Summary
עם טרנספורטר murine ABC Bcrp1 (Abcg2) כדוגמא, ב-סיליקון פרוטוקולים מוצגים מזהים שימוש אמרגן חלופי גנים מתבטאים רקמות עכבר, כדי להעריך את התפקוד של היזמים החלופיים שזוהו באמצעות מבחני כתב.
Abstract
התבטאות גנים ברקמות שונות נשלטת לעתים קרובות על ידי יזמים חלופיים, לגרום תיצור mRNA עם ייחודי - אקסונים ראשון - בדרך כלל לא מתורגם. Bcrp1 (Abcg2), את orthologue בעכברים של חלבון סרטן התנגדות טרנספורטר שד ABC (BCRP, ABCG2), יש לפחות ארבעה מקדמים חלופיים, מיועדים על ידי אקסונים הראשון ארבעה החלופי המתאים פיק: E1U, e1a, E1B, ו E1C. בזאת, ב-סיליקון פרוטוקולים מוצגים לחזות שימוש אמרגן חלופי Bcrp1. יתר על כן, שיטות assay הכתב מתוארים לייצר מבני כתב יזמים חלופיים ולקבוע את הפונקציונליות של יזמים משוערים במעלה זרם של אקסונים הראשון החלופי מזוהים.
Introduction
יותר ממחצית גנים אנושיים מוסדרת יזמים חלופיים 1. אמרגן כל חלופה יכול להכיל אלמנטים רגולטוריים שעשויה להיות שונים מאלה הנהוגים יזמי אלטרנטיבה אחרים. האמרגן (הים) מנוצל ברקמה אחת עשוי להיות שונה מאלה המשמשים רקמה אחרת. לדוגמא, ייתכן כי הפעלת מסלול איתות נתונה עלולה לעורר את האמרגן החלופי גן מנוצל ברקמה אחת, עדיין אין כל השפעה על או להדחיק אמרגן חלופה נפרד אותו הגן כי הוא מנוצל ברקמה אחרת.
ביטוי של גן Bcrp1 נשלט על ידי יזמים חלופיים. Bcrp1 הוא orthologue בעכברים של חלבון סרטן שד התנגדות האנושי הגן (BCRP). BCRP הוא קלטת מחייב ATP (ABC) טרנספורטר, המיועד באופן רשמי ABCG2 2, 3. בתור חלבון הממברנה פסגה, BCRP / פונקציות Bcrp1 כדי בזרימת מגוון רחב של מצעים טבעיים xenobiotic
בעבודה מוקדם להבין את בקרת ביטוי BCRP בתאים נורמלים ממאירים, 5 'הגברה מהירה של קצות cDNA (5'-RACE) ניתוח של mRNA BCRP בוצעה על מנת לקבוע אתר תחילת התעתיק המדויק שלה 13. לא רק היו אתרי תעתיק התחלה מרובים מצאו; גם נתקלו היו שלוש צורות חלופיות של אקסון הראשון, אשר BCRP הוא לא מתורגם. אקסונים הראשונים החלופיים אלה - המיועדים e1a, E1b, E1c - באו לידי ביטוי באופן שונה במגוון רקמות אנושיות. שתי גרסות אקסון ראשונות נוספות התגלו חיפוש יפציץ של מסד נתוני EST אדם באמצעות אקסון השני של BCRP 13. ארבעה גפרורים חשפו אקסון ראשון> 70 kb במעלה זרם אקסון 2 אשר יועדו E1u; ארבעה משחקים אחרים גילה BCRP mRNA כי חסרים אקסון ראשון כולו, אשר יועדו E1- 13. הנוכחות של אקסונים מנהיג חלופיים נחשבת ביטוי של שימוש אמרגן חלופי 14.
בעכברים, ארבעה אקסונים ראשונים חלופיים Bcrp1 מתוארים שעשויות מתאימות יזמים חלופיים השולטים שעתוק 1 BCRP ברקמות עכבר שונים; אלה אקסונים / היזמים מיועדים E1U, e1a, E1B ו E1C, והם ממוקמים כ 70, 58, 15, ו -5 קילו במעלה הזרם אקסון Bcrp1 2 5, 15. איזופורם mRNA e1a נמצא שולט Murinדואר בתאי גזע hematopoietic, לב, ריאות, טחול, ומוח, ואילו איזופורם E1B התבטא מעי עכבר, תאים בכבד עובר, ותאי מבשר erythroid ב מח עצם 5, 15. האמרגן במעלה זרם E1B הוצג להיות האמרגן החלופי החשוב מסדירי שעתוק Bcrp1 במעי עכבר, מוסדר לפחות בחלקה, על ידי חלבון מחייב אלמנט בתגובת phospho-מחזורי-AMP (p-CREB) ואלמנט בתגובת CREB ייחודי חלופי אמרגן Bcrp1 16. איזופורם mRNA E1C מתבטאת בעיקר בכבד בעכברים בוגרים כליה 5. איזופורם E1U ניתן לגילוי ברוב הרקמות שנבדקו למעט testis בעכברים, שבו הוא איזופורם השולט הביע 5. Bcrp1 לידי ביטוי האשכים חולדה נמצא בשני סומטי (צמתים הדוקים אנדותל, תאי myoid peritubular, ותאי Sertoli) ותאי נבט (ב האנדותל seminiferous, שבו הוא עשוי להגן spermatids בשלב מאוחר 4). רגיון במעלה זרם E1U מכיל מרכיב בתגובה פונקציונלי-1 גורם steroidogenic (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA וחלבונים מופחתים באופן ניכר באשכים של עכברים בנוקאאוט SF-1 תא ספציפי Sertoli, דבר המצביע על כך הביטוי Bcrp1 בתאים Sertoli murine נשלטת על ידי SF-1 5.
הפרוטוקולים שהוצגו שיטות פרט לזהות אקסונים ראשונים חלופיים Bcrp1 ב-סיליקון, ולבסס מבחני כתב מבוסס בלוציפראז עבור יזמים משוערים במעלה זרם מן אקסונים הראשונים האלטרנטיבה המזוהית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חיזוי Silico של ראשית אלטרנטיבי אקסונים של Bcrp1 באמצעות ניתוח תפציץ של מסד נתונים עכבר EST
הערה: פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע חיפוש תג רצף העכבר הביע (EST) מסד ליערות עם דמיון רצף אקסון 2 של Bcrp1 (המכיל באתר ההתחלה translational) ולאחר מכן כיצד ליישר את רצפי EST התאמת רצפים גנומיים כדי לוודא שלהם המיקום היחסי הגן העכברי Bcrp1 עד הסוף '5 של Bcrp1 אקסון 2.
- השג את רצף עבור אקסון העכבר Bcrp1 2 על ידי הזנת מזהה רצף ההתייחסות mRNA (NM_011920.3) לתוך חלון החיפוש של דפדפן הגנום Ensembl 17, לחץ על "GO". במסך הבא, בחר רצף באורך מלא (מכיל 16 אקסונים):
- במסך הבא ( "התצוגה מבוססת תמליל"), בחר "16 אקסונים." זה יציג את מסך המכיל את הרצף של כל אקסונים של Bcrp1. אקסון 2 של Bcrp1 ייקרא "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "התוצאות שהושגו יהיה דומה לאלו המוצגים התייחסות 18..
- לחץ על אפשרות "רצף הורדה". במסך הבא, בחר את תבנית FASTA, ולאחר מכן לחץ על "תצוגה מקדימה". במסך הבא, להעתיק את רצף תצוגה מקדימה של אקסון 2 אל הלוח.
- נווט אל דף הבית תפציץ 19 על המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה) אתר 20.
- בחר הגנום "עכבר". הדבק את רצף אקסון 2 מהלוח לתוך תיבת השאילתה.
- "ליערות" לבחור מתוך התפריט הנפתח מסד נתונים, אופטימיזציה "רצפים דומים מאוד," ולאחר מכן לבחור "הפיצוץ." זמן לרוץ ייקח כמה דקות. כאשר לרוץ תפציצו יושלם, בעמוד "התוצאות" יופיע.
- תחת כותרת משנה "תיאורים" עמוד "תוצאות", בחר "ALL," ואז "הורדה" ולאחר מכן "FASTA (מלאהרצף) "בתפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר" המשך "קובץ .txt יופיע;. פתוח להעתיק את הקובץ כולו אל לוח קובץ .txt מכיל רצפים של כל ליערות עם דמיון רצף גבוה עם העכבר Bcrp1 exon2. אבל לא עמדו ביחס שלהם אקסון 2 בגן Bcrp1.
הערה: מניתוח ביצע ב -15 באפריל 2015 זיהו 14 ליערות בעכברים כי מיושר עם אקסון Bcrp1 2. אלו מפורטים בטבלה 1.
- זהה את המיקום של הרצף EST כי הוא 5 'כדי אקסון 2 בגן Bcrp1. הגן העכברי Bcrp1 ממוקם NC_000072.6 contig כרומוזום 6 (GI: 372,099,104).
- בדף הבית של תפציץ תחת כותרת המשנה "הפיצוץ Specialized", בחר "יישר שני (או יותר) רצפים באמצעות תפציץ (bl2seq)."
- הדבק את קובץ הטקסט מהלוח אל תוך תיבת שאילתה ולהזין 372099104 בתיבת רצף הנושא. מטב עבור "רצפים דומים מאוד" במסגרת תוכניתבחירה, ואת הפיצוץ לרוץ.
- לאחר חלון התוצאות יופיע, להציג המערכים בצורה גרפית על ידי לחיצה על "גרפיקה" בחלון "היישור". השתמש בחצים ימינה ושמאלה וזום להתמקד Bcrp1 / Abcg2 ואת יישור רצף.
- שמור את יישור הרצף: לבחור "הכל" בתיבת "תיאורים", אז תחת התפריט הנפתח "הורדה" לבחור "הכה שולחן (CSV)," ולאחר מכן לחץ על "המשך". קובץ זה מכיל את יישור רצף של Bcrp1 אקסון 2 ואת היישור של כל רצפי EST עם הדמיון רצף Bcrp1 Exon2 ביחס המספור של נוקלאוטידים ב contig העכבר כרומוזום 6. כל רצף EST מלא עלול ליצור מערכים מרובים פורשים אזורים 5 'ו 3' כדי אקסון 2 כולל הרצפים חופפים עם Bcrp1 אקסון 2.
- כמו המיקום של סוף '5 של אקסון 2 יתאים נוקלאוטיד 58,655,638 ב contig כרומוזום 6, לייעד זה+1, ולאחר מכן לחשב את המיקום של הרצפים החלקיים של כל EST 5 'ל 58,655,638. תוצאות עבור 14 ליערות ניתנות בטבלה 1.
הערה: היזהר לנתח רצפי EST כי הם 5 'ל +1 (כלומר, יש ערך נוקלאוטיד שלילי) כפי אקסונים הפוטנציאלי הראשון. לדוגמה, בשניים ליערות כי מיושר עם Bcrp1 אקסון 2 שמוצג בטבלה 1 (AI647825 ו AI664571) רצף שנותר היה 3 'כדי אקסון 2.
2. הערכת Bcrp1 פונקצית יזם אלטרנטיבי
- עיצוב של כתב בונה עבור Bcrp1 E1U, e1a, E1B ומקדם E1C
- באמצעות רצף של E1U המתקבל בחיפוש במאגר EST, לייעד את נוקלאוטיד 5 'הראשון של E1U כמו +1.
- השג כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שיבוט של כרומוזום העכבר 6 שמכיל את רצף הגן Bcrp1 / Abcg2 ואת רצף לפחות 100 kb במעלה הזרם שלBcrp1 / גן Abcg2 (ראה רשימה של חומרים וציוד).
- זהה וקטור כתב מתאים כגון pGL3 הבסיסי פלסמיד כתב בלוציפראז.
- קבע את אתרי שיבוט מרובים וקטור הכתב. KpnI, SACI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII ו HindIII הם אתרי endonuclease הגבלת אתר השיבוט המרובה של הווקטור בסיסי pGL3, ב 5 'ל 3' כיוון.
הערה: הרצף של אתרי העיכול זמין מקטלוגי תוצר של חברות המייצרות את אנזימי ההגבלה. - זיהוי כל האתרים העיכול אקסון E1U והאזור 2 kb 5 'של E1U באמצעות תוכנות כגון DNA5. לזהות לפחות שני אתרי עיכול אתר השיבוט המרובה pGL3-יסוד שאינו נמצאים ב E1U או באזור 2 kb במעלה הזרם.
הערה: הקפד לבחור אתר הגבלת אתר שיבוט מרובה עבור פריימר קדימה כי הוא זרם של אחד שנבחר פריימר הפוך על מנת להבטיח כי wil הכנסl להיות בכיוון הנכון.
- כן קדימה לאחור תחל עבור PCR המכילים רצפים עבור באתרי endonuclease הגבלת אתר שיבוט המרובה pGL3-יסוד שנבחרו באמצעות שירותי סינתזה מסחריים הגן / פריימר או תוכנת בחירת פריימר (ראה רשימה של חומרים וציוד). בחר פריימר קדימה הממוקם ~ 2 kb במעלה הזרם מן הרצף E1U ו פריימר הפוכה בתוך רצף E1U. פריימרים המשמשים המחברים 'העבודה הקודמת שולבו באתר SACI ב פריימר קדימה, ואתר NheI ב פריימר הפוכה, והעצים באזור הגנומי של כ -1.906 כדי +64 עם 5 הראשון' נוקלאוטיד של E1U כמפורט + 1 (ראה שלב 2.1.1 לעיל), וכן ניתנים ביחס 16.
- PCR להגביר את האזור הגנומי E1U באמצעות פריימרים אלה, 0.01 כדי 1 מיקרוגרם של BAC, ואת תערובת אמן PCR המכיל polymerases תקי באיכות גבוהה (ראה רשימה של חומרים וציוד) עם denaturing ב95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולאחר מכן 35 עד 40 מחזורים של PCR, עם סיומת על 72 מעלות צלזיוס (2 דק '), ואת חישול לטמפרטורת היתוך מבוסס על מאפייני ההיתוך של פריימרים בשימוש.
הערה: שימוש polymerases תקי באיכות הגבוהה חיוני אזורי אמרגן רצף שיש תוכן GC גבוה. בעת שימוש קטעי דנ"א גנומי גדולים כגון BAC כתבנית, המבנה המשני של הדנ"א הגנומי עשוי להקשות על פריימרים PCR להיקשר. אם בעיה זו מתעוררת, תוצאות PCR טובות ניתן לקבל אם תבנית ה- DNA הגנומי הארוכה היא טיעון בעדינות על ידי sonication לפני תגובת PCR. - בדוק את אורכו של מוצר ה- PCR מוגבר על ידי השוואת נגד סולם DNA 1 kb באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose 0.8% טה.
- PCR להגביר את האזור הגנומי E1U באמצעות פריימרים אלה, 0.01 כדי 1 מיקרוגרם של BAC, ואת תערובת אמן PCR המכיל polymerases תקי באיכות גבוהה (ראה רשימה של חומרים וציוד) עם denaturing ב95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולאחר מכן 35 עד 40 מחזורים של PCR, עם סיומת על 72 מעלות צלזיוס (2 דק '), ואת חישול לטמפרטורת היתוך מבוסס על מאפייני ההיתוך של פריימרים בשימוש.
- לעכל את מוצר ה- PCR שהושג ואת הווקטור בסיסי pGL3, באמצעות ההגבלה endonucleases ספציפית באתרי עיכול ההגבלה המוחדרים קדימה הפוך פריימרים לפי תוספותtructions שמצורף אנזימי עיכול הגבלה.
- לטהר את תגובות העיכול באמצעות ג'ל SV המסחרי PCR ניקיון ערכת מערכות (ראה רשימה של חומרים וציוד), בעקבות פרוטוקול הערכה 21.
- ודא עיכול לינאריזציה של וקטור על ידי השוואתה נגד וקטור נימול באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose, ולאחר מכן לחתוך ולטהר את הלהקה DNA וקטור מתעכל. למדוד את הריכוז של מוצר PCR מטוהר הווקטור המטוהר באמצעות ספקטרומטריית UV (ראה רשימה של חומרים וציוד).
- לטהר את תגובות העיכול באמצעות ג'ל SV המסחרי PCR ניקיון ערכת מערכות (ראה רשימה של חומרים וציוד), בעקבות פרוטוקול הערכה 21.
- הכן את לבנות כתב E1U ידי ligating המטוהר, אנזים הגבלה מתעכל מוצר ה- PCR וקטור כתב בלוציפראז גחלילית pGL3 בסיסי (כלול בערכת assay הכתב; לראות רשימה של חומרים וציוד) בשעה כנס: יחסי וקטור של 11, 21 ו -31, באמצעות "ערכת T4 DNA אנזים הקשירה מהירה" 22, ובכך בהתאם להנחיות ערכת הפקת E1U reporter לבנות, בשם pGL3-E1U.
- השתמש פלסמיד pGL3-E1U להפוך חיידקים להרחיב clonally pGL3-E1U ההוראות הבאות בערכת שיבוט ת"א (ראה רשימה של חומרים וציוד).
- אשר את האוריינטציה ונאמנות של הכנס על ידי ניתוח רצף.
- כתב כן בונה עבור e1a, E1B ו E1C שימוש במתודולוגיה דומה באשר E1U. אשר את הנאמנות של מוסיף על ידי רצף כאמור בסעיף 2.1.5.2.
הערה: מוסיף היזמית e1a, E1B ו E1C צריך להיות כ -1875 / + 10, -1847 / + 60, ו -1904 / + 83 ביחס 5 נוקלאוטיד 'הראשונה (יועד +1) של e1a, E1B, או E1C, בהתאמה.
- שיטות assay Reporter
הערה: אסטרטגיה כללית של מבחני כתב: האמרגן המשוער (5 'באזור במעלה זרם) של גן מוכנס לתוך אתר השיבוט המרובה של וקטור ריק "עיתונאי" המכיל "reporteגן r "(למשל, גחלילית בלוציפראז) במורד זרם מן אתר השיבוט המרובה. הווקטור הוא transfected מכן לתאים איקריוטיים המבטאים את הגן של עניין. הגורמים הפועלים-trans מקדמי ביטוי של הגן של עניין בתאים אלה צריכים להפעיל את האמרגן של וקטור הכתב טרנספקציה, גרימת ביטוי של בלוציפראז גחלילית, אשר ניתן לכמת בקלות עם assay הארה.- בחר את שורת התאים המתאימה לשימוש עבור assay הכתב.
הערה: כדי להעריך את פעילותו של לבנות כתב האמרגן אלטרנטיבה E1U, יש צורך transfect כי לבנות לתוך תאים המבטאים Bcrp1 תחת שליטה של האמרגן E1U. השורה תא סרטולי murine TM4 (ראה רשימה של חומרים וציוד) מבטא חלבון Bcrp1 ו Bcrp1 mRNA המכיל E1U, כמו גם e1a, E1B, ו E1C 5. כביקורת שלילית, כדאי לשקול שימוש קו התא אינו מבטא Bcrp1 חלבון או mRNA. - תרבות לספירת TM4LLS ב 24 גם צלחות בצפיפות הראשונית של 200,000 תאים / גם ביחס של 1: תערובת 1 של מדיום F12 של חם ובינוניים של הנשר שונה של Dulbecco עם 1.2 גרם / סודיום ביקרבונט L, 15 מ"מ HEPES בתוספת סרום סוס 5%, 2.5% בסרום שור עוברי, פניצילין (100 IU / ml), ו סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, כפי שתוארו לעיל 5.
- שש שעות לאחר הצבת התאים בתרבית, transfect התאים עם 0.2 מיקרוגרם של וקטור pGL3-בסיסי ריק או עם 0.2 מיקרוגרם של וקטור pGL3 המכיל את -1906 / + 64 E1U או -1875 / + 10 e1a או -1847 / + 60 E1B או -1904 / + 83 E1C BCRP 1 מחיקה לבנות יחד עם 4 ng של PRL-TK (וקטור Renilla להביע בלוציפראז) כפי בקרה פנימית, באמצעות ערכת transfection DNA מסחרית הפרוטוקול של היצרן 23 (ראה רשימה של חומרים וציוד) .
- 30 שעות transfection הבא, להסיר את תקשורת הצמיחה מן cultured transfected תאים. שוטפים את התאים פעם עם 200 μl של PBS, ולאחר מכן להסיר את הפתרון לשטוף.
- מדוד גחלילית ופעילות בלוציפראז Renilla באמצעות ערכה מסחרית על פי הפרוטוקולים של יצרן 24.
- לבטא את הפעילות עבור כל צינור כיחס של פעילות בלוציפראז גחלילית מחולק הבקרה הפנימית (בלוציפראז Renilla); תוצאות הכוללות בדרך כלל מבוטאות הפעילות של כל עיתונאי לבנות ביחס לזו של תאי transfected עם וקטור pGL3 בסיסי הריק, אשר ניתן ערך של 1.
- בחר את שורת התאים המתאימה לשימוש עבור assay הכתב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זיהוי של ניצול אמרגן BCRP 1 חלופי testis עכבר על ידי ניתוח של אקסונים מנהיג
כאשר בבסיס הנתונים EST ב צמח השדה עבר מבחנים (אפריל 2015) באמצעות הפעולות המתוארות בפרוטוקול 1, ליערות נמצא כי היו רציף עם תום '5 של אקסון 2 BCRP 1 mRNA מוצגים בלוח 1, יחד עם עמדתם גנומית ביחס DNA תחילת אקסון 2. אחד EST נגזר testis העכבר C57BL / 6J כי הוא רציף כדי אקסון 2 BCRP 1 יש mRNA רצפים הדנ"א הגנומי הזרם 70 kb מ אקסון 2, המתאים E1U (טבלה 1). באופן דומה, ליערות המתאימים e1a, E1B, ו E1C אותרו. מן ראוי לציין כי הוא ששני ליערות המתאימים E1C הכילו גם E1B שחבור עד סוף '5 של E1C. המיקום של אקסונים הראשון שחזה אלהביחס Bcrp1 אקסון 2 על העכבר כרומוזום 6 מוצג באיור 1.
הערכת תפקוד האמרגן BCRP 1 חלופי
תוצאות assay בלוציפראז אופייניות המתאים E1U, e1a, E1B ו E1C בונה כתב בלוציפראז אמרגן transfected לתאי Sertoli murine TM4 (ראה סעיף 2.2) מוצגות באיור 2A.
בעבודה הקודמת, אלמנט בתגובה SF-1 נחזה להיות האמרגן 5 E1U. אם אלמנט בתגובה SF-1 משוער זה מעורב בויסות שעתוק Bcrp1 ב testis עכבר, ואז מוטציה (כמתואר במאמר קודם 5) של אותו אלמנט תגובה של לבנות כתב אמרגן E1U תפחית את הפעילות בלוציפראז המיוצרת על ידי כי מבנה כאשר transfected לתוךתאי TM4. תוצאות של ניסוי טיפוסי מוצגות באיור 2B. בונת המוטציה מראה פעילות בלוציפראז נמוכה מבנה בלתי-מוטציה, עם פעילות דומה לזה של וקטור pGL3-בסיסי הריק, אפילו בתאים עם ביטוי הכפוי של SF-1 (המתואר במאמר קודם 5). ביטוי כפוי של SF-1 מגביר את הפעילות של לבנות מוטציה-un, אבל לא כל כך של אחד המוטציה.
דק-page = "1"> 
איור 1. תרשים של יישור הגנומי של ליערות עם זהות רצף Bcrp1 אקסון 2 עם כרומוזום בעכברים 6. מערכים אלה זוהו בחיפוש תפציץ dbEST ביצע באפריל, 2015. ארבעה מערכים ברורים נמצאו, המתאים Bcrp1 אקסונים הראשון אלטרנטיבה E1U, e1a, E1B, ו E1C. נתון זה הוא לשחזר מתוך פרסום קודם 5. 
איור 2. (א) assay כתב Bcrp1 היזמים E1U, e1a, E1B, ו E1C ב BALB / c Sertoli תאים שמקורם בתאי TM4. הנתונים באים לידי ביטוי ההארה של בלוציפראז גחלילית המנורמלת של בלוציפראז Renilla, תוך שימוש בשיטות המתוארות בסעיף 2. נתונים מוצגים הם ממוצעים וסטיית תקן של שלושה ניסויים שונים, נעשה בימים שונים. הכוכבית מציינת הבדל משמעותי משליטת וקטור pGL3 הריקה באמצעות -test t (P <0.01). נתון זה הוא לשחזר מתוך פרסום קודם 5. (ב) השפעות של מוטציה של אלמנט התגובה SF-1 ב מחדש Bcrp1 E1U השוער לבנות על פעילות בלוציפראז. כתב Bcrp1 בונה עם האזור מחייב SF-1 המשוער (מוטציה או בלתי-מוטציה) היו transfected לתאי TM4 עם (SF-1 טרנספקציה) ובלי (וקטור transfected) הביטוי הכפוי של נתוני SF-1.The הראה הם ממוצעים של 3 ניסויים שונים, נעשה בימים שונים; סורגי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. עבור כל ניסוי, מבחני פרט נעשו בשני עותקים. באיור, (א) מציין הבדל משמעותי משליטת pGL3 הווקטור הריק (P <0.05) באמצעות t -test; (ב) מסמן הבדל מובהק סטטיסטי בהשוואה לבנות אמרגן E1U באמצעות -test t (P < 0.05). נתון זה הוא לשחזר מתוך פרסום קודם 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
טבלה 1. פיצוץ חיפוש במאגר EST העכבר נגד הרצף של אקסון השני של Bcrp1 25 -28. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רוב השיטות ותוצאות נציג הציגו מתוארים בעבודה קודמת תחת כותרת "שעתוק B crp1 ב testis עכבר נשלט על ידי אמרגן במעלה הזרם של אקסון הראשון רומן (E1U) מווסת על ידי גורם-1 steroidogenic," אשר פורסם בשנת 2013 5 . בנוסף לתוצאות הנציג המתוארות כאן, בעיתון הקודם ספק אומדני ניצול אקסון הראשון חלופי באמצעות מתודולוגיה 5'-RACE PCR ו RT-PCR. יתר על כן, ב-סיליקון זיהוי של אלמנט תגובה משוער SF-1 האמרגן במעלה זרם E1U השלמתו; immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מבחנים הוכיחו כי SF-1 כבול לאלמנט בתגובה SF-1 המשוער. מחקרים פונקציונליים גילו כי בתאי murine Sertoli, שעתוק BCRP 1 נשלט על ידי SF-1 באמצעות האלמנט בתגובה SF-1 אמרגן E1U. מחקרים פונקציונליים אלה כללו גברת ביטוי של SF-1 בתאי TM4 ידי transfection או על ידי שימוש מעכב deacetylase היסטון (vorinostat), אשר הביא ביטוי מוגבר של BCRP 1 E1U mRNA, ועלייה בחלבון BCRP 1 וכן פעילות של האמרגן E1U BCRP 1 ב assay הכתב. לבסוף, מחקרים אלה סיפקו ראיות כי האשכים מן Sertoli תאים בוגרים עכברים בנוקאאוט SF-1 ספציפיים, הביטויים של 1 BCRP E1U mRNA, הכולל BCRP 1 mRNA, וחלבון Bcrp1 הופחתו במידה ניכרת 5. אותה העבודה כמו כן דווחה על דפוסי הביטוי של isoforms mRNA Bcrp1 במגוון רקמות Murine, כוללים כליות, כבד, testis, מוח, לב, ריאות, שרירים, וטחול 5.
הפרוטוקולים המתוארים כאן - באמצעות רגולציה ספציפית-רקמה של BCRP 1 כמודל - מספקים מסגרת ניסיונית קלילה לפענח את מורכבות תעתיק של כל גן כדי לקבוע ההפרש שלהביטוי ברקמות שונות או תת הסלולר. יש להדגיש כי התוצאות שהתקבלו ממדרגות הפרוטוקול המתוארות להערכות ב-סיליקון עשויות להיות תלוי זמן מאז האתרים השונים המאחסנים את התוכנה ומסדי נתונים בשימוש עשוי להיות כפוף לשינוי. המתודולוגיה ב-סיליקון המוצגת כאן מנצלת לחיפוש במאגר EST (dbEST) כפי שדווח בעבר 29, אשר העריך כי כ -18% מכלל הגנים האנושיים במערך נתוני EST להעסיק מקדמים חלופיים. חיפוש dbEST עלול לזלזל אקסונים ראשון אלטרנטיבה, כי חוקרים אחרים - באמצעות שיטה "אוליגו-מכסה" לייצר 1.8 מיליון רצפי 5'-סוף cDNAs מרקמות אנושיות רבות - הצליח לזהות אתרי תחילת תעתיק המשוערת עבור גנים אנושיים ואומדן כי 52% מגני RefSeq האדם למדו ואולי הוסדרו על ידי יזמים חלופיים 1. מעניין לציין, כי במחקר האחרון נמצא כירקמות שלוקחות חלק מקדמי חלופית המשוערת לאשכים ביותר היו והמוח; יתר על כן, הם גילו כי גנים המקודדים חלבונים הקשורים לאותת מסלולי העברת נטו יותר להעסיק מקדמי חלופי רקמות ספציפיות 1. למרות החסרונות שהוזכרו, dbEST המנתח לספק סריקה כללית של 5 'שימוש UTR עבור גן מסוים ברקמות מרובות עם מאמץ מינימאלי.
למרות ניתוח dbEST מספק צצה קלילה על שימוש אקסון ראשון חלופי, מומלץ מאוד לבצע 5 'הגברה מהירה של קצות cDNA (5'-RACE) ניתוח לאמת שימוש אקסון ראשון בשורת רקמה או תאים תחת חקירה. ערכות מסחריות זמינות 5'-RACE, עם נהלים מפורטים וישירים שספקו היצרן (ראו רשימה של חומרים וציוד). למרות מעט גוזל זמן מחקרים 5'-RACE מספקים הערכות בפועל של נוכחות כמו גם רצף של האקס הראשון חלופילפיירפוקס ה- mRNA של עניין; יתר על כן, נוכחותם של אתרי תחילת תעתיק מרובים יכול גם להתגלות 13. כדי להבטיח ייצוג מספיק, רצף של לפחות 15 עד 25 שיבוטים נדרש. לפני הרצף, זה הכרחי כדי להסיר רצפי וקטור זיהום מן מוצרי RACE '5. אם זה לא נעשה, ניתוח יפציץ עלולה להיכשל לחלוטין לזהות יישור רצף עם גנום העכבר. לאחר שימוש אקסון ראשון קם, ממצאי 5'-RACE יכולים לשמש כדי לאמת מבחני RT-PCR כמוני עוקבות עבור אקסונים ראשון אלטרנטיבה. באופן כללי, העבודה הקודמת של המחברים מצאה כי יש קורלציה טובה בין אחוז שיבוטי mRNA אקסון הראשונים התאוששו ידי 5'RACE ואחוז מוצר PCR התאושש עבור אקסון ראשון אלטרנטיבה נתונה מרקמה או תא באותה השורה 5. בנוסף, קורלציה טובה נמצאה בין הפעילויות של מבני אמרגן בלוציפראז עבור Bcrp1 יזמי אלטרנטיבהnd הביטוי של אקסון הראשון האלטרנטיבה המקביל לקו תא מסוים 5.
בחיפוש אחר שימוש אמרגן אלטרנטיבת רקמות ספציפיות, אם איברי שלמים משמשים, אחד חייב להיות מודע כי אקסונים יזמים / הראשון החלופה מצאו ישקפו את ההטרוגניות רקמות של האיבר כגון אלמנטי בלוטות, כלי דם, stroma, וכו ' לדוגמה, testis הוא שילוב של סומטיים (ליידיג, Sertoli, myoid, ו האנדותל) תאים נבטי (הפלואידים) תאים, כמו גם כלי הדם. כדי לחקור לביטוי אקסון הראשון רקמות ספציפיות, יהיה צורך לבודד רקמות ספציפיות מהאיברים.
שיטות אחרות דווחו לזיהוי שימוש ורגולצית אמרגן חלופיים; אולם, אלה דורשים רצף הדור הבא וביואינפורמטיקה מחשוב המסוגל לנתח הכמות הגדולה של נתונים מיוצרים. שיטות אלה כוללות transcriptosome רצף שלם (seq RNA), וצ'יפ-seq שלהיסטונים כגון H3K4me3, אשר נקשר באופן מועדף היזמים 30. למרות ששיטות אלה יכולים להיות יקרות כדי לבצע דה-נובו, כאשר הדגש הוא על ביטוי של כמה גנים ספציפיים ורקמות, כריית נתונים קיימים עשויה להיות גישה מעשית יותר.
המבחנים להערכת פעילות הפרומוטר המוצג כאן מעסיקים וקטור בסיסי-pGL3, המכיל באזור שיבוט מרובה במעלה זרם מן הגן בלוציפראז גחלילית. פעילות הפרומוטר נמדדת ע"י המצאת בלוציפראז גחלילית, אשר היא לכמת בקלות, לאחר תוספת של קו-פקטורים ואת מצע זורח, על ידי מדידת הארה בתוך luminometer מסחרי (ראה רשימה של חומרים וציוד). וקטור pGL4 הקשורים יכול להתבצע להכיל סמנים לבחירה (למשל, neomycin, hygromycin, puromycin), המאפשרת ייצור של תאים transfected ביציבות. הפרוטוקולים הנתונים במאמר זה לנצל transfection חולף. בדרך כלל, מבחני כתב promotפעילות אה נעשות באמצעות שיתוף transfection עם וקטור כי constitutively מבטא Renilla בלוציפראז (ים פנסי) (PRL-TK), כדי לשלוט על וריאציות מספר הסלולרי ואת היעילות של transfection. שלב קריטי בהקמת assay יזמית גן מסוים הוא להיות בטוח כי הגן של העניין מתבטא הקו הסלולרי כי הוא transfected עם לבנות הכתב. שנית, כאשר שימוש אמרגן חלופי קיים, חשוב להשתמש מבנה האמרגן שמקביל אקסון הראשון האלטרנטיבה לידי ביטוי קו תאי transfected. לדוגמה, אל תצפו לראות הארה עבור מבנה האמרגן E1U כי הוא transfected לתוך תאים המבטאים Bcrp1 אך ורק תחת שליטה של האמרגן E1B. לחלופין, כביקורת שלילית, transfection של הכתב לבנות לקו תא שאינו המבטאים את הגן או mRNA איזופורם של עניין צריך לגרום לא מבוצע ייצור של בלוציפראז גחלילית.
גonsequences שימוש אמרגן חלופי כולל ייצור של אותו החלבון, ייצור של חלבונים עם N-טרמיני, או ייצור השונה של חלבונים שונים 29. במקרה של Bcrp1 / BCRP מספר יזמים (רקמות או סוג תא ספציפי) לשלוט על הייצור של אותו החלבון. דפוס דומה קיים עבור גן CYP19 (ארומטאז) 29, 31. הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק את הצעדים הבסיסיים אחד יכול להשתמש בו כדי לפענח בקו רקמה או תאי המנגנונים המורכבים שליטת תעתיק של חלבון של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
דאגלס ד רוס מאוניברסיטת מרילנד, בולטימור להחזיק זכויות הפטנט BCRP האדם.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרסי סקירת כשרון דאגלס ד רוס וכדי עריף חוסיין מהמחלקה לענייני יוצאי הצבא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
