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Neuroscience

से एक कीट मॉडल में फोटोरिसेप्टर सेल स्पेक्ट्रल संवेदनशीलता का निर्धारण Published: February 26, 2016 doi: 10.3791/53829
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Irvine, 2School of Life Sciences, University of Sussex

Summary

intracellular रिकॉर्डिंग के electrophysiological तकनीक का प्रदर्शन किया और एक तितली के यौगिक आंखों में एकल फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

Abstract

Intracellular रिकॉर्डिंग एक शक्तिशाली कैसे निर्धारित करने के लिए एक एकल कोशिका एक दिया प्रोत्साहन का जवाब हो सकता तकनीक का इस्तेमाल किया है। दृष्टि अनुसंधान में, intracellular रिकॉर्डिंग ऐतिहासिक दृष्टि से एक आम अलग तरह के प्रकाश उत्तेजनाओं जाता है कि आज भी इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए अलग-अलग फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, वहाँ आंखों में intracellular रिकॉर्डिंग प्रयोगों को दोहराने के लिए बधाई देने के शोधकर्ताओं के लिए साहित्य में विस्तृत कार्यप्रणाली की कमी बनी हुई है। यहाँ हम अधिक आम तौर पर आंख शरीर क्रिया विज्ञान की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में कीट प्रस्तुत करते हैं। कीट फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं आंख की सतह के निकट स्थित हैं और इसलिए तक पहुँचने के लिए आसान कर रहे हैं, और दृष्टि में शामिल तंत्र के कई जंतु संघ भर में संरक्षित कर रहे हैं। हम एक तितली की नजर में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के vivo intracellular रिकॉर्डिंग के लिए बुनियादी प्रक्रिया का वर्णन, ई में थोड़ा पूर्व अनुभव के साथ शोधकर्ताओं के लिए इस तकनीक को और अधिक सुलभ बनाने के लक्ष्य के साथlectrophysiology। हम की जरूरत है, कैसे रिकॉर्डिंग के लिए एक जीवित तितली तैयार करने के लिए, एक ही सेल में एक गिलास microelectrode, और अंत में रिकॉर्डिंग प्रक्रिया ही डालने के लिए कैसे बुनियादी उपकरणों का परिचय। हम भी अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए कच्चे प्रतिक्रिया डेटा के बुनियादी विश्लेषण समझाओ। हालांकि हमारी संवेदनशीलता का निर्धारण वर्णक्रम प्रोटोकॉल पर केंद्रित है, अन्य उत्तेजनाओं (जैसे, ध्रुवीकृत प्रकाश) और विधि के रूपांतरों इस सेटअप करने के लिए लागू कर रहे हैं।

Introduction

इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में कोशिकाओं के बिजली के गुणों वोल्टेज या वर्तमान में एक परिवर्तन के रूप में कोशिका झिल्ली भर आयन प्रवाह को मापने के द्वारा मनाया जाता है। electrophysiological तकनीक की एक किस्म की कोशिकाओं में bioelectric घटनाओं को मापने के लिए विकसित किया गया है। जानवरों की आंखों में पाया न्यूरॉन्स पहुंच रहे हैं और उनके circuitry अक्सर मस्तिष्क की तुलना में कम जटिल है, electrophysiological अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं को अच्छा उम्मीदवार बना रही है। आंखों में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की आम अनुप्रयोगों electroretinography (एर्ग) 1,2 और microelectrode intracellular रिकॉर्डिंग शामिल हैं। एर्ग में या एक जानवर की आंख पर एक इलेक्ट्रोड रखने, एक प्रकाश प्रोत्साहन लागू करने, और सभी पास की कोशिकाओं को 3-6 की प्रतिक्रियाओं की राशि के रूप में वोल्टेज में परिवर्तन को मापने शामिल है। यदि एक विशेष व्यक्ति फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता निस्र्पक में रुचि है, अक्सर कई प्रकार की कोशिकाओं को एक साथ एक दिया प्रोत्साहन के लिए अलग अलग शक्तियों पर प्रतिक्रिया; इस प्रकार यहएर्ग डेटा से विशेष प्रकार की कोशिकाओं की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए विशेष रूप से अगर आंख में प्रेतसंबंधी-समान फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के कई अलग अलग प्रकार के होते हैं के लिए मुश्किल हो सकता है। एक संभावित हल आंखों में बहुमत R1-6 कोशिकाओं में व्यक्त ब्याज की फोटोरिसेप्टर (opsin) जीन के साथ ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला बनाने के लिए और फिर ERGs 7 प्रदर्शन करते हैं। इस विधि के संभावित कमियां फोटोरिसेप्टर 8 प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति के लिए नहीं है, और पीढ़ी और ट्रांसजेनिक जानवरों की स्क्रीनिंग के लिए लंबे समय सीमा में शामिल हैं। प्रेतसंबंधी अलग फोटोरिसेप्टर के कम प्रकार के साथ आंखों के लिए, रंगीन फिल्टर के साथ आंख के अनुकूलन एर्ग के लिए कुछ प्रकार की कोशिकाओं के योगदान को कम करने के लिए, जिससे वर्णक्रमीय संवेदनशीलता Maxima 9 के आकलन की अनुमति देने के साथ मदद कर सकते हैं।

Intracellular रिकॉर्डिंग एक और तकनीक जहां एक ठीक इलेक्ट्रोड एक सेल impales है और एक प्रोत्साहन के लिए आवेदन किया है। इलेक्ट्रोड रिकॉर्ड ही है कि व्यक्तिidual सेल की प्रतिक्रिया इतनी है कि से रिकॉर्डिंग और कई अलग-अलग कोशिकाओं का विश्लेषण physiologically विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 10-14 के विशिष्ट संवेदनशीलता उपज कर सकते हैं। हालांकि हमारी प्रोटोकॉल वर्णक्रमीय संवेदनशीलता के विश्लेषण पर केंद्रित है, तेज इलेक्ट्रोड के साथ रिकॉर्डिंग intracellular के बुनियादी सिद्धांतों अन्य अनुप्रयोगों के लिए परिवर्तनीय हैं। उदाहरण के लिए, एक नमूना का एक अलग तैयारी का उपयोग करना, और तेज क्वार्ट्ज इलेक्ट्रोड का उपयोग, एक ऑप्टिक पालि या अन्य क्षेत्रों में गहरे से मस्तिष्क में, सवाल के आधार पर कहा जा रहा है रिकॉर्ड कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अलग-अलग 15 फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया समय, ऑप्टिक में सेल गतिविधि पालियों 16 (पटल, मज्जा या lobula 17), मस्तिष्क 18 या 19 अन्य गैन्ग्लिया भी इसी तरह की तकनीक के साथ दर्ज की जा सकती है, या रंग उत्तेजनाओं ध्रुवीकरण 20 के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता -22 या गति 23,24 उत्तेजनाओं।

Phototransduction, प्रक्रिया है जिसके प्रकाश सेऊर्जा अवशोषित और एक विद्युत संकेत में बदल जाता है, एक प्राचीन विशेषता लगभग सभी वर्तमान दिन जंतु संघ 25 के लिए आम है। दृश्य वर्णक फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में पाया और दृश्य phototransduction शुरुआत के लिए जिम्मेदार rhodopsin है। सभी जानवरों में एक rhodopsins opsin प्रोटीन, 7 transmembrane जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के परिवार के एक सदस्य है, और एक संबद्ध क्रोमोफोर जो रेटिना या इसी तरह के एक अणु 26,27 से प्राप्त होता है से बना रहे हैं। Opsin अमीनो एसिड अनुक्रम और क्रोमोफोर संरचना प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए rhodopsin की absorbance प्रभावित करते हैं। जब एक फोटान क्रोमोफोर द्वारा अवशोषित कर लेता है rhodopsin सक्रिय हो जाता है, कि अंततः सेल झिल्ली ही सीमित आयन चैनल 28 के उद्घाटन की ओर जाता है में एक झरना जी प्रोटीन की शुरुआत। सबसे न्यूरॉन्स के विपरीत, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं वर्गीकृत संभावित परिवर्तनों है कि प्रकाश प्रोत्साहन बदलने के साथ प्रतिक्रिया आयाम में एक रिश्तेदार परिवर्तन के रूप में मापा जा सकता है गुज़रना पड़ता है। आमतौर पर एक दियाफोटोरिसेप्टर प्रकार केवल एक opsin जीन व्यक्त करता है (हालांकि अपवाद मौजूद 8,10,29-31)। परिष्कृत रंग दृष्टि, कई तरह की रीढ़ और arthropods में पाया, सैकड़ों या फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के हजारों हर एक या कभी कभी अधिक rhodopsin प्रकार व्यक्त करने का एक जटिल आँख के साथ हासिल की है। विजुअल जानकारी आंख और मस्तिष्क में तंत्रिका जटिल डाउनस्ट्रीम संकेतन के माध्यम से फोटोरिसेप्टर पच्चीकारी से अधिक प्रतिक्रियाओं की तुलना, एक छवि रंग और गति के साथ पूरा की धारणा में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा कब्जा कर लिया है।

intracellular रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए एक फोटोरिसेप्टर सेल के कच्चे प्रतिक्रियाओं को मापने के बाद, यह अपने वर्णक्रम संवेदनशीलता की गणना करने के लिए संभव है। इस गणना Univariance के सिद्धांत, जिसमें कहा गया है कि एक फोटोरिसेप्टर सेल की प्रतिक्रिया फोटॉनों यह अवशोषण की संख्या पर निर्भर है, लेकिन फोटॉनों यह अवशोषण 32 की विशेष गुणों पर नहीं पर आधारित है। किसी भी फोटोन abso है किrhodopsin द्वारा rbed प्रतिक्रिया की इसी तरह प्रेरित करेगा। अभ्यास में, इसका मतलब है कि एक सेल के कच्चे प्रतिक्रिया आयाम या अपने चरम की ओर संवेदनशीलता तरंग दैर्ध्य में बदलाव करने के लिए या तो प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि (अधिक फोटॉनों अवशोषित करने के लिए) की वजह से वृद्धि होगी, (rhodopsin की संभावना अधिक है कि तरंग दैर्ध्य को अवशोषित)। हम जानते तीव्रता और तरंग दैर्ध्य अलग प्रतिक्रियाओं के लिए एक ही तरंग दैर्ध्य और एक ही तीव्रता लेकिन अज्ञात रिश्तेदार संवेदनशीलता पर सेलुलर प्रतिक्रियाओं संबंधित में इस सिद्धांत का इस्तेमाल करते हैं। सेल प्रकार अक्सर तरंगदैर्ध्य, जिस पर उनकी संवेदनशीलता चोटियों से पहचाने जाते हैं।

यहाँ हम व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए इस विधि और अधिक सुलभ बनाने पर ध्यान देने के साथ intracellular रिकॉर्डिंग और एक तितली की नजर में फोटोरिसेप्टर के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता के विश्लेषण के लिए एक विधि बताते हैं। हालांकि intracellular रिकॉर्डिंग साहित्य में आम बनी हुई है, विशेष रूप से कीड़ों में रंग दृष्टि के लिए सम्मान के साथ, हम था पाया हैसामग्री और तरीके का वर्णन टी आम तौर पर भी तकनीक के प्रजनन के लिए अनुमति देने के लिए संक्षिप्त कर रहे हैं। हम इसकी आसान प्रतिकृति की अनुमति देने के उद्देश्य से वीडियो प्रारूप में इस विधि प्रस्तुत करते हैं। हम यह भी आसानी से प्राप्य और सस्ती उपकरणों का उपयोग तकनीक का वर्णन है। हम आम निरंतर कि अक्सर रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं, जो अनुसंधान धीरे जब एक नया और जटिल तकनीक के अनुकूलन पता।

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Protocol

सभी जानवरों को जितना संभव हो मानवता का व्यवहार कर रहे थे। कीड़े कोस्टा रिका Entomological आपूर्ति, कोस्टा रिका से pupae के रूप में भेज दिया गया।

1. Heliconius Pupae की देखभाल

  1. Hang सब pupae एक humidified कक्ष कीट पिन का उपयोग करने में 2-3 सेमी अलग स्थान दिया।
  2. eclosion के बाद, पंख तो सूखी एक humidified कक्ष में कम से कम 1 दिन के लिए जीवित रखने के लिए और तितलियों रिकॉर्डिंग से पहले दैनिक एक कमजोर समाधान शहद खिलाने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. मात्रा से के बारे में 20% शहद समाधान के लिए पानी के साथ शहद पतला, और एक उथले पेट्री डिश में डाल देना।
    2. , पेट्री डिश के लिए अलग-अलग तितलियों लाओ एक के बाद एक। उनके सामने tarsi के साथ समाधान छू पर, तितलियों स्वचालित रूप से अपने proboscides का विस्तार करने और पेट्री डिश से पीना होगा। अगर उनकी सूंड स्वचालित रूप से विस्तार नहीं करता है, सूंड से बाहर खींचने के लिए और शहद समाधान करने के लिए इसे लागू करने के लिए संदंश का उपयोग करें।

2. ऑप्टिकल ट्रैक, कैलिब्रेशन, और measurप्रायोगिक रोशनी की स्थिति के ement

  1. आवास और सार्वभौमिक बिजली की आपूर्ति और एक मेज पर कम से कम एक मीटर लंबे चमकदार सफेद रोशनी देने के लिए के एक छोर पर एक संलग्न कंडेनसर लेंस विधानसभा के साथ एक 150 W क्सीनन चाप दीपक रखें।
    चेतावनी: क्सीनन आर्क लैंप मजबूत यूवी तीव्रता के साथ अत्यंत उज्ज्वल प्रकाश का उत्पादन। सुरक्षात्मक eyewear हर समय पहना जाना चाहिए और दीपक के रूप में निर्माता द्वारा निर्देशित वायुमंडलीय ऑक्सीजन के साथ पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क के कारण ओजोन के संचय को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. प्रकाश आवास विधानसभा बाहर निकलने (चित्रा 1) के माध्यम से पारित करने के लिए लंबाई में एक ऑप्टिकल ट्रैक मीटर सेट करें।
    1. इसके अलावा अनुमानित दूरी के साथ ऑप्टिकल ट्रैक पर निम्न क्रम में रखें: 1) एक उत्तल लेंस सिलिका या क्वार्टज कंडेनसर विधानसभा से 40 सेमी, 2) एक तटस्थ घनत्व फिल्टर पहिया (प्रकाश पथ में वर्तमान में कोई फिल्टर) 22 सेमी आगे भी साथ साथ ट्रैक, 3) ड्राइव इकाई के साथ एक शटर एन डी फिल्टर से 14 सेमीएस, 4) एक अवतल लेंस सिलिका या क्वार्टज तुरंत शटर निम्नलिखित आसन्न, और 5) एक collimating किरण जांच 6 सेमी आगे ट्रैक के अंत तक के साथ।
    2. collimating किरण जांच करने के लिए एक 600 मीटर व्यास फाइबर ऑप्टिक केबल प्रत्यय।
      नोट: प्रकाश की तीव्रता पर निर्भर करता है, एक 5-10 मिमी व्यास फाइबर ऑप्टिक केबल अन्य preps करने के लिए पर्याप्त प्रकाश देने के लिए आवश्यक हो सकता है और इस के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    3. दूरी, ऊंचाई और प्रत्येक ऑप्टिकल तत्व के कोण समायोजित करें ताकि प्रकाश किरण विधानसभा बाहर निकलने उच्चतम तीव्रता में संभव है।
    4. ऑप्टिकल ट्रैक तत्वों विभिन्न अनुप्रयोगों के साथ थोड़ा अलग हो सकता के रूप में, यह सुनिश्चित करें कि सभी तत्वों यूवीए और दिखाई रेंज (315-700 एनएम) में प्रकाश संचारित।
  3. एक बार ऑप्टिकल ट्रैक इकट्ठा किया है, प्रकाश है कि एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग सेटअप के माध्यम से गुजरता उपाय। स्पेक्ट्रोमीटर जांचना पहले एक ज्ञात स्पेक्ट्रम और निर्माता के सॉफ्टवेयर के साथ एक अंशांकन दीपक का उपयोग।
    ध्यान देंहम निम्नलिखित (Avantes जैसे,) स्पष्टता लेकिन अन्य निर्माताओं के लिए महासागर प्रकाशिकी उत्पादों का उपयोग करने के लिए सेट का वर्णन तुलनीय उत्पाद बेचते हैं।
    1. माप लेने से पहले टंगस्टन अंशांकन दीपक पर बारी में कम से कम 45 मिनट।
    2. जांच करने के लिए, स्थापित जुड़े सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर के लिए यूएसबी के माध्यम से स्पेक्ट्रोमीटर देते हैं। फिर एक यूवी दृश्य संचारण कोज्या पढ़नेवाला के माध्यम से टंगस्टन अंशांकन दीपक को स्पेक्ट्रोमीटर कनेक्ट।
    3. "फाइल" टैब से "नई निरपेक्ष विकिरण मापन" का चयन करें, और जैसा कि स्पेक्ट्रोमीटर का चयन "स्रोत हैं।"
    4. एक नया अंशांकन "काल" फ़ाइल बनाने के लिए संकेतों का पालन करें। जब संकेत दिया है, दृश्य प्रकाश रेंज (300-800 एनएम) सॉफ्टवेयर है, जो स्वचालित रूप से स्पेक्ट्रोमीटर उत्पादन से सुधारा स्पेक्ट्रम की गणना करता है में अंशांकन में टंगस्टन दीपक के नाम से जाना जाता स्पेक्ट्रम के लिए उपलब्ध कराए गए आंकड़ों फ़ाइल लोड।
    5. अंशांकन फ़ाइल सहेजें। जब initi इस फ़ाइल को लोडस्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर प्रकाश स्पेक्ट्रा के भविष्य की सभी मापन के लिए सॉफ्टवेयर alizing।
  4. एक बार जब स्पेक्ट्रोमीटर calibrated है, इस का उपयोग प्रयोगात्मक स्थापना से प्रकाश स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए। इसके बाद जब सॉफ्टवेयर खोला है, "नई निरपेक्ष विकिरण मापन" का चयन करें और पहले से बचाया अंशांकन फ़ाइल लोड। अगली स्पेक्ट्रोमीटर के लिए सभी प्रकाश अवरुद्ध करके एक अंधेरे स्पेक्ट्रम ले।
    1. स्पेक्ट्रोमीटर वर्तमान में वांछित प्रयोगात्मक रोशनी की स्थिति को मापने के साथ एकीकरण के समय (4 मिसे) को समायोजित, स्कैन औसत (5), और मालगाड़ी चौड़ाई (5), तो स्पेक्ट्रम ठीक से पहुंचा और smoothed है। , सभी वर्णक्रम मापन के लिए एक ही सेटिंग्स रखें ताकि विभिन्न माप से है कि प्रकाश की तीव्रता तुलना में किया जा सकता है।
  5. Unattenuated सफेद रोशनी के लिए स्पेक्ट्रा उपाय है, सभी के लिए तटस्थ घनत्व फिल्टर प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया जा रहा है, और प्रत्येक bandpass फिल्टर हस्तक्षेप के लिए (चित्रा 2)।
    1. एमस्पेक्ट्रोमीटर के लिए कदम 2.2.2 से फाइबर ऑप्टिक केबल के मुक्त अंत affixing द्वारा प्रकाश रास्ते में किसी भी फिल्टर के बिना सफेद प्रकाश स्पेक्ट्रम easure। अंशांकन 2.3 कदम से भरी हुई फ़ाइल के साथ, एक पाठ फ़ाइल के रूप में स्पेक्ट्रोमीटर के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सफेद प्रकाश स्पेक्ट्रम बचाने के लिए।
      नोट: स्पेक्ट्रा बचाया पाठ फ़ाइलों तरंगदैर्ध्य सूची के रूप में (एक्स निर्देशांक) एक स्तंभ और दूसरे स्तंभ में प्रकाश की तीव्रता (y निर्देशांक) में है, ताकि डेटा 2.6 चरण के लिए एक स्प्रेडशीट में लोड किया जा सकता है।
    2. कदम 2.5.1 के रूप में एक ही सेटअप का उपयोग करना, प्रत्येक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) (0-3.5 ओवर ड्राफ्ट) (एनडी) ऑप्टिकल ट्रैक में फिल्टर पहिया तटस्थ घनत्व घूर्णन द्वारा प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल से स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड, और पाठ के लिए फाइल को बचाने के प्रत्येक ओवर ड्राफ्ट।
    3. कदम 2.5.1 के रूप में एक ही सेटअप का उपयोग करना, प्रकाश पथ में एक के बाद एक जगह 10 एनएम आधा बैंडविड्थ हस्तक्षेप फिल्टर और स्पेक्ट्रम प्रत्येक फिल्टर के लिए मनाया रिकॉर्ड है। 41 विभिन्न हस्तक्षेप फिल्टर के प्रत्येक w के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँith चोटी transmittances 300 से 700 एनएम के लिए हर 10 एनएम स्थान दिया गया है। आगे के अलावा (20 एनएम) स्थान दिया गया है फिल्टर सबसे अनुप्रयोगों के लिए स्वीकार्य हैं (स्पेक्ट्रा के लिए, चित्रा 2 देखें)।
  6. प्रकाश की तीव्रता में अंतर के लिए सही हस्तक्षेप फिल्टर प्रकाश पथ में रखा जाता है। प्रत्येक हस्तक्षेप फिल्टर फोटॉनों की एक अलग कुल संख्या पारित करने के लिए अनुमति देता है, और कुछ फिल्टर की कम संचरण यह मुश्किल आगे तीव्रता attenuate करने के लिए इतना है कि सभी फिल्टर फोटॉनों की अनुमति देने के बराबर संख्या में आता है।
    1. प्रत्येक 10 एनएम बैंडविड्थ हस्तक्षेप फिल्टर के लिए रिश्तेदार तीव्रता (मैं) की गणना करने के लिए, अभिव्यक्ति, मैं = टी / सेक, जहां टी (2.5.3) से प्रत्येक 10 एनएम हस्तक्षेप फिल्टर का वर्णक्रम वक्र के तहत क्षेत्र में है कि मैं के लिए हल और अधिकतम पूर्ण विकिरण सफेद रोशनी के प्रत्येक फिल्टर (520 एनएम पर एक उदाहरण के लिए चित्रा 2 देखें) के शिखर पर तरंग दैर्ध्य (y बचाया पाठ फ़ाइल के 2.5.1 से पैसे) है।
    2. सभी गणना intensit फूट डालो2.6.1 में गणना की अधिकतम तीव्रता मूल्य द्वारा एँ एक को सामान्य करने के लिए, और एक सुधार कारक प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में कच्चे संवेदनशीलता के लिए लागू के रूप में उपयोग के लिए रिश्तेदार सामान्यीकृत मूल्यों के पारस्परिक ले (6.4 चरण देखें)।
  7. केवल एक बार प्रयोगों का एक सेट के पहले कदम के माध्यम से 2.6 2.1 प्रदर्शन करना। एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर समय समय पर उज्ज्वल प्रकाश और तटस्थ घनत्व फिल्टर के तहत क्सीनन चाप दीपक के पूर्ण विकिरण रिकॉर्ड, यकीन है कि प्रकाश की तीव्रता प्रोत्साहन परिवर्तन नहीं होता है बनाने के लिए।
  8. एक प्रयोग के दौरान हस्तक्षेप फिल्टर के माध्यम से प्रेषित प्रकाश के लिए किसी भी सेलुलर प्रतिक्रिया अधिकतम प्रतिक्रिया आयाम दृष्टिकोण हैं, तो संकेत attenuate करने के लिए एन डी फिल्टर का उपयोग करें। एन डी फिल्टर एक प्रयोग के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं, तो वर्णक्रम संवेदनशीलता की गणना के दौरान तीव्रता में इसी कमी के लिए खाते।
  9. पहले प्रयोगों शुरू ऑप्टिकल ट्रैक, कैलिब्रेशन, और फिल्टर दिनों या हफ्तों के सेट करें। फिल्टर रखेंधूल संचय रोकने के लिए कवर किया।

3. रिकॉर्डिंग उपकरण सेटअप

  1. एक फैराडे पिंजरे के माध्यम से ही फाइबर ऑप्टिक केबल जांच के लिए इस्तेमाल किया फीड और इस तरह एक Cardan हाथ परिधि (चित्र के लिए चित्रा 3 देखें) के रूप में एक goniometric डिवाइस पर माउंट। केबल नमूना की आंख से लगभग 10 सेमी की दूरी पर होगा।
  2. एक इलेक्ट्रोड धारक के साथ एक vibrationally पृथक मेज पर एक धातु चरण की जगह सीधे एक micromanipulator के नियंत्रण में मंच के ऊपर (चित्रा 4) मुहिम शुरू की। Cardan हाथ इतनी जगह है कि नमूना के सिर हाथ की घूर्णी आंदोलन द्वारा बनाई क्षेत्र के केंद्र में है।
  3. एक intracellular preamplifier प्रणाली है, जो एक एम्पलीफायर (फैराडे पिंजरे के बाहर) और preamplifier (headstage, फैराडे पिंजरे के अंदर प्रस्तुत करने का पास) धातु मंच है जहां नमूना रखा जाएगा ऊपर headstage माउंट शामिल हैं का उपयोग करना।
    1. एक के माध्यम से headstage के लिए एक समाक्षीय केबल कनेक्टBNC कनेक्शन। समाक्षीय केबल के दूसरे छोर पर खुला केवल टिप विभाजित है, और भीतरी तार से केबल के बाहरी धातु म्यान अलग।
    2. दूसरे छोर पर एक मगरमच्छ क्लिप के साथ एक अछूता तांबे के तार के एक छोर से बाहरी म्यान (जमीन क्षमता पर रखा) मिलाप। यह मगरमच्छ क्लिप नमूना मंच (चरण 5.1.4) पर धातु संदर्भ इलेक्ट्रोड को जोड़ना होगा।
    3. एक पतली चांदी के तार करने के लिए समाक्षीय केबल के भीतरी तार मिलाप, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के रूप में काम करने के लिए। इस तार काफी पतली चरण 5.2.3 में समाधान-भरा गिलास इलेक्ट्रोड में खिलाया जा होना चाहिए।
  4. , एक stereomicroscope एक झूलते हाथ और फैराडे पिंजरे के बाहर लकड़ी के बेंच पर आधार से जुड़ी इतनी जगह है कि यह आंख में इलेक्ट्रोड को कम करने में आ गया हो सकता है, और फिर एक बार इलेक्ट्रोड नजर में है वापस आ गए।
  5. यकीन है कि सब कुछ धातु बनाने के अंदर फैराडे पिंजरे ठीक से आधारित है।
  6. फैराडे पिंजरे के बाहर, preamplif देते हैंएक 50-60 हर्ट्ज शोर reducer (वैकल्पिक) के इनपुट के लिए एर, और एक आस्टसीलस्कप एक BNC टी अनुकूलक का उपयोग कर के एक चैनल के लिए उत्पादन कनेक्ट।
  7. टी एडाप्टर के दूसरे छोर का उपयोग करना, हार्डवेयर संकेत के एक चैनल को आस्टसीलस्कप से गुजर कनेक्ट। एक यूएसबी केबल, जो preamplifier के साथ दर्ज की प्रतिक्रियाएं कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर के द्वारा पढ़ा जा करने की अनुमति देगा के द्वारा एक कंप्यूटर के लिए इस हार्डवेयर संलग्न।
  8. आस्टसीलस्कप एक और टी अनुकूलक का उपयोग कर के दूसरे चैनल के लिए ऑप्टिकल ट्रैक से शटर चालक देते हैं और एक पल्स जनरेटर है कि आवृत्ति और आंख (5.5 कदम) के लिए दिया प्रकाश चमक की अवधि को नियंत्रित करेगा करने के लिए इस कनेक्ट।
    नोट: रिग खुद का सेटअप केवल एक बार किया जाना चाहिए। रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए तैयार है जब तक यहां तोड़ो।

4. रिकॉर्डिंग के दिन प्रस्तुत करने का

  1. प्रयोग से पहले क्सीनन दीपक पर बारी में कम से कम 45 मिनट और कांच microelectrode खींचने पुल से पहले कम से कम 30 मिनट पर बारीलिंग कांच इलेक्ट्रोड।
  2. सभी रिकॉर्डिंग उपकरण (शटर, एम्पलीफायर, शोर एलिमिनेटर, पल्स जनरेटर, आस्टसीलस्कप, और डाटा अधिग्रहण हार्डवेयर) को चालू करें और सुनिश्चित करें कि शटर डिफ़ॉल्ट रूप से बंद कर दिया है तो कोई प्रकाश फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से गुजरता है।
  3. ठीक borosilicate (या aluminosilicate) कांच microelectrodes (100-250 MΩ प्रतिरोध आदर्श है) एक गिलास microelectrode खींचने का उपयोग खींचो। केवल खींचा जा रहा है के कुछ ही घंटा के भीतर कांच इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें।
  4. 3 एम पोटेशियम क्लोराइड (KCl) के साथ इलेक्ट्रोड backfill। ध्यान दें कि यह समाधान शोधकर्ता की जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है, जैसे इंजेक्शन डाई।

5. नमूना प्रस्तुत करने का और रिकॉर्डिंग प्रक्रिया

  1. नमूना तैयार
    1. गर्म मोम के साथ एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब के अंदर एक व्यक्ति तितली प्रत्यय तो सिर स्थिर और ट्यूब के एक छोर से फैला हुआ है। नीचे सूंड, एंटीना, और पंखों (चित्रा 5) मोम।
    2. दबाए रखें टीवह मोम की एक सूखी टुकड़े के साथ पेट और पेट के पीछे ट्यूब ट्यूब के अंदर एक गीला ऊतक रखकर humidified रहते हैं। यकीन नमूना पूरी तरह से स्थिर है सुनिश्चित करें।
    3. एक गेंद और सॉकेट संयुक्त कि एक चुंबकीय आधार से जुड़ा हुआ है के साथ एक छोटे से मंच पर मोम का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग ट्यूब माउंट।
    4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, mouthparts के माध्यम से सिर में 0.125 मिमी व्यास की एक चांदी के तार डालने के संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। प्रयोग से पहले, स्थायी रूप से इस तरह है कि चरण 3.3.2 में तांबे के तार एक बार मंच रिकॉर्डिंग के लिए मंच पर रखा गया है यह करने के लिए पर क्लिप हो सकता है में मंच करने के लिए तार को ठीक।
    5. एक बार जब संदर्भ इलेक्ट्रोड एक उपयुक्त स्थिति में है यह जल्दी से पिघल रही है और फिर तार के आसपास ठंडा मोम द्वारा जगह में रखा जा सकता है।
    6. एक नाज़ुक कार्बन इस्पात धार, एक ब्लेड धारक के साथ ब्लेड की चपेट हिस्सा एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करना और दूर तोड़ने के कॉर्निया को काटने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
    7. एक छोटे से छेद में कटौती (~ 10 ommatidiछोड़ दिया कॉर्निया में व्यास में एक) वैसलीन के साथ razorblade का उपयोग कर और सील छेद सुखाना रोकने के लिए।
  2. एक बार जब कॉर्निया कट जाता है, के रूप में जल्दी संभव के रूप में आंख में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड डालने क्योंकि आंख में hemolymph जल्दी से कठोर होगा और यह असंभव एक इलेक्ट्रोड डालने के लिए बनाते हैं। यदि संभव हो तो रिग जहां रिकॉर्डिंग जगह ले जाएगा में विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: वैसलीन आंख के बाकी पर लिप्त नहीं होना चाहिए क्योंकि इस प्रकाशिकी defocus होगा।
    1. यदि पहले से ही नहीं मंच पर, रिकॉर्डिंग रिग में मंच पर घुड़सवार नमूना और मंच जगह है। मगरमच्छ क्लिप का उपयोग नमूना मंच पर संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए कदम 3.3.2 से headstage जमीन तार कनेक्ट।
      नोट: यदि संभव हो तो पशु रोशन करने के लिए एक लाल फिल्टर का उपयोग करें।
    2. gooseneck संलग्नक संक्षेप में एक स्टिरियोस्कोप के तहत नमूना रोशनी करने के लिए, जबकि आंख में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड कम करने के साथ एक प्रकाश स्रोत का प्रयोग करें।
    3. मेंचांदी एक गिलास microelectrode की पीठ में KCl समाधान में कदम 3.3.3 से headstage से जुड़े तार Sert। इलेक्ट्रोड धारक पर कांच इलेक्ट्रोड माउंट।
    4. इलेक्ट्रोड धारक को समायोजित इतना microelectrode इससे पहले, कॉर्निया में कटौती कॉर्निया के ऊपर एक मिलीमीटर के बारे में छेद पर सीधे है। आंख में microelectrode micromanipulator का उपयोग जब तक एक सर्किट पूरा हो गया है के रूप में आस्टसीलस्कप पर क्षमता (एम वी) में एक बड़े परिवर्तन के द्वारा दिखाया कम करें।
  3. एक बार आंख में, फैराडे पिंजरे के बाहर त्रिविमदर्शी झूले, और प्रकाश स्रोत नमूना रोशन बंद कर देते हैं। कमरे में अंधेरा रखा जाना चाहिए ताकि आंख अंधेरे रूपांतरित हो जाता है।
  4. एम्पलीफायर से एक 1 Na वर्तमान लगाने और वोल्टेज में परिवर्तन टिप्पण द्वारा इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध की जाँच करें। प्रतिरोध आम तौर पर 100-250 MΩ के बीच सीमा में होना चाहिए। उच्चतर resistances रुकावट या इलेक्ट्रोड के झुकने, और electr के कम प्रतिरोध का संकेत कर रहे हैंस्तोत्र टूटना।
  5. पल्स जनरेटर सक्रिय करें ताकि शटर एक 50 मिसे अवधि के साथ प्रकाश की एक फ्लैश हर 0.5 सेकंड की इजाजत दी खोलता है, और यह प्रयोग की अवधि के लिए चमकती जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. पल्स जनरेटर को समायोजित करें तो यह अप करने के लिए 50 मिसे अवधि की चमक की अनुमति देता है। चमक के बीच यह अवधि और 0.5 सेकंड ठहराव प्रयोग के दौरान संभव के रूप में रूपांतरित करने के लिए निकट के रूप में अंधेरे नमूना रहता है। पचास मिसे कम से कम फ़्लैश अवधि कि अब फ्लैश durations के रूप में प्रतिक्रिया में ही आयाम प्रकाश में लाना होगा के करीब है।
    2. फिर से मापने के दोनों शुरुआत और प्रयोग (5.16 चरण) के अंत में हिमायती हैं। के बारे में एक बीस मिनट प्रयोग के दौरान, इन फ़्लैश सेटिंग्स समय के साथ प्रतिक्रिया नीचा नहीं है। विभिन्न preps ये फ़्लैश सेटिंग करने के लिए समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।
  6. Cardan हाथ की स्थिति तो यह है कि फाइबर ऑप्टिक केबल आंख की ओर निर्देशित है।
  7. प्रत्येक प्रकाश फ्लैश के साथ वोल्टेज परिवर्तन के लिए आस्टसीलस्कप की जाँच करें।वोल्टेज में एक नकारात्मक परिवर्तन का प्रतीक है कि इलेक्ट्रोड अभी तक एक सेल में दर्ज नहीं किया गया है।
  8. जब तक यह आंख, जिस पर वहाँ एक अधिकतम वोल्टेज प्रतिक्रिया है के लिए एक कोण पर तैनात है नमूना आसपास Cardan हाथ ले जाएँ।
  9. micromanipulator आगे और पीछे घुमाने के लिए, दोनों दिशाओं में इलेक्ट्रोड की बहुत छोटी ऊर्ध्वाधर आंदोलनों के कारण, जबकि हल्के से इलेक्ट्रोड धारक के आधार दोहन या preamplifier पर बज़ समारोह का उपयोग। जब तक एक depolarizing प्रकाश प्रतिक्रिया आस्टसीलस्कप (चित्रा 6) पर प्रकट होता है छोटे समायोजन करने के लिए आगे बढ़ें।
  10. घटना के कोण जहां प्रकाश की एक फ्लैश सबसे बड़ा depolarizing संकेत पैदा लगाने के लिए Cardan हाथ फिर से समायोजित करें। micromanipulator के साथ छोटे समायोजन करने और इलेक्ट्रोड के रूप में यकीन स्थिरतापूर्वक सेल रिकॉर्डिंग और यह पूरे प्रयोग के लिए सेल में रहना होगा बनाने के लिए आवश्यक है कि एम्पलीफायर पर बज़ समारोह का उपयोग (चरण 5.11 देखें)।
  11. एक बार स्थापना स्थिर है, सिफारिश शुरूrding। (: 1 शोर अनुपात करने के संकेत कम से कम एक 10) एक स्थिर रिकॉर्डिंग क्षमता, कम पृष्ठभूमि शोर, और एक लगातार बड़े depolarizing प्रतिक्रिया आराम में कोई परिवर्तन करने के लिए छोटी होनी चाहिए।
    1. कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर को चलाने, और एक "नया प्रयोग है," जो चार चैनलों के साथ एक पॉप अप विंडो खुलेगा शुरू करते हैं।
    2. 500 एम वी सॉफ्टवेयर विंडो के ऊपरी दाएँ कोने में वोल्टेज पैमाने को समायोजित करें। पहला चैनल है, तो संकेत आस्टसीलस्कप के माध्यम से डाटा अधिग्रहण हार्डवेयर को खिलाया जाता है, प्रतिक्रियाओं वास्तविक समय में इलेक्ट्रोड से दर्ज प्रदर्शित जबकि दूसरे चैनल वर्ग तरंग समारोह जनरेटर द्वारा उत्पादित रिकॉर्ड होगा, दिखा रहा होगा जब शटर खुला है । अन्य दो चैनलों अनावश्यक हैं।
    3. रिकॉर्डिंग शुरू, और सॉफ्टवेयर प्रयोग की अवधि के लिए चलाने के लिए अनुमति देने के लिए नीचे दाहिने हाथ कोने में "प्रारंभ" पर क्लिक करें। एक्स (समय) और वाई (वोल्टेज) के ज़ूम समायोजित इतना है कि कुल्हाड़ियों प्रतिक्रियाओं स्पष्ट कर रहे हैं।
  12. सबसे पहले, सफेद रोशनी के साथ, ऊपर एन डी फिल्टर पहिया के साथ 10 अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के लिए 3.5 ओवर ड्राफ्ट (5-10 के बारे में सेकंड) पर रिकॉर्ड है।
  13. अगले रिकॉर्ड ही हर संयोजन में 3.3 ओवर ड्राफ्ट पर प्रतिक्रियाओं की संख्या है, तो 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, 0.0 आदि आयुध डिपो तक। विरंजन होती है, तो एन डी फिल्टर श्रृंखला के लिए ये प्रतिक्रिया आयाम धारा 6 में प्रतिक्रिया लॉग तीव्रता वक्र प्रदान करते हैं, प्रयोग के दौरान उज्ज्वल उत्तेजनाओं की कम चमक का प्रयोग करेंगे।
  14. सभी तरंग दैर्ध्य के लिए सेल की प्रतिक्रिया रिकॉर्ड, हस्तक्षेप फिल्टर का उपयोग कर।
    1. पहली शिखर तरंगदैर्ध्य पाते हैं। प्रकाश पथ (0.0 ओवर ड्राफ्ट) में एन डी फिल्टर के बिना, प्रकाश पथ में एक यूवी फिल्टर जगह संचारण और संक्षिप्त प्रतिक्रिया आयाम निरीक्षण करते हैं। एक नीले रंग की संचारण फिल्टर, एक हरे रंग की संचारण फिल्टर, और एक लाल संचारण फिल्टर, जो जहां चोटी प्रतिक्रिया होगी के कुछ सुझाव देना चाहिए साथ दोहराएँ।
    2. के बारे में फिल्टर का प्रयोग 350, 450, 550, 650 एनएम पीक संवेदनशीलता के सामान्य क्षेत्र में खोजने के लिएकदम 5.14.1। सटीक तरंग दैर्ध्य इस प्रारंभिक चरण में खोज कोई फर्क नहीं पड़ता क्योंकि सभी तरंग दैर्ध्य अगले चरण में दर्ज हो जाएगा। अनुमान शिखर संवेदनशीलता के मौजूद हैं, या वे पहले से रिकॉर्ड किया गया है, तरंग दैर्ध्य उपयोग में जाना जाता है जल्दी से चोटी प्रतिक्रिया की पहचान।
    3. एक बार शिखर प्रतिक्रिया या इसे बंद की पहचान की है, 10 उत्तर (लगभग 5 सेकंड) के लिए इस तरंग दैर्ध्य में रिकॉर्ड है।
    4. 10 एनएम कदम पर, शिखर प्रतिक्रिया, अन्य हस्तक्षेप फिल्टर के साथ रिकॉर्ड की तरंग दैर्ध्य में रिकॉर्डिंग 300-700 एनएम से करने के बाद। चोटी से शुरू करें और फिल्टर (एक से एक प्रकाश पथ से बाहर गमागमन जैसे अगर चोटी प्रतिक्रिया 520 एनएम पर है, इस तरंग दैर्ध्य, पहले तो 510 एनएम पर रिकॉर्ड प्रतिक्रियाओं, 530 के बाद से दोनों छोटे और लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य की ओर बाहर कदम एनएम, 500 एनएम, 540 एनएम, 490 एनएम, 550 एनएम, और इतने पर जब तक कोई कोई जवाब नहीं है)।
    5. फिल्टर प्रति अप करने के लिए 10 उत्तर (5 मिनट प्रत्येक) के लिए अनुमति दें। जब हस्तक्षेप फिल्टर स्वैपिंग, सेल resp करने की अनुमतिदूसरी प्रकाश पथ, जो शिखर प्रतिक्रिया समय के साथ अपमानजनक है कि क्या नजर रखने के लिए उपयोगी है में किसी भी फिल्टर के बिना सफेद रोशनी की चमक को 1-2। प्रतिक्रियाओं की संख्या में कमी या आयुध डिपो में वृद्धि करता है, तो ब्लीचिंग होता है।
  15. अगर किसी हस्तक्षेप के फिल्टर के तहत भी प्रतिक्रिया 0 आयुध डिपो पर सफेद रोशनी के तहत अधिकतम प्रतिक्रिया के करीब है, तो एन डी फिल्टर के साथ attenuate। हस्तक्षेप फिल्टर और फाइबर ऑप्टिक इस प्रयोग में इस्तेमाल केबल के आकार बहुत प्रकाश की तीव्रता attenuate और इतने एन डी फिल्टर आम तौर पर जरूरत नहीं है।
  16. रिकॉर्डिंग चोटी प्रतिक्रिया है, जो पिछले प्रतिक्रिया आयाम की पुष्टि के लिए एक pseudoreplicate के रूप में कार्य करता है और प्रतिक्रिया समय के साथ अपमानित नहीं किया गया है यह सुनिश्चित करने में मदद करता है के आसपास स्थिर, फिर से रिकॉर्ड तरंग दैर्ध्य रहता है। एक बार सभी तरंग दैर्ध्य दर्ज कर रहे हैं, फिर से रिकॉर्ड एनडी श्रृंखला के तहत प्रतिक्रियाओं, कदम 5.12 के रूप में।
  17. एक बार रिकॉर्डिंग पूरा सॉफ्टवेयर पर क्लिक करें "बंद करो", और विश्लेषण के लिए रिकॉर्डिंग बचाने के लिए।
  18. एक प्रयोग के बाद, ठंड, या तेजी से सिर और छाती को कुचल विच्छेद के द्वारा पीछा कई मिनट के लिए ठंडा करके अलग-अलग बलिदान।
  19. सभी उपकरण बंद कर दें। यहाँ तोड़ विश्लेषण करने से पहले की जरूरत है।

6. स्पेक्ट्रल संवेदनशीलता विश्लेषण

  1. कच्चे प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ, एन डी श्रृंखला में और प्रत्येक हस्तक्षेप फिल्टर के लिए प्रत्येक फिल्टर के लिए 10 अलग-अलग प्रतिक्रियाओं का मतलब प्रतिक्रिया आयाम की गणना।
  2. एक प्रतिक्रिया लॉग तीव्रता (VlogI) 5.12-5.13 चित्रा (7) चरणों में दर्ज एन डी फिल्टर श्रृंखला से समारोह बनाएँ। वाई अक्ष पर प्रत्येक तीव्रता के लिए एक्स अक्ष पर तीव्रता (ओडी), और प्रतिक्रिया का लॉग इकाइयों की साजिश रचने के द्वारा इस करो।
    1. अलग तरंग दैर्ध्य पर सेल के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए, आम तौर पर 6.2 कदम से डेटा के नाका-रशटन समीकरण फिट है, और इस समीकरण का उपयोग अलग तरंग दैर्ध्य टी की प्रयोगात्मक प्राप्त वर्णक्रम प्रतिक्रियाओं से संबद्ध करने कीओ रिश्तेदार एक निरंतर तरंग दैर्ध्य के तहत उस प्रतिक्रिया (इस मामले में श्वेत प्रकाश) को प्रकाश में लाना आवश्यक फोटॉनों।
      नोट: नाका-रशटन समीकरण है: वी / वी मैक्स = मैं n / (मैं n + K एन), जहाँ मैं उत्तेजना तीव्रता है, वी प्रतिक्रिया आयाम है, वी मैक्स अधिकतम प्रतिक्रिया आयाम है, कश्मीर प्रोत्साहन है n तीव्रता आधा वी अधिकतम दे रही है, और घातीय ढलान है। विभिन्न तरीकों वक्र ढाले सॉफ्टवेयर, या कोड आधारित सांख्यिकीय संकुल सहित VlogI आंकड़ों के इस समीकरण फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. सरल गणित और एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग नाका-रशटन समीकरण फिट करने के लिए, प्रत्येक उत्तेजना तीव्रता के लिए VlogI प्रतिक्रिया डेटा को बदलने: लॉग ऑन [(वी मैक्स / वी) - 1]। तब सबसे अच्छा फिट की लाइन का समीकरण बदल पाने के लिए डेटा पर रेखीय प्रतिगमन प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: वी अधिकतम किसी भी मापा प्रतिक्रियाओं से अधिक होना चाहिए; इस अनुरूप रखने के लिए, इस विधि वी अधिकतम 1% जीआरई के रूप में अनुमानउच्चतम मापा प्रतिक्रिया से अटर।
    3. प्रतिगमन लाइन के समीकरण से, प्रतिपादक (एन) नकारात्मक ढलान लेने के द्वारा अनुमान है, और लॉग (कश्मीर) = y अवरोधन / एन।
  3. एक बार के लिए वी मैक्स, एन, और कश्मीर के मापदंडों का अनुमान लगाया गया है, के रूप में (वी) एक दिया तरंग दैर्ध्य में मापा जाता वर्णक्रम जवाब में plugging द्वारा प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में सेल के वर्णक्रमीय प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना आवश्यक फोटॉनों और सुलझाने के रिश्तेदार संख्या का निर्धारण मैं के लिए
  4. प्रत्येक हस्तक्षेप फिल्टर प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में (कदम 2.4.3 से) के लिए सुधार कारक से कदम 6.3 से गणना की उत्तेजना तीव्रता (मैं) गुणा करें।
  5. संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए, सभी तीव्रता वी लॉग-मैं वक्र से संबंधित होना चाहिए ताकि वे तुलना में किया जा सकता है। वी अधिकतम या कश्मीर आधा करने के लिए प्रत्येक तरंग दैर्ध्य तीव्रता संबंधित द्वारा यह मत करो, चरण 6.2.3 में गणना की थी।
    1. प्रत्येक को सही तरंगदैर्ध्य तीव्रता (चरण 6.4) लालकृष्ण से घटाना
    2. फिर प्रत्येक तरंग दैर्ध्य तीव्रता के लिए, यह जोड़ने के लिए "दूरी कश्मीर "मूल्य से कश्मीर के लिए, और गुणा (-1)।
    3. इसके बाद प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए श्रृंखला में सबसे कम डेटा बिंदु के निरपेक्ष मूल्य जोड़कर सकारात्मक सभी डेटा अंक लाना।
  6. चरण 6.5.1 से सभी नव गणना की तीव्रता के पारस्परिक लेने के द्वारा प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में संवेदनशीलता का पता लगाएं। तो यह है कि संवेदनशीलता स्पेक्ट्रम 0 और 1 के बीच गिर डेटा रूपांतरण।
  7. एक ही प्रकार के औसत के एक से अधिक सेल से रिकॉर्डिंग मानक त्रुटि सलाखों के या 95% विश्वास अंतराल (चित्रा 8) के साथ अंतिम प्रतिक्रियाओं और साजिश करने के बाद।

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Representative Results

रिकॉर्डिंग सेटअप के कई तत्वों के लिए, एक प्रश्न के लिखित विवरण पर्याप्त विस्तार प्रदान नहीं करता है। चित्रा 1 पूरी रिकॉर्डिंग सेटअप में शामिल घटकों के एक योजनाबद्ध है। चित्रा 2 में, स्पेक्ट्रा सफेद रोशनी और प्रत्येक हस्तक्षेप फिल्टर के लिए साजिश रची है क्यों एक सुधार कारक की जरूरत है की भावना और क्या इस सुधार की गणना करने की जरूरत है देने के लिए। चित्रा 3 तस्वीरें और है कि इन के लिए प्रयोग किया जाता है Cardan हाथ का एक चित्र से पता चलता है प्रयोगों। चित्रा 4 एक समग्र रिकॉर्डिंग मंच और micromanipulator दिखा छवि है। चित्रा 5 प्रयोग के लिए एक तितली की तैयारी में कई कदम से पता चलता है।

एक बार एक रिकॉर्डिंग शुरू होता है, एक प्रकाश फ्लैश के जवाब में वोल्टेज में एक नकारात्मक बदलाव का मतलब है कि इलेक्ट्रोड एक सेल के बाहर है, चित्रा 6A के रूप में। प्रतिक्रिया की ताकत इलेक्ट्रोड की निकटता पर निर्भर करता हैएक फोटोरिसेप्टर सेल, और प्रकाश फ्लैश की घटना के कोण को टिप। प्रतिक्रिया बड़ा होना चाहिए (> 30 एम वी) से पहले टिप एक सेल कोंचना करने के लिए पर्याप्त के पास है। चित्रा 6B, एक प्रकाश प्रोत्साहन के लिए एक स्पष्ट depolarizing प्रतिक्रिया से पता चलता एक फोटोरिसेप्टर सेल में प्रवेश वाचक। विश्राम क्षमता स्थिर होना चाहिए और प्रतिक्रिया आयाम बड़ा होना चाहिए (कम से कम 40 एम वी), हालांकि पूर्ण आयाम काफी भिन्न हो सकते हैं। हम रिश्तेदार प्रतिक्रिया उपाय है, तो यह अधिक महत्वपूर्ण है कि शोर अनुपात करने के लिए संकेत अधिक है। संभावित परिवर्तनों आराम कर बहुत हैं, तो प्रतिक्रिया तरंग असामान्य लग रहा है, या अधिकतम प्रतिक्रिया बहुत कम है, तो रिश्तेदार प्रतिक्रियाओं की तुलना भर में सभी हस्तक्षेप फिल्टर असंभव हो जाता है। व्यर्थ रिकॉर्डिंग के उदाहरण चित्रा 6C, 6D में दिखाया जाता है।

एक सफल रिकॉर्डिंग पूरा करने के बाद, एन डी प्रतिक्रियाओं साजिश रची किया जाना चाहिए और नाका-रशटन समीकरण डेटा 33 के लिए फिट किया जाना चाहिए, एसhown चित्रा 7 में। यह आंकड़ा किसी भी हस्तक्षेप के बिना फिल्टर एन डी फिल्टर श्रृंखला का उपयोग कर साजिश रची है। अगर रिकॉर्डिंग स्थिर है, एन डी फिल्टर श्रृंखला से डेटा से पहले और प्रयोग के बाद समान होना चाहिए। स्पेक्ट्रल संवेदनशीलता, चित्रा 7 में VlogI साजिश करने के लिए नाका-रशटन समीकरण फिटिंग, तो एक दिया तरंग दैर्ध्य में प्रत्येक प्रतिक्रिया (वी) के लिए (आई) के लिए हल करके निर्धारित प्रोटोकॉल की धारा 6 की गणना में समझाया गया है।

वर्णक्रमीय संवेदनशीलता का एक प्रतिनिधि उदाहरण के लिए एक एकल रिकॉर्डिंग से निकाली गई चित्रा 8A में साजिश रची है (कृपया ध्यान दें इस उदाहरण वास्तविक गणना आंकड़ों से पता चलता है, लेकिन इस परिणाम के रूप में अप्रकाशित है चोटी स्थानांतरित कर दिया गया है)। सेल प्रकार एक समान तरंग दैर्ध्य में चोटी संवेदनशीलता और संवेदनशीलता स्पेक्ट्रम के समग्र आकार के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है। इसी प्रकार की कोशिकाओं तो औसत रहे हैं और मतलब संवेदनशीलता figu में प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में मानक त्रुटि सलाखों के साथ साजिश रची हैफिर से 8b। (परिमाण और त्रुटि सलाखों के वास्तविक आंकड़ों से गणना कर रहे हैं, लेकिन चोटियों स्थानांतरित कर दिया जाता है) तीन विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में पाया एक कीट की स्पेक्ट्रल संवेदनशीलता चित्रा 8 में दिखाया जाता है।

चित्र तीन

चित्रा 1:। प्रकाश पथ की रिकॉर्डिंग घटक घटक के योजनाबद्ध, सेटअप नमूना, और रिकॉर्डिंग हार्डवेयर संकेत कर रहे हैं। ऑप्टिकल ट्रैक फैराडे पिंजरे के बाहर लकड़ी के बेंच पर बैठता है। XE, क्सीनन चाप दीपक, सीडी, कंडेनसर विधानसभा, LX, उत्तल लेंस, एन डी, तटस्थ घनत्व फिल्टर पहिया, सीएफ, हस्तक्षेप फिल्टर, एस, शटर, नियंत्रण रेखा, अवतल लेंस, सह , collimating किरण जांच, एफओ, फाइबर ऑप्टिक केबल। फैराडे पिंजरे पर बैठता हैनमूना चारों ओर लकड़ी के बेंच। लकड़ी के बेंच के ऊपर बैठता है, लेकिन vibrationally पृथक संगमरमर की मेज के नीचे स्पर्श नहीं करता है। रिकॉर्डिंग (आर सी) और संदर्भ (आरएफ) इलेक्ट्रोड headstage (एचएस) से जुड़े होते हैं। आर सी आंख (ई) में पेश किया जाता है और आरएफ शरीर के दूसरे हिस्से में शुरू की है। Headstage फैराडे पिंजरे के बाहर preamplifier (पा) सेटअप का हिस्सा है। संकेत पाखण्ड शोर reducer (एचबी) के माध्यम से preamplifier से पारित कर दिया, और आस्टसीलस्कप (ओएस) में किया जाता है। आस्टसीलस्कप से संकेत Powerlab हार्डवेयर (पीएलबी) के माध्यम से और लैपटॉप कंप्यूटर (सीपीयू) जहां यह LabChart सॉफ्टवेयर द्वारा पढ़ा जाता है में पारित कर दिया है। शटर एक समारोह जनरेटर (FG) जो आस्टसीलस्कप पर एक दूसरे चैनल के माध्यम से पारित कर दिया जाता है के द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और अगर यह संकेत के रूप में अच्छी तरह से दर्ज किया जा रहा है Powerlab भी हार्डवेयर पर एक दूसरे चैनल के माध्यम से पारित किया जा सकता है।

चित्रा 5

चित्रा 2:। सफेद रोशनी और हस्तक्षेप फिल्टर स्पेक्ट्रा सुधार कारकों गणना के लिए इस्तेमाल स्पेक्ट्रा प्रोटोकॉल का 2.5 कदम में मापा सफेद प्रकाश के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रत्येक 41 हस्तक्षेप फिल्टर के लिए, 300 से 700 एनएम के लिए दिखाए जाते हैं। प्रत्येक हस्तक्षेप फिल्टर स्पेक्ट्रम प्रकाश पथ में केवल यह है कि फिल्टर के साथ मापा जाता है। टी 520 शिखर 520 एनएम के साथ फिल्टर के लिए स्पेक्ट्रम के तहत क्षेत्र से मेल खाती है, और एस 520 फिल्टर, 520 एनएम के शिखर तरंग दैर्ध्य में सफेद रोशनी की तीव्रता से मेल खाती है। इन मूल्यों को प्रत्येक फिल्टर (इस मामले में 520 एनएम) के लिए सुधार कारकों की गणना के प्रोटोकॉल में 2.6 कदम के रूप में वर्णित किया जाता है।

चित्रा 3:। Cardan शाखा परिधि का विवरण प्रयोगों में इस्तेमाल किया Cardan हाथ फाइबर ऑप्टिक केबल रखती है और पूर्ण गोलाकार रोटेशन और कोणीय समायोजन इतना है कि प्रकाश सेल को घटना की सही कोण दर्ज की जा रही पर दिया जा सकता है की अनुमति देता है। (ए) शीर्ष नीचे दृश्य। (बी) के एक कोण पर पक्ष से देखें। नंबर सभी पैनलों में एक ही हिस्से के अनुरूप हैं। (1) नीचे की थाली क्षैतिज प्लेन में पूर्ण परिपत्र रोटेशन की अनुमति देता है। (2) खड़ी प्लेट एक ऊर्ध्वाधर विमान में हाथ से भरा परिपत्र रोटेशन की अनुमति देता है। (3) इस सिलेंडर अंत पर फाइबर ऑप्टिक केबल के साथ धातु हाथ रखती है, और यह (2) के लिए सीधा परिपत्र रोटेशन के एक दूसरे खड़ी विमान की अनुमति देता है। (4) फाइबर ऑप्टिक केबल आयोजित किया जाता रहाहाथ के अंत में n जगह है, और प्रकाश प्रयोगात्मक सेटअप में नमूना के स्थान की ओर निर्देशित है।

आकृति 1
चित्रा 4:। रिकॉर्डिंग सेटअप के घटकों (ए) प्लास्टिक ट्यूब नमूना धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (बी) मंच है जिस पर नमूना और ट्यूब बढ़ रहे हैं के उपरि दृश्य। (सी) चुंबकीय आधार (1) के साथ गेंद और संयुक्त मंच के साइड देखें। संदर्भ इलेक्ट्रोड गोंद और मंच (2) के पक्ष में मोम के साथ स्थिर रखा है। संदर्भ इलेक्ट्रोड मगरमच्छ क्लिप के चारों ओर लिपटा और जगह में soldered, एक लगाव क्षेत्र है जहां headstage संदर्भ इलेक्ट्रोड क्लिप कर सकते हैं (3) प्रदान करते हैं। (डी) इलेक्ट्रोड 20X बढ़ाई तहत टिप। स्केल बार, 25 माइक्रोन। (ई) स्टेज, इलेक्ट्रोड धारक, और micromanipulator सेटअप। headstage (1) के साथ तंत्र ऊपर तय हो गई हैचांदी रिकॉर्डिंग तार (2), और मगरमच्छ क्लिप के साथ संदर्भ इलेक्ट्रोड (3) संलग्न। इलेक्ट्रोड धारक (4) एक मैनुअल micromanipulator से तय हो गई है (5) कि नीचे एक पोस्ट के साथ खड़ी आंदोलन के लिए एक दस्ता के साथ समायोजित किया जा सकता है या या धक्का दिया जा सकता है इलेक्ट्रोड धारक की क्षैतिज आंदोलन के लिए खींच लिया। नमूना के साथ चुंबकीय मंच मंच (6) सिर्फ इलेक्ट्रोड धारक नीचे पर बैठता है। (एफ) फैराडे पिंजरे एक स्क्रीन है कि ऊपर या सामने नीचे खींच लिया जा सकता है के साथ रिकॉर्डिंग सेटअप के चारों ओर। एल्यूमिनियम पन्नी शीर्ष पर रबर पैड के साथ सभी उपकरणों के नीचे रखा गया है। फाइबर ऑप्टिक केबल (1) के बाहर ऑप्टिकल ट्रैक से पिंजरे में जाता है, और Cardan हाथ (2) मंच (3) की ओर से निर्देशित है। रिकॉर्डिंग मंच और जोड़तोड़ तंत्र एक रेत बॉक्स (4) सेटअप के नीचे एक संगमरमर की मेज पर आराम में रखा गया है। अन्य सभी उपकरण लकड़ी के बेंच शीर्ष कि संगमरमर तालिका स्पर्श नहीं करता है पर टिकी हुई है। रेत बॉक्स एक छेद में संगमरमर तालिका के शीर्ष पर बैठता है, लकड़ी की मेज से बाहर कटौती तो यह है कि पूरी तरह से नमूना vibrationally लकड़ी टेबलटॉप पर उपकरणों से अलग है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 5:। तितली तैयारी (ए) तितली ट्यूब और सिर, पंखों में डाला जाता है, और एंटीना गर्म मोम के साथ स्थिर कर रहे हैं। उदासीन इलेक्ट्रोड mouthparts (1), शुष्क मोम का एक टुकड़ा पेट (2), और एक गीला ऊतक नमूना के पीछे रखा गया है नीचे पकड़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है में डाला जाता है। (बी) के सिर के ऊपर बंद नीचे लच्छेदार। आंख से (1) मोम या मलबे से साफ रखा जाता दर्ज किया है, और संदर्भ इलेक्ट्रोड (2) mouthparts में डाला जाता है और गर्म मोम जल्दी से पिघल रहा है पर यह जगह में रखने के लिए।(सी) आंख जहां गुलाबी-सफेद फोटोरिसेप्टर सेल परत देखा जा सकता है में एक छेद में कटौती। काले रंग और पीले hemolymph अनुपस्थित रहे हैं। (डी) एक गिलास रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (1) आँख में रखा, और उदासीन इलेक्ट्रोड के साथ नमूना के पार्श्व दृश्य (2) सिर मंच है, जो एक सर्किट के रूप में आस्टसीलस्कप पर देखा पूरा करना चाहिए करने के लिए संलग्न। देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।


चित्रा 6

चित्रा 6:। नमूना रिकॉर्डिंग से कच्चे जवाब प्रत्येक प्रतिक्रिया 50 मिसे अवधि (काली सलाखों) की एक भी प्रकाश फ्लैश से मेल खाती है। (ए) बड़ी नकारात्मक वोल्टेज परिवर्तन का एक उदाहरण है कि अभी देखा जाना चाहिएएक सेल में प्रवेश करने से पहले। (बी) एक स्वच्छ रिकॉर्डिंग छोटी सी पृष्ठभूमि शोर और एक बड़े depolarizing प्रतिक्रिया, आम तौर पर कम से कम 40 एम वी होनी चाहिए। (सी) मुख्य शिखर (तीर) के बाद नकारात्मक संभावित परिवर्तन के कारण एक गरीब रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण है। (डी) एक बुरा रिकॉर्डिंग का एक और उदाहरण। विश्राम क्षमता बड़े उतार-चढ़ाव (लाल पट्टी) और पृष्ठभूमि शोर की बड़ी राशि प्रतिक्रिया (नोक) के आयाम को अस्पष्ट कर सकते हैं के दौर से गुजर रहा है।

चित्रा 7
चित्रा 7:। रिस्पांस तीव्रता लॉग-रेखीय समारोह ठोस हलकों इस प्रयोगात्मक स्थापना के लिए, 0 आयुध डिपो के लिए 3.5 से एक सेल की प्रतिक्रियाएं मापा जाता दिखा। हल्की तीव्रता एक लघुगणकीय पैमाने पर है। बहुत उच्च तीव्रता पर प्रतिक्रिया संतृप्त है, और बहुत कम तीव्रता में एक छोटे से प्रतिक्रिया के बजाय रेखा के साथ शून्य करने के लिए छोड़ने की बनी हुई है। टीवह नाका-रशटन समीकरण 33 इस गैर रेखीय आकृति (बिंदीदार रेखा) के लिए फिट है।

आंकड़ा 8
8 चित्रा:। स्पेक्ट्रल संवेदनशीलता उदाहरण (ए) के एक भी प्रतिनिधि सेल की प्रतिक्रियाएं दर्ज किए गए और रिश्तेदार वर्णक्रमीय संवेदनशीलता गणना की गई। इस सेल के शिखर, 440 एनएम पर है, जिसका अर्थ यह जवाब नीले रंग की रोशनी के लिए सबसे अच्छा। एकल कोशिका डेटा लग सकता शोर (380 एनएम पर चोटी)। (बी) के ही रिश्तेदार चोटी और आकार के साथ कोशिकाओं को एक साथ औसत और मानक त्रुटि सलाखों जोड़ रहे हैं। इधर, सात व्यक्तियों से सात नीले रंग की कोशिकाओं को मजबूत सबूत है कि एक सेल प्रकार इस प्रजाति ज़्यादा से ज़्यादा 440 एनएम पर प्रकाश के प्रति संवेदनशील उपलब्ध कराने में मौजूद औसतन थे। (सी) यह प्रक्रिया सभी प्रकार की कोशिकाओं में पाया गया के लिए दोहराया जा सकता है, और एक साथ साजिश रची। कीट आँखें उनके वर्णक्रमीय संवेदनशीलता लेकिन एक ठेठ भारतीय नौसेना पोत में व्यापक रूप से भिन्नect 370 एनएम, 440 एनएम, और 510 एनएम पर, यहाँ दिखाया चोटियों हो सकता है। ध्यान दें, इन वर्णक्रमीय संवेदनशीलता सभी वास्तविक डेटा का उपयोग कर गणना कर रहे हैं, बल्कि इसलिए कि डेटा अभी तक इस प्रजाति के लिए प्रकाशित नहीं है चोटियों भर्ती कराया गया है।

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Discussion

Intracellular रिकॉर्डिंग शामिल कई तकनीकी कदम के कारण मास्टर करने के लिए एक मुश्किल तकनीक हो सकता है। सफल प्रयोगों के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, यह एक अच्छी तरह से vibrationally-पृथक टेबल है जिस पर प्रयोग किया जाता है के लिए महत्वपूर्ण है। कई शोधकर्ताओं हवा टेबल, जो पूरी तरह से आधार से टेबलटॉप अलग, बेहतर कंपन अलगाव देने का उपयोग करें। हमारे सेटअप शीर्ष पर एक sandbox है, जो में micromanipulator / इलेक्ट्रोड धारक / नमूना चरण तंत्र रखा गया है के साथ एक मोटी संगमरमर तालिका शामिल है। यह एक हवाई तालिका करने के लिए एक प्रभावी और अधिक किफायती विकल्प है, खासकर अगर घर में गैस या संपीड़ित हवा के लिए उपयोग एक सीमा है। अतिरिक्त कंपन को अवशोषित उपायों निष्क्रिय हवा निलंबन, या टेबल पैर करने के लिए cushioning के तत्वों के अतिरिक्त के रूप में इस तरह लिया जा सकता है (जैसे, टेनिस गेंदों, बाइक ट्यूब, मोटी जेल पैड खोला)। इसके अलावा, यह जरूरी है कि एक प्रयोगात्मक स्थापना के अंदर होसब कुछ के साथ फैराडे पिंजरे ठीक से जमीन। फैराडे पिंजरे सामने है कि जब पिंजरे के अंदर काम कर रहे हैं जब रिकॉर्डिंग हटाया जा सकता है और उनकी जगह आसानी से में एक धातु जाल स्क्रीन होनी चाहिए। यहाँ तक कि परिवेश बिजली के शोर (मुख्य एसी बिजली की आपूर्ति से विशेष रूप से 50 हर्ट्ज शोर) की एक छोटी राशि एक अन्यथा अच्छा रिकॉर्डिंग निकम्मा बना सकते हैं।

जब नमूना, hemolymph और वर्णक ommatidia आसपास परतों तैयारी सफल रिकॉर्डिंग रोक सकता है। कॉर्निया में छेद बहुत बड़ी कटौती है, तो शरीर में hemolymph के सामान्य पंप एक अस्थिर रिकॉर्डिंग में जिसके परिणामस्वरूप, ऊपर और नीचे स्थानांतरित करने के लिए कटौती साइट पर तरल सतह का कारण बनता है। एक बार छेद में कटौती कर रहा है, hemolymph और सतह वर्णक परतें भी जब पेट्रोलियम जेली के साथ बंद एक अभेद्य पपड़ी में तेजी से थक्का होगा, तो यह जितनी जल्दी हो सके आंख में इलेक्ट्रोड पाने के लिए महत्वपूर्ण है। घंटी समाधान भी वैसलीन के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। जमीन इलेक्ट्रोड में पेश किया जा सकता हैmouthparts या एक कट एंटीना के स्टंप में।

इसके अतिरिक्त, यह अक्सर पशु के रूप में काले अनुकूलित संभव के रूप में रखने के लिए उपयोगी है। इस विधि के लिए, कदम बहुत ही गहरे रिकॉर्डिंग रूम रखने में शामिल हैं, फैराडे पिंजरे, लघु अवधि प्रोत्साहन चमक (30-50 मिसे), और चमक (0.5 या अधिक) के बीच एक बहुत कम आवृत्ति में प्रवेश करने से क्सीनन दीपक से आवारा प्रकाश अवरुद्ध। एक दृश्य वर्णक एक फोटोन को अवशोषित कर लेता है, rhodopsin में क्रोमोफोर 11 सीआईएस सभी -3-hydroxyretinal से स्विच - ट्रांस -retinal, opsin प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन उत्प्रेरण, और जो जी प्रोटीन शुरू की metarhodopsin के रूप में पूरे परिसर, सक्रिय झरना। तस्वीर विरंजन तब होता है जब उच्च तीव्रता प्रकाश क्रोमोफोर शारीरिक रूप से opsin प्रोटीन से अलग करने के लिए कारण बनता है। क्योंकि इलेक्ट्रोड केवल स्थिरतापूर्वक समय की एक निश्चित अवधि के लिए सेल के भीतर से प्रतिक्रियाएं रिकॉर्ड होगा पहले यह समय बाहर हो जाता है इस प्रयोग में एक सीमित कारक हैया झिल्ली क्षतिग्रस्त है। इस कारण से हम सेल ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए तोड़ नहीं है, लेकिन हम एक फ्लैश अवधि और आवृत्ति है कि हमने पाया है समय के साथ सेल की प्रतिक्रिया नीचा दिखाना नहीं है का उपयोग करते हैं। यह तस्वीर विरंजन होती है अगर दोनों आवृत्ति और प्रकाश की तीव्रता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।

रिकॉर्डिंग के दौरान, एक बड़ी इलेक्ट्रोड टिप या इलेक्ट्रोड से बड़े आंदोलन जब झिल्ली मर्मज्ञ सेल नुकसान हो सकता है। केवल ठीक टिप्स (कम से कम 100 ~ MΩ) और छोटे आंदोलनों जब रिकॉर्डिंग के लिए एक सेल के करीब पहुंच इस्तेमाल किया जाना चाहिए। intracellular रिकॉर्डिंग इस तरह के मस्तिष्क रिकॉर्डिंग के रूप में अन्य अनुप्रयोगों के लिए लागू किया जाता है, तो बहुत ठीक, मजबूत इलेक्ट्रोड क्वार्ट्ज ग्लास का उपयोग कर निकाला जा सकता है, लेकिन एक विशेष खींचने इन इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। जब पहली बार एक इलेक्ट्रोड कार्यक्रम खींच कर रही है, हम इलेक्ट्रोड backfilling, एक नकली सेटअप में इलेक्ट्रोड धारक को इसे हासिल करने, और टिप और नमकीन घोल में जमीन इलेक्ट्रोड रखकर टिप प्रतिरोध की जाँच की। एनएक्सटेंशन हम आस्टसीलस्कप पर वोल्टेज में परिवर्तन को मापने के लिए एक मौजूदा आवेदन किया। इलेक्ट्रोड टिप हम एक मैनुअल micromanipulator कि दो कुल्हाड़ियों के साथ चलता है स्थानांतरित करने के लिए। अन्य manipulators डिजिटल वाले हैं कि सभी तीन कुल्हाड़ियों के साथ आंदोलन की अनुमति है और ये इस या अधिक जटिल अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सहित मौजूद हैं। वहाँ रिकॉर्डिंग के लिए एक मंच का निर्माण करने के लिए कई तरीके हैं, और वहाँ हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के कई अलग अलग प्रकार की रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल किया और मनाया डेटा का विश्लेषण कर रहे हैं। हमारे सेटअप रिकॉर्डिंग रिग में से एक, सरल, आसान और सस्ती सेटअप का प्रतिनिधित्व करता है।

VlogI वक्र के निर्माण में, कार्यों नाका और रशटन 33 और दूसरों साजिश रची प्रतिक्रियाओं की गैर रेखीय भागों के लिए 34,35 खाते से विकसित की है। विभिन्न तरीकों के आंकड़ों के इस वक्र फिट करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, और हम एक ऐसी विधि है कि वक्र ढाले सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है के परिणामों की साजिश रची है, हालांकि अन्य तरीकों में भी उपयुक्त हैं 36,37 ( 38,39 पुन: पेश करने का लक्ष्य है। एक कीट फोटोरिसेप्टर सेल में व्यक्त दृश्य वर्णक के absorbance स्पेक्ट्रम का एक और अधिक सटीक विचार ऐसे छानने पिगमेंट के रूप में खाते ommatidial गुण को ध्यान में रखकर से मॉडलिंग की जा सकती है, लेकिन इस अतिरिक्त शारीरिक और शारीरिक मापदंडों को 11,40 की माप की आवश्यकता है।

विधि की एक सीमा है कि अध्ययन जीव आंख में एक से अधिक आनुवंशिक रूप से समान opsin व्यक्त करता है, तो यह जो opsin mRNA संभावना फोटोरिसेप्टर सेल की जो वर्णक्रम वर्ग से मेल खाती है की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, इस विधि डाई इंजेक्शन के साथ और सीटू संकरण या immunohistochemistry सफलतापूर्वक opsins की पहचान करने में संयुक्त कर दिया गया है दर्ज की कोशिकाओं को 10 में व्यक्त किया।

हमारे विधि सरल और दृश्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ अपरिचित शोधकर्ताओं के लिए सुलभ है। इस तकनीक तंत्रिका विज्ञान में आम है, लेकिन विशिष्ट है और स्पष्ट तरीकों साहित्य में अनुपस्थित रहे हैं, इस विधि को पुन: पेश करने के लिए मुश्किल बना रही है। हालांकि इस तकनीक के कई रूपों में मौजूद है, हम यौगिक आंखों में वर्णक्रमीय संवेदनशीलता को मापने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करते हैं। शारीरिक डेटा दृश्य पारिस्थितिकी और विकास 41 की कहानियों में सबूत का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। Opsin अनुक्रम भिन्नता एक फोटोरिसेप्टर सेल की संवेदनशीलता के साथ मिलकर जुड़ा हुआ है, प्ररूपी बदलाव के लिए आनुवंशिक आधार की जांच के अध्ययन के लिए इस विधि आदर्श बना रही है। फोटोरिसेप्टर सेल संवेदनशीलता का माप भी व्यवहार रंग भेदभाव assays के साथ जोड़ा जा सकता है, रंग दृष्टि 42-46 में महत्वपूर्ण भेदभाव थ्रेसहोल्ड के लिए मनोवैज्ञानिक आधार को दर्शाता है। उदाहरण के लिए ड्रोसोफिला में आनुवंशिक या चिकित्सीय जोड़तोड़ में, इस टीechnique आंख या मस्तिष्क के रूप में अच्छी तरह से 47,48 के समुचित शारीरिक समारोह को मापने के लिए एक अच्छा तरीका हो सकता है। हालांकि हमारा पहला या आंखों में intracellular रिकॉर्डिंग की सबसे जटिल तरीका नहीं है, हमें उम्मीद है कि हम इस विधि को और अधिक आसानी से औपचारिक तंत्रिका विज्ञान के बाहर प्रजनन और अनुसंधान कार्यक्रमों में एकीकरण के लिए उपलब्ध कर सकते है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

हम प्रोत्साहन के लिए हमें ऋण देने के लिए उपकरण Cardan हाथ परिधि, किम्बर्ली जैमिसन, मैथ्यू मैकहेनरी, और राजू Metherate fabricating के लिए देर रूडी लिम्बर्ग धन्यवाद, और Almut Kelber और Kentaro Arikawa। यह काम एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप और KJM करने के लिए NSF अनुदान IOS-1,257,627 एडीबी द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butterfly pupae Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinder Any chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2 BioQuip 1208B2
100% Desert Mesquite Honey Trader Joe's Any honey or sucrose solution will work
Xenon Arc Lamp Oriel Instruments 66003 Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power Supply Oriel Instruments 68805 Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical Track Oriel Instruments 11190 Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x) Oriel Instruments 11641 Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x) Oriel Instruments 11647 Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 Newport Corporation TA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) Newport Corporation SP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) Newport Corporation VPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mm Newport Corporation LH-2
Fixed lens mount, 25.4 mm Newport Corporation LH-1
Condenser lens assembly Newport Corporation 60006
Convex silica lens, 50.8 mm Newport Corporation SPX055
Six Position Filter Wheel, x2 Newport Corporation FW1X6
Filter Wheel Mount Hub Newport Corporation FWM
Concave silica lens, 25.4 mm Newport Corporation SPC034
Collimator holder Newport Corporation 77612
Collimating beam probe Newport Corporation 77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule Newport Corporation 77670 This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable Oriel Instruments 78367 Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unit Uniblitz 100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD Newport FRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD Newport FRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD Newport FRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD Newport FRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD Newport FRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD Newport FRQ-ND50
LS-1-Cal lamp Ocean Optics LS-1-Cal
Spectrometer Ocean Optics USB-2000
SpectraSuite Software Ocean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm  Edmund Optics 67749
Interference bandpass filter, 310 nm  Edmund Optics 67752
Interference bandpass filter, 320 nm  Edmund Optics 67754
Interference bandpass filter, 330 nm  Edmund Optics 67756
Interference bandpass filter, 340 nm  Edmund Optics 65614
Interference bandpass filter, 350 nm  Edmund Optics 67757
Interference bandpass filter, 360 nm  Edmund Optics 67760
Interference bandpass filter, 370 nm  Edmund Optics 67761
Interference bandpass filter, 380 nm  Edmund Optics 67762
Interference bandpass filter, 390 nm  Edmund Optics 67763
Interference bandpass filter, 400 nm  Edmund Optics 65732
Interference bandpass filter, 410 nm  Edmund Optics 65619
Interference bandpass filter, 420 nm  Edmund Optics 65621
Interference bandpass filter, 430 nm  Edmund Optics 65622
Interference bandpass filter, 440 nm  Edmund Optics 67764
Interference bandpass filter, 450 nm  Edmund Optics 65625
Interference bandpass filter, 460 nm  Edmund Optics 67765
Interference bandpass filter, 470 nm  Edmund Optics 65629
Interference bandpass filter, 480 nm  Edmund Optics 65630
Interference bandpass filter, 492 nm  Edmund Optics 65633
Interference bandpass filter, 500 nm  Edmund Optics 65634
Interference bandpass filter, 510 nm  Edmund Optics 65637
Interference bandpass filter, 520 nm  Edmund Optics 65639
Interference bandpass filter, 532 nm  Edmund Optics 65640
Interference bandpass filter, 540 nm  Edmund Optics 65642
Interference bandpass filter, 550 nm  Edmund Optics 65644
Interference bandpass filter, 560 nm  Edmund Optics 67766
Interference bandpass filter, 570 nm  Edmund Optics 67767
Interference bandpass filter, 580 nm  Edmund Optics 65646
Interference bandpass filter, 589 nm  Edmund Optics 65647
Interference bandpass filter, 600 nm  Edmund Optics 65648
Interference bandpass filter, 610 nm  Edmund Optics 65649
Interference bandpass filter, 620 nm  Edmund Optics 65650
Interference bandpass filter, 632 nm  Edmund Optics 65651
Interference bandpass filter, 640 nm  Edmund Optics 65653
Interference bandpass filter, 650 nm  Edmund Optics 65655
Interference bandpass filter, 660 nm  Edmund Optics 67769
Interference bandpass filter, 671 nm  Edmund Optics 65657
Interference bandpass filter, 680 nm  Edmund Optics 67770
Interference bandpass filter, 690 nm  Edmund Optics 65659
Interference bandpass filter, 700 nm  Edmund Optics 67771
Faraday cage Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification Wild Heerbrugg Wild M5 Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy base McBain Instruments Any heavy base with arm will do
Cardan arm Custom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminator Dolan-Jenner MI-150 For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guide Dolan-Jenner EEG 2823 Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden table Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sand custom built, any box with sand
Manipulator Carl Zeiss - Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameter World Precision Instruments AGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstage Dagan Corporation IX2-700
Humbug Noise reducer Quest Scientific Humbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe EZ Digital os-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20 ADI instruments ML820
Labchart software ADI instruments Chart 5
10 MHz Pulse Generator BK Precision 4030
Glass pipette puller Sutter Instruments P-87
Borosillicate glass capillaries with filament World Precision Instruments 1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering Iron Weller
Platform with ball-and-socket magnetic base Hama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor blade Electron Microscopy Sciences 72004
Vaseline
Microsoft Excel Microsoft

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 108 neurophysiology intracellular रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कीट तितली opsin rhodopsin फोटोरिसेप्टर सेल यौगिक आंख रंग दृष्टि
से एक कीट मॉडल में फोटोरिसेप्टर सेल स्पेक्ट्रल संवेदनशीलता का निर्धारण<em&gt; Vivo</em&gt; Intracellular रिकॉर्डिंग
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McCulloch, K. J., Osorio, D.,… More

McCulloch, K. J., Osorio, D., Briscoe, A. D. Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings. J. Vis. Exp. (108), e53829, doi:10.3791/53829 (2016).

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