 för att ta bort klumpar. PLÅT hPSCs vid en 1: 2-förhållande på Matrigel plattan. Lägg hESC-medium innehållande 10 | iM Y-27.632 dihydroklorid upp till 10 ml. Inkubera vid 37 ° CO / N.
Obs! Denna plätering bör resultera i ungefär 100.000 celler / cm2.
3. Induktion av Neural Differentiation
Obs: Differentieringen bör initieras (dag 0) när hPSCs är 80% sammanflytande. Cellerna kan matas dagligen med hESC-medietinnehållande 10 ^ M Y-27632-dihydroklorid tills påbörjar differentiering.
- På dag 0 och dag 1, mata cellerna med 10 ml KSR-differentieringsmedium innehållande 100 nM LDN193189 och 10 iM SB431542.
- På dag 2, mata cellerna med 10 ml KSR-differentieringsmedium innehållande 100 nM LDN193189, 10 iM SB431542 och tre iM CHIR99021.
- På dag 3, mata cellerna med 10 ml KSR-differentieringsmedium innehållande 10 | iM SB431542 och tre iM CHIR99021.
- På dagarna 4 och 5 foder cellerna med 15 ml 75% KSR-differentieringsmedium och 25% N2-differentieringsmedium innehållande 3 | iM CHIR99021.
Obs: Var inte orolig för att se en stor mängd celldöd i form av flytande celler. Detta är normalt och kan förväntas. - Dag 6 och 7 foder cellerna med 15 ml 50% KSR-differentieringsmedium och 50% N2-differentieringsmedium båda innehållande 3 | iM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, och 100 nM EDN3.
- På dagarna 8och nio foder cellerna med 20 ml 25% KSR-differentieringsmedium och 75% N2-differentieringsmedium båda innehållande 3 iM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, och 100 nM EDN3.
- På dagarna 9 och 10 förbereda PO / Lam / FN rätter som anges i 1.2.2 för åter plätering av cellerna på dag 11.
- På dag 10 matarceller med 20 ml N2-differentieringsmedium innehållande 3 iM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, och 100 nM EDN3.
4. omstryka i droppar för NC Specifikation
- På dag 11 aspirera Lam / FN från de preparerade PO / LAM / fn plattor och torka helt.
- Ta mediet från dag 11 celler, tvätta med PBS och tillsätt 4 ml cell lossnar lösning såsom Accutase per 10 cm skål. Inkubera i 25 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 5 ml Full Melanocyte-medium till skålen och återsuspendera cellerna genom att manuellt pipettera upp och ned med en 10 ml pipett tills alla cellerna har lyft från plattan. Överför suspensionen till ett 15 ml rör.
- snurraceller ner under 5 minuter vid 200 xg och suspendera cellerna vid 2 x 10 6 celler per ml i Full Melanocyte medium. Räkna celler med användning av trypanblått-uteslutning på en hemocytometer eller likvärdig teknik.
- Plate 10 pl droppar nära varandra (utan dem röra) på de torkade PO / Lam / FN 10 cm skålar. Om plattan har blivit tillräckligt torkat bör dropparna har väl definierade kanter och inte köras.
Obs: Detta skapar en hög densitet närmiljö för cellerna, vilket är viktigt när omstryka cellerna, samtidigt som utrymme i skålen för expansion. - Tillåta dropparna att stå vid RT under 10 till 20 min för att tillåta cellerna att vidhäfta, därefter långsamt (för att inte störa de vidhäftade celler) tillsätt 10 ml Full Melanocyte medium. Flytta skålen till inkubatorn.
5. Expanderande melanocyt stamfäder
- Fortsätt att mata med full Melanocyte medium var två till tre dagar.
Obs: Pigmente ska börja synas wnom kluster av celler vid slutet av den första veckan och bli mycket tydligt av den andra veckan. Visa plattan över en vit bakgrund, såsom ett pappersark för att urskilja dessa tidiga små, mörka kluster. Celler kommer att bli allt mer pigmenterad över tiden, tills hela plattan är jämnt pigmenterad (se figur 2B). - Passage cellerna en gång i veckan vid ett förhållande på ~ 1: 6 (plätering som droppar är inte längre nödvändigt i detta skede). Använd Accutase att skilja celler och tvätta två gånger med vanligt Neurobasal medium innan åter plätering i Full Melanocyte medium. Behåll cellerna på PO / LAM / fn plattor.
Obs: Vi har funnit att hela Melanocyte mediet är bäst lämpad för att upprätthålla och expandera hESC och iPSC-härledda melanocyter. Däremot kan celler vara kortvarigt odlades i kommersiellt tillgängligt M254 medium men det förenklade medier ökar risken för döende celler och lyft utanför plattan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll ger en metod för att härleda fullt pigmenterade, mogna melanocyter från hPSCs i en matare fritt, kostnadseffektivt och reproducerbart in vitro sätt. I motsats till den tidigare fastställda Fang et al. Protokoll för hPSC-härledda melanocyter, betyder den skisserade protokollet inte kräver konditionerat medium och minskar tidsåtgången. Protokollet Fang et al. Användes konditionerat medium från en WNT3A-producerande murin cellinje och tog upp till 6 veckor för att visualisera pigmente 6,12. För att pressa de neurala crest stamceller mot en melanocyt öde (melanoblasts), vi bort BMP och TGFp-hämmare (LDN och SB respektive) efter en tidig puls och därefter införa exogen BMP4 och EDN3 signalering på dag sex med bibehållen Wnt aktivering (CHIR) 6. De resulterande melanoblasts kan kännetecknas av uttryck av KIT och MITF, såväl som underhåll av SOX10 expression 6. Uttryck av SOX10 kan visualiseras i områden i odlingsskålen som bildar åsar efter dag 11 kultur (Figur 1B - C).
Efter melanoblast induktion, cellerna passe på PO / LAM / fn plattor och matas med Full Melanocyte medium. Detta är en extremt rikt medium som har den ytterligare fördelen av att vara selektiva för melanocyten populationen, vilket eliminerar behovet av någon fluorescensaktiverad cellsortering 6. Under melanocyt mognad, uppreglerar cellen melaninsyntes generna TYR och TYRP1 bibehållen många av melanoblast gener, inklusive TYRP2. Day25 stamcells härrör melanocyter fläck på lämpligt sätt för melaninproduktionen proteinerna TYRP1 och TYRP2 (Figur 2). Detta protokoll är robust och har använts med h9 hESC linjen och över flera IPSC linjer. Senast, var detta protokoll som används för att återge den ul trastructural egenskaper hos pigmente sjukdomar med hjälp av patientspecifika IPSC linjerna 6.
Figur 1. Kritiska steg i hESC-derived melanocyt differentiering protokollet. (A) Differentieringen protokollsystemet. KSR: KSR-differentieringsmedium, N2: N2-differentieringsmedium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: benmorfogenetiskt protein 4, EDN3: endotelin-3, Rocki: Y-27.632 dihydroklorid B - C. Visar bright (B) och GFP-fluorescens (C) bild av differentiering på dag 11 innan omstryka med hjälp av en transgen pSOX10: GFP hESC linje. De mörka åsar är synliga i de bright bilder anrikas för SOX10 + -celler som kommer att ge upphov till melanoblasts och så småningom melanocyter. ladda / 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Melanocyte och mellansteg. (A) pigmenterad Dag 25 celler (höger) kan lätt visualiseras och framstående från dag 11-celler (vänster) vid pelletering. (B) Vid dag 20 av protokollet kulturen kommer att innehålla både opigmenterade, förfallande melanocyter och fullt mogna, pigmenterade melanocyter. (C - D) De melanocyter kan visualiseras under starkt fält och både mognad och fullt pigmenterade melanocyter fläck för melanoblast / utarmar markör TYRP2. (E - F) Endast pigmenterade melanocyter fläcken för sent skede melanocytantalet markör TYRP1.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För framgångsrik differentiering av melanocyter från hPSCs följande förslag bör beaktas. Först och främst är det viktigt att arbeta under sterila odlingsbetingelser vid alla tillfällen. Dessutom är det viktigt att börja med pluripotenta, fullt odifferentierade hPSCs; om utgångspopulationen innehåller differentierade celler utbytet kommer alltid sjunka eftersom föroreningarna inte kan riktas mot melanocyter och kan även ytterligare störa korrekt differentierande cellerna.
För att säkerställa att cellerna förblir pluripotenta vara noga med att hålla sig till de väletablerade regler för stamcells underhåll; foder och passagen regelbundet och brudgummen kulturerna för att avlägsna differentierade celler före passage. När passage på geléform protein för differentiering är det viktigt att skålen är korrekt belagda för att förhindra celler från att lyfta bort under differentieringen.
Den Melanoblast skiljerentiation bör initieras omkring 80% celltäthet; alltför höga densiteter kommer att leda till ökad celldöd medan alltför låga densiteter kommer att negativt påverka differentieringen. När passage, bör cellerna tvättas två gånger för att avlägsna eventuella cell lossnar lösning innan plätering. För att maximera överlevnad på dag 11, är det viktigt att passagen cellerna till hög densitet, väl fördelade droppar som är orörda i 20 min, så att cellerna kluster och vidhäfta.
Detta protokoll är effektivt i att generera ett stort antal melanocyter, och kommer att vara värdefull när man studerar humana patientprover av begränsad mängd. Dessutom, som PSC-härledda melanocyt befolkningen är selektiv och expanderbar melanocyten populationen kan multipliceras med mycket stort antal celler, även om de differentierings utbytena låga siffror eller procentsatser av melanocyter. Initiera protokollet med iPSCs öppnar upp möjligheten för att studera utvecklings sjukdomar och patientspecifika prover. en limitation av detta protokoll är att melanocyterna härleds som en monokultur utan alla andra celltyper som förekommer som ingår i deras normala nisch in vivo. Dessutom protokollet kräver sakkunskap inom hPSC kultur och differentieringstekniker. Men med den senaste utvecklingen inom IPSC fältet producerar hPSCs har blivit alltmer hanterbar och metoder för odling hPSCs har blivit rutin. Hittills har protokollet utnyttjats i vårt labb för att producera melanocyter från H9 hES linje, liksom från 14 iPS linjer som genereras från 5 olika givare.
Mica et al. Använde detta protokoll framgångsrikt för att härleda melanocyter från människa hESC och iPSCs 6. Papperet visade att iPSCs härledda från patienter med pigmente defekter skulle kunna differentieras till melanocyter och protokollet troget producerade melanosomer av den fenotypiska storlek och kvantitet som associeras med sjukdomen.
work illustreras en av många möjliga tillämpningar för protokollet med användning av iPSC härledda melanocyter för att studera sjukdomsmekanismer och infört möjligheten att skala upp produktionen för drogscreening 6,29. Viktigt visade papperet robusthet och reproducerbarhet av protokollet att producera melanocyter från ett stort antal genetiskt distinkta hiPSC linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett stipendium för melanom forskare från Joanna M. Nicolay Foundation och av National Institutes of Health enligt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Detta arbete stöddes ytterligare genom bidrag från NYSTEM och Tri-institutionella stamcells initiativ (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
